王曉珊 葛晨輝 康亞妮 王全華 徐晨曦

摘? 要： 利用生物信息學(xué)手段鑒定了76個(gè)具有典型R結(jié)構(gòu)的菠菜轉(zhuǎn)錄因子（Spinacia oleracea）MYB，其中包括72條R2R3-MYB基因（2R-MYB）和4條R1R2R3-MYB基因（3R-MYB）。通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)菠菜MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員的理化性質(zhì)、染色體定位、結(jié)構(gòu)域序列保守性和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：菠菜MYB家族有32個(gè)基因位于染色體正鏈，另外44個(gè)基因位于染色體反鏈;MYB的DNA結(jié)合域中的保守域主要位于兩個(gè)R重復(fù)序列的第二和第三螺旋之間，結(jié)合域中每個(gè)R重復(fù)的第一和第二色氨酸之間的氨基酸序列相對(duì)不保守;根據(jù)菠菜、擬南芥及甜菜的MYB家族系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系可以推測(cè)，菠菜MYB家族中56個(gè)成員可以按功能劃分為4類(lèi)，在菠菜的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可能起著重要的調(diào)節(jié)作用，其余成員中有7個(gè)MYB基因可能參與菠菜響應(yīng)氮素濃度的氮素利用及生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程。

關(guān)鍵詞： 菠菜（Spinacia oleracea）; 轉(zhuǎn)錄因子MYB; 氮素處理; 基因表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)： S 636.1? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? ? 文章編號(hào)： 1000-5137（2020）06-0677-15

Abstract： In this study，76 transcription factor genes within MYB gene family were identified.According to their structural characteristics，these MYB genes were divided into two categories，i.e.R2R3-MYB and R1R2R3-MYB.Based on the Prot Param，Soft Berry，MEGA7.0 and other online softwares were applied for bioinformatics analyses，such as physical and chemical properties，subcellular localization，and system evolution.According to their MYB conserved domain numbers，76 spinach （Spinacia oleracea） MYB genes were identified and divided into two subgroups，2R-MYB （72） and R1R2R3-MYB（4）.Chromosome mapping shows，spinachs MYB family has 32 genes in the chromosome chain，the other 44 genes are located in the reverse chain of chromosomes.Conservative domain analysis shows that，the conserved domains in the MYB DNA binding domain are mainly located between the second and third spirals of the two R repeats while the amino acid sequences between the first and second tryptophan repeats of each R in the DNA binding domain are relatively unconservative.The phylogenetic analysis indicated that spinach，Arabidopsis thaliana and beet MYB transcription factor proteins can be divided into thirty-five clusters.It was speculated that the 56 members，which can be functionally divided into 4 groups，of the spinach MYB family，plays an important regulatory role in the growth and development of spinach.The seven MYB genes from other members may be involved in the process of nitrogen utilization and development in response to nitrogen concentration in spinach.

Key words： spinach （Spinacia oleracea）; transcription factor MYB; nitrogen treatment; gene expression

0? 引? 言

MYB家族是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，普遍參與調(diào)控植物器官發(fā)育、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆境脅迫應(yīng)答及植物次生代謝等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程[1-2]。MYB家族蛋白質(zhì)的共同特征是都含有高度保守的DNA結(jié)合域，即位于這些蛋白質(zhì)的N端的MYB結(jié)構(gòu)域。每個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域包括1～4個(gè)連續(xù)的非冗余不完全重復(fù)序列（R1，R2，R3和R4）。每個(gè)重復(fù)包含大約50～53個(gè)氨基酸，形成3個(gè)α螺旋，在第二個(gè)和第三個(gè)α-螺旋之間形成一個(gè)“螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋”（HTH）結(jié)構(gòu)[3-4]。DNA結(jié)合區(qū)以外的氨基酸序列c-末端是一個(gè)激活結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度和序列極其不同，這就導(dǎo)致了MYB蛋白功能的多樣性[5-6]?；谶@些結(jié)構(gòu)的重復(fù)次數(shù)，MYB家族又可分為4個(gè)亞家族，分別為1R-MYB（MYB-相關(guān)），2R-MYB（R2R3-MYB），3R-MYB（R1R2R3-MYB）以及4R-MYB[7-8]。在植物中，R2R3-MYB是常見(jiàn)的亞家族[7，9-10]，并且這些蛋白質(zhì)幾乎涉及植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)方面和階段。例如參與擬南芥、玉米、毛竹、甜菜和菠蘿等植物中[7，11-16]的種子胚發(fā)育[17]、腋芽分生組織的形成[18-19]、花瓣的形態(tài)發(fā)生[20]、花藥外壁的形成[21]、雄性生殖細(xì)胞的分裂和分化[22]、雌配子體的發(fā)育、花粉管的誘導(dǎo)、絲狀器的形成[23]、對(duì)赤霉素和茉莉酸的響應(yīng)[24]、黃體酮的生物合成[25]以及次生壁的形成[26]等。研究表明：部分MYB轉(zhuǎn)錄因子還參與了植物氮代謝，例如擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子PAP2受低氮脅迫的誘導(dǎo)而高豐度表達(dá)，通過(guò)參與花青素代謝的過(guò)程，調(diào)控氮代謝的循環(huán)通路[27]。

菠菜（Spinacia olerancea）是重要的經(jīng)濟(jì)作物，也是常見(jiàn)的喜硝植物，硝態(tài)氮是植物生長(zhǎng)的主要氮素來(lái)源[28]。硝態(tài)氮也作為信號(hào)分子參與植物體內(nèi)許多生理代謝過(guò)程[29-30]，植物中碳氮比的變化是影響植株開(kāi)花及花芽的因素之一[31]。菠菜是雌雄異株植物，性型分化復(fù)雜，受環(huán)境因素調(diào)控明顯，目前關(guān)于硝態(tài)氮及碳氮比對(duì)菠菜性別分化的影響未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用生物信息學(xué)手段篩選、分析了菠菜MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族基因，及菠菜MYB轉(zhuǎn)錄因子在不同氮處理下的表達(dá)模式，為后續(xù)菠菜MYB基因參與氮代謝及性別分化的功能研究提供重要基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1 菠菜SoMYBs家族基因的檢索、鑒定與理化性質(zhì)分析

從擬南芥種質(zhì)信息數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.arabidopsis.org/）下載擬南芥MYB基因家族蛋白質(zhì)序列，從菠菜種質(zhì)信息數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.spinachbase.org/）下載菠菜MYB家族基因CDS和蛋白質(zhì)序列，從植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）下載MYB結(jié)構(gòu)域序列。以擬南芥MYB蛋白為探針在菠菜蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)BlastP搜索得到候選菠菜基因。在Expasy網(wǎng)站（https：//prosite.expasy.org）、Pfam網(wǎng)站（http：//pfam.xfam.org/）和、EBI網(wǎng)站（http：//www.ebi.ac.uk/）逐條鑒定這些候選菠菜基因的R結(jié)構(gòu)重復(fù)區(qū)，含有R重復(fù)區(qū)則記為MYB家族;若含有一個(gè)殘缺或完整的R結(jié)構(gòu)，則記為MYB-相關(guān)（MYB-related）家族。

在Expasy網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/protparam/）得到菠菜MYB基因家族的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及相對(duì)分子質(zhì)量。在菠菜種質(zhì)信息數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.spinachbase.org/）查找基因在染色體上的位置。在亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)網(wǎng)站（https：//wolfpsort.hgc.jp/）預(yù)測(cè)得出菠菜MYB基因的亞細(xì)胞定位。

1.2 保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析

為了探索R2R3-MYB蛋白DNA結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)，將所有含有R2R3重復(fù)的菠菜MYB家族基因（SoMYBs）通過(guò)MEGA（version 7.0）中的ClustalW進(jìn)行多重比對(duì)[32]。用WebLogo分析R2R3-SoMYBs保守結(jié)構(gòu)域中相應(yīng)位置的氨基酸殘基分布[33]。以上各軟件參數(shù)均為默認(rèn)參數(shù)。

為了進(jìn)一步分析基因結(jié)構(gòu)，用TBtools分析了R2R3-MYBs外顯子和內(nèi)含子、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及蛋白保守基序。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析和功能預(yù)測(cè)

為了探索菠菜MYB家族基因（SoMYBs）與擬南芥MYB家族基因（AtMYBs）、甜菜MYB家族基因（BvMYBs）的進(jìn)化關(guān)系，進(jìn)而更好地預(yù)測(cè)菠菜MYBs的功能，用ClustalW軟件將這些氨基酸全序列進(jìn)行比對(duì)（76SoMYBs，168AtMYBs和68BvMYBs）后繪制鄰接進(jìn)化樹(shù)（NJ tree），參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。

1.4 表達(dá)模式分析

供氮處理的實(shí)驗(yàn)材料SP75為本實(shí)驗(yàn)的自交系材料。將種子浸種1 d后，播于72孔育苗穴盤(pán)中，培養(yǎng)基質(zhì)為草炭土與珍珠巖等比例混合。置于溫室培養(yǎng)，條件為光照10 h，黑暗14 h，溫度20 ℃，濕度70%。21 d后移栽至大花盆中，培養(yǎng)條件不變。7 d后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的菠菜幼苗，進(jìn)行不同硝態(tài)氮濃度的供氮處理。設(shè)置4個(gè)濃度梯度的營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行澆灌，營(yíng)養(yǎng)液中氮（NO3-）的物質(zhì)的量濃度分別為0（無(wú)），0.294（低氮），5.880（中氮），11.760（高氮）mmol?L-1。處理7 d后收集第3對(duì)功能葉，使用Trizol法提取菠菜總核糖核酸（RNA），并使用NanoDrop? OneC分析RNA的濃度與質(zhì)量。通過(guò)PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）模板。使用Primer-BLAST（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。使用TB Green? Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）試劑盒在ABI7500上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）。采用So18s rRNA作為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、作圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1 菠菜SoMYBs鑒定、定位及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)綜合比對(duì)，在菠菜中共鑒定出了76條具有R重復(fù)區(qū)的MYB家族基因，其中包括72條R2R3-MYB基因（2R-MYB）和4條R1R2R3-MYB基因（3R-MYB）。將2R-MYBs命名為SoMYB1-SoMYB72，3R-MYB命名為SoMYB73-SoMYB76。

菠菜SoMYBs基因的基因組核苷酸序列長(zhǎng)度最長(zhǎng)的是SoMYB75（14 134 bp），最短的是SoMYB66（735 bp）;CDS最長(zhǎng)SoMYB67（4 797 bp）的是，最短的是SoMYB57（687 bp），如表1所示。

菠菜MYB家族有32個(gè)基因位于染色體正鏈，另外44個(gè)基因位于染色體反鏈。除26條基因未準(zhǔn)確定位外，SoMYB19，SoMYB33，SoMYB42等8條基因定位于1號(hào)染色體;SoMYB1，SoMYB2，SoMYB6等9條基因定位于2號(hào)染色體;SoMYB3，SoMYB17，SoMYB29等7條基因定位于3號(hào)染色體;SoMYB4，SoMYB5，SoMYB21等7條基因定位于4號(hào)染色體;SoMYB14，SoMYB15，SoMYB18等9條基因定位于5號(hào)染色體;SoMYB11，SoMYB20，SoMYB26等10條基因定位于6號(hào)染色體。

菠菜MYB蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)、無(wú)規(guī)卷曲這4種結(jié)構(gòu)組成，且這4種結(jié)構(gòu)的比例均不相同。普遍來(lái)看，α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲的比例高于β-轉(zhuǎn)角和擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)，無(wú)規(guī)卷曲的比例通常最高，但也有例外，如SoMYB4。

菠菜MYB蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)量最多的是SoMYB67（1 598 aa），最少的是SoMYB57（228 aa），蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量（MW）在最大的是SoMYB67（173 481.38 u），最小的是SoMYB57（25 731.36 u）;等電點(diǎn)（pI）最小為4.59（SoMYB23），最大為9.47（SoMYB54）。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，有54個(gè)SoMYBs僅在細(xì)胞核中表達(dá)，SoMYB71和SoMYB75定位在細(xì)胞核與葉綠體中，推測(cè)其余的SoMYBs基因在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均存在。

2.2 菠菜R2R3-MYB基因家族保守結(jié)構(gòu)域分析

為進(jìn)一步研究和鑒定R2R3-MYB蛋白同源結(jié)構(gòu)域的特征，通過(guò)R2和R3重復(fù)的氨基酸序列對(duì)R2R3-MYBs進(jìn)行了多序列比對(duì)和weblogo分析。結(jié)果如圖1所示，和其他物種相似，菠菜的R2R3-MYB均含有基本的R2重復(fù)和R3重復(fù)結(jié)構(gòu)，即[-W-（X19）-W-（X19）-W-]和[-F-（X18）-W-（X18）-W-]。結(jié)果顯示：R2重復(fù)有高度保守的色氨酸（Tryptophan，W）三聯(lián)結(jié)構(gòu)，分別位于第9，29和49位，這3個(gè)色氨酸被19個(gè)其他氨基酸隔開(kāi)。R3重復(fù)有類(lèi)似的保守結(jié)構(gòu)，但與R2不同，R3中的第1個(gè)保守色氨酸（第62位）主要被苯丙氨酸（Phenylalanine，F(xiàn)）取代，少量被異亮氨酸（Isoleucine，I）和亮氨酸（Leucine，L）所取代，其與第81，100位的色氨酸構(gòu)成保守的R3結(jié)構(gòu)，這3個(gè)氨基酸也直接被其他18個(gè)氨基酸間隔。除了這2個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)外，在R2重復(fù)中，第13位的谷氨酸（Glutamic acid，E）、第14位的天冬氨酸（Aspartic acid，D）、第17位的亮氨酸、第45位的半胱氨酸（Cysteine，C）和第48位的精氨酸（Arginine，R）也是比較保守的;在R3重復(fù)中，比較保守的是第66位的谷氨酸、第84位的異亮氨酸、第91位的精氨酸和第92位的蘇氨酸（Threonine，T）。MYB的DNA結(jié)合域中的保守域主要位于兩個(gè)R重復(fù)序列的第二和第三周之間（每個(gè)重復(fù)中HTH結(jié)構(gòu)域的第三螺旋），如圖1所示。然而，MYB的DNA結(jié)合域中每個(gè)R重復(fù)的第一和第二色氨酸之間的氨基酸序列相對(duì)不保守。

2.3 基于基因結(jié)構(gòu)的MYB轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEME網(wǎng)站（http：//meme-suite.org/）對(duì)菠菜和擬南芥的MYB蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析，共鑒定出10個(gè)保守基序。長(zhǎng)度為11～29，這些motifs的分布如圖2所示。每個(gè)MYB蛋白中的motif數(shù)量為2～7個(gè)，其中，motif5存在于所有76個(gè)菠菜MYB蛋白中，并且均不位于C末端;其次是motif1和motif3存在于69個(gè)蛋白中;motif2和motif4存在于68個(gè)蛋白中;motif6存在于60個(gè)蛋白中，并且均位于C末端;motif7存在于35個(gè)蛋白中，并且均位于N末端;motif8僅存在于SoMYB41，SoMYB66，SoMYB68，SoMYB69，SoMYB70這5個(gè)蛋白中;motif9僅存在于SoMYB66，SoMYB68，SoMYB69，SoMYB70，SoMYB72這5個(gè)蛋白中;motif10僅存在于SoMYB73，SoMYB74，SoMYB75，SoMYB76這4個(gè)蛋白中。

對(duì)SoMYBs進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)其成員的基因結(jié)構(gòu)存在顯著的差異性和多樣性，例如內(nèi)含子外顯子的相對(duì)位置和數(shù)量。SoMYB12，SoMYB37，SoMYB45和SoMYB66沒(méi)有內(nèi)含子，其余的SoMYBs所含有的內(nèi)含子數(shù)目為1～17個(gè)。根據(jù)預(yù)測(cè)的基因結(jié)構(gòu)來(lái)看，大部分的SoMYBs都含有2個(gè)或3個(gè)外顯子，其中16條含有2個(gè)外顯子，有45條含有3個(gè)外顯子。為了揭示MYB蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，用SoMYBs的氨基酸序列進(jìn)行了多序列比對(duì)，并且根據(jù)序列的相似性和系統(tǒng)進(jìn)化，將SoMYBs分成22個(gè)亞組（分別命名為S1～S22），并且每個(gè)亞組具有1～7個(gè)成員。同一亞組中最高度同源的成員通常共享相同或類(lèi)似的外顯子/內(nèi)含子模式，顯示出相似的數(shù)量、位置和外顯子長(zhǎng)度。例如，S21中的3個(gè)SoMYBs（SoMYB8，SoMYB15和SoMYB23）包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。在每個(gè)亞組的末端節(jié)點(diǎn)中能發(fā)現(xiàn)有高度同源性的一對(duì)或多對(duì)的SoMYBs，表明這些蛋白具有相似的功能。S10，S11是例外，其中外顯子和內(nèi)含子的位置和長(zhǎng)度顯著不同，成員間遺傳相似性低。

2.4 菠菜SoMYBs基因系統(tǒng)發(fā)育分析

在擬南芥中，MYB轉(zhuǎn)錄因子家族被分為27類(lèi)，且每一類(lèi)的功能均被注釋[7，34-36]。推測(cè)聚集在一起的同源蛋白具有相似的功能，表明同一類(lèi)中菠菜SoMYBs具有與AtMYBs相似的功能。因此，以擬南芥AtMYBs的功能注釋為參考，經(jīng)比對(duì)分析，可以預(yù)測(cè)菠菜SoMYBs的功能。以76個(gè)菠菜SoMYBs，67個(gè)甜菜BvMYBs和137個(gè)擬南芥AtMYBs氨基酸序列為對(duì)象，利用MEGA軟件構(gòu)建了基于NJ法的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)（圖3）。結(jié)果表明：這3種植物的MYB成員被聚為35個(gè)分支（分別命名為C1～C35）。其中，C1位于獨(dú)立的分支，僅包含1個(gè)甜菜和12個(gè)菠菜MYB，它們可能是莧科植物特有的MYB種類(lèi)，與擬南芥AtMYB88和AtMYB124所在分支較近;C9是菠菜特有的MYB類(lèi)型，而C12，C28，C30，C33類(lèi)中沒(méi)有菠菜的SoMYBs。

根據(jù)上述分析，共發(fā)現(xiàn)56個(gè)SoMYBs，隸屬于24個(gè)函數(shù)注釋類(lèi)，20個(gè)SoMYBs屬于7個(gè)函數(shù)未知類(lèi)。在此基礎(chǔ)上，將56個(gè)SoMYBs劃分為4個(gè)功能類(lèi)：I類(lèi)（C4，C17，C18，C19，C23和C32）通過(guò)調(diào)節(jié)木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的生物合成和沉積參與了次生壁的形成[7，34-36];II類(lèi)（C7，C8，C14，C20，C22，C24和C31）通過(guò)調(diào)節(jié)ABA途徑參與了對(duì)生物和非生物脅迫的反應(yīng)[7，34-36];III類(lèi)（C10，C13，C15，C16，C21，C27，C29，C34和C35）在根系、表皮細(xì)胞、花藥、營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和氣孔細(xì)胞發(fā)育及胚胎發(fā)生等器官發(fā)生和器官發(fā)生中起重要作用[7，34-36];IV類(lèi)，包括兩個(gè)類(lèi)群（C6和C29，C25和C27）參與調(diào)節(jié)次生代謝，如花青素和黃酮醇生物合成[7，34-36]。這些結(jié)果表明（表2）：菠菜SoMYBs具有廣泛的功能，可能在菠菜的生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要的作用。

2.5 菠菜C1，C9 SoMYBs基因響應(yīng)不同氮素條件的表達(dá)模式分析

由菠菜與擬南芥、甜菜的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以看出，C1類(lèi)型中只包括菠菜及甜菜的基因，C9類(lèi)型中只包括菠菜的基因。以菠菜SP73為材料，經(jīng)不同濃度硝態(tài)氮處理（無(wú)，低氮，中氮，高氮），取營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期葉片樣品，對(duì)其中基因（SoMYB39，SoMYB41，SoMYB66，SoMYB67，SoMYB68，SoMYB69和SoMYB70）進(jìn)行表達(dá)量分析（圖4），結(jié)果表明：這7個(gè)基因的表達(dá)水平均受硝態(tài)氮濃度變化的影響。其中，硝態(tài)氮的施加分別使SoMYB67，SoMYB68，SoMYB69和SoMYB70基因的相對(duì)表達(dá)量顯著下降，中濃度硝態(tài)氮能夠誘導(dǎo)SoMYB39和SoMYB66基因的表達(dá)，而低濃度和高濃度硝態(tài)氮均能誘導(dǎo)SoMYB41基因的高水平表達(dá)。

3? 討? 論

MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中較豐富的一類(lèi)，具有高度保守的MYB結(jié)構(gòu)域，可以參與多個(gè)調(diào)控過(guò)程。隨著越來(lái)越多植物基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的完成，許多植物的MYB轉(zhuǎn)錄因子家族被相繼鑒定出來(lái)。但是對(duì)菠菜MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的分析及單個(gè)基因的功能研究未見(jiàn)報(bào)道，因此對(duì)菠菜MYB 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行研究具有重要的意義。

本研究鑒定到76個(gè)具有典型R重復(fù)結(jié)構(gòu)的MYB基因家族，與甜菜（67個(gè)）相近。菠菜MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白性質(zhì)分析表明：在76個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白中，大部分成員屬于堿性蛋白，表明其能與酸性的核糖核苷酸相結(jié)合。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)：菠菜MYB蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)、無(wú)規(guī)卷曲這4種結(jié)構(gòu)組成，且α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲具有較大的占比，高于β-轉(zhuǎn)角和擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)，是MYB轉(zhuǎn)錄因子的主要二級(jí)元件。α-螺旋的結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，無(wú)規(guī)卷曲多位于蛋白表面，易于形成DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這種占比與MYB結(jié)構(gòu)域的螺旋-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)相符合，該結(jié)構(gòu)易與DNA的大溝發(fā)生特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)DNA轉(zhuǎn)錄，從而對(duì)基因表達(dá)起增強(qiáng)或抑制作用。

菠菜MYB轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)及保守基序分析表明：相同類(lèi)型的MYB 轉(zhuǎn)錄因子均聚類(lèi)在一起，分支相近的轉(zhuǎn)錄因子具有相似的結(jié)構(gòu)域及基序。由菠菜具有R結(jié)構(gòu)的MYB 轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥和甜菜MYB 轉(zhuǎn)錄因子共同構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)可知：不同物種間MYB轉(zhuǎn)錄因子具有較高的保守性;依據(jù)擬南芥的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)其聚在不同的亞組，與擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子處于同一亞組的菠菜MYB轉(zhuǎn)錄因子可能具有相似的功能，因此將56個(gè)SoMYBs劃分為4個(gè)功能類(lèi)。I類(lèi)通過(guò)調(diào)節(jié)木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的生物合成和沉積參與了次生壁的形成。Ⅱ類(lèi)通過(guò)調(diào)節(jié)ABA途徑參與了對(duì)生物和非生物脅迫的反應(yīng)。Ⅲ類(lèi)在根系、表皮細(xì)胞、花藥、營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和氣孔細(xì)胞發(fā)育及胚胎發(fā)生等器官發(fā)生和器官發(fā)生中起重要作用。IV類(lèi)，包括兩個(gè)類(lèi)群參與調(diào)節(jié)次生代謝，如花青素和黃酮醇生物合成。另外的20個(gè)SoMYBs功能尚不清晰。在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)僅有菠菜和甜菜所處亞組的MYB轉(zhuǎn)錄因子可能具有獨(dú)立的功能。

對(duì)菠菜7個(gè)未預(yù)測(cè)功能的SoMYBs基因響應(yīng)不同硝態(tài)氮濃度的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果表明：SoMYB41基因能夠分別受低濃度和高濃度硝態(tài)氮誘導(dǎo)而高水平表達(dá);SoMYB39和SoMYB66基因的表達(dá)受濃度硝態(tài)氮誘導(dǎo);而SoMYB67，SoMYB68，SoMYB69和SoMYB70基因受硝態(tài)氮抑制表達(dá)。擬南芥氮素相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究表明[37-38]：包括MYB在內(nèi)的20余個(gè)轉(zhuǎn)錄因子能夠系統(tǒng)響應(yīng)根及地上部分的氮素濃度變化，它們通過(guò)影響相關(guān)酶的協(xié)同轉(zhuǎn)錄調(diào)控氮代謝。菠菜MYB在菠菜氮素利用中可能也起到重要的調(diào)控作用。

4? 結(jié)? 論

通過(guò)生物信息學(xué)的方法對(duì)菠菜MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員、理化性質(zhì)、基因分類(lèi)染色體定位、結(jié)構(gòu)域序列保守性和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析預(yù)測(cè)。結(jié)果表明：菠菜MYB家族成員在菠菜的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著廣泛且重要的調(diào)節(jié)作用，可能參與纖維素和半纖維素的生物合成和沉積，可能參與對(duì)生物和非生物脅迫的反應(yīng)以及在根系、表皮細(xì)胞、花藥及胚胎發(fā)生等器官發(fā)生中起重要作用。其中7個(gè)菠菜SoMYBs基因在不同硝態(tài)氮濃度下的表達(dá)模式不同，可能參與調(diào)控菠菜氮素利用及生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程。

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（責(zé)任編輯：顧浩然，包震宇）