裙帶菜中不同分子質(zhì)量巖藻多糖的理化成分和抗氧化性比較

于靚 劉婷婷 孟冬青 李倩倩 趙渝

摘? 要： 從中國山東威海海域采收裙帶菜（Undaria Pinnatifida）樣品，利用乙醇浸提法對樣品中的巖藻多糖粗品進行提取。采用透析的方法，制備分子質(zhì)量小于1×104 u的低分子質(zhì)量巖藻多糖分離物。測定了不同分子質(zhì)量巖藻多糖分離物的硫酸鹽、糖醛酸及其對1.1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、羥基自由基的清除能力。分析和比較了巖藻多糖粗提取物和分子質(zhì)量小于1×104 u的巖藻多糖的理化成分和抗氧化活性。分析結(jié)果表明：粗提物的硫酸鹽和糖醛酸含量略高于低分子質(zhì)量巖藻多糖，其中粗提物中硫酸鹽質(zhì)量分數(shù)高達36.50%。與巖藻多糖粗提物相比，低分子質(zhì)量巖藻多糖具有更高的一級和二級抗氧化能力。

關(guān)鍵詞： 裙帶菜; 巖藻多糖; 分子質(zhì)量; 抗氧化活性

中圖分類號： Q 539? ? 文獻標志碼： A? ? 文章編號： 1000-5137（2020）06-0692-06

Abstract： The ethanol extraction method was used to extract fucoidan from the sample of Undaria pinnatifida collected from sea of Weihai，Shandong province，China.The ethanol extraction method was used to extract fucoidan from the samples.Low molecular weight fucoidan isolates with molecular weight less than 1×104 u were prepared by dialysis method.The sulfates，uronic acids，and their scavenging abilities on 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） and on hydroxyl radicals of fucoidans with different molecular weight were determined respectively.The physical and chemical constituents and antioxidant activities of the fucoidan crude extracts and fucoidans with molecular weight less than 1×104 u were analyzed and compared.The results showed that the sulfate and uronic acid content of the crude extract was slightly higher than that of low molecular weight fucoidan，and the sulfate mass fraction of the crude extracts was as high as 36.50%.Compared with the crude extracts，the fucoidan of low molecular weight has higher primary and secondary antioxidant capacity.

Key words： Undaria pinnatifida; fucoidan; molecular weight; antioxidant activity

0? 引? 言

巖藻多糖是一種富含硫酸基的水溶性雜多糖[1]，可以從棕色海藻（如Undaria pinnatifida，Turbinaria conoide等）中獲得[2]。巖藻多糖是由巖藻糖、糖醛酸和硫酸鹽等組成的細胞壁多糖[3]。

近年來已報道了巖藻多糖具有抗增殖活性[4]，其中硫酸鹽被證明是重要的活性物質(zhì)[5]和關(guān)鍵因素[6]。巖藻依聚糖中的糖醛酸含量對巖藻多糖的抗凝活性起著重要作用[7]。同時，巖藻多糖具有多種潛在醫(yī)學(xué)價值[8]，例如抗氧化活性、抗腫瘤、抗炎和抗病毒?？寡趸钚允菐r藻多糖生物學(xué)特性的重要指標[9]。最近的研究表明：低分子質(zhì)量的巖藻多糖可能具有更好的抗氧化活性[10]。

本文作者報道了從山東威海裙帶菜（Undaria pinnatifida）中提取的巖藻多糖粗品（WHR）和透析獲得的分子質(zhì)量小于1×104 u的巖藻多糖分離物（WH-10）兩種的巖藻多糖樣品。比較了WH-R和WH-10的硫酸鹽含量、糖醛酸含量、一級和二級抗氧化能力。

1? 材料與方法

1.1 材? 料

新鮮裙帶菜，采摘自山東威海;化學(xué)試劑均為分析純。

實驗所用儀器為T6紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）;JA200SA電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）;TG1650-WS高速離心機（長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司）;10ND-冷凍干燥機（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;KQ5200DB超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 巖藻多糖的制備

將在山東威海采收的裙帶菜，用凈水沖洗，通過烘箱加熱，研磨干燥得到粉末狀樣品，室溫儲存。隨后，將研磨的裙帶菜粉末在70 ℃的熱水中浸泡過夜。離心后，加入質(zhì)量分數(shù)為2%的CaCl2粉末，在4 ℃下隔夜保存，將海藻酸鹽離心去除，得到濾液。在濾液中加入無水乙醇，離心回收乙醇沉淀的巖藻多糖。冷凍干燥，得到巖藻多糖粗提物粉末（WH-R）。4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

采用透析法獲得分子質(zhì)量小于1×104 u的巖藻多糖樣品。將1.5 g粗制巖藻多糖溶于50 mL水中。將溶液放入1×104 u透析袋中并在4 ℃下保持3 d。收集透析袋中的巖藻多糖溶液，冷凍干燥，得到分子質(zhì)量小于1×104 u的巖藻多糖粉末。

1.3 硫酸鹽含量的測定

將2 g明膠溶解在400 mL去離子水中以制備凝膠狀流體。

將2 g氯化鋇溶解在凝膠狀液體中以制備BaCl2明膠試劑。

使用硫酸鉀溶液構(gòu)建標準曲線。將硫酸鉀的質(zhì)量濃度配置為100 μg?mL-1。依次分別量取對照品溶液0，1.2，2.4，3.6，4.8，6.0，7.2，8.4，9.6 mL。分別加水至10 mL。取0.1 mL以上各濃度溶液到試管中，向其中加入1.9 mL質(zhì)量分數(shù)為3%的三氯乙酸（TCA）和0.5 mL的BaCl2明膠試劑。將反應(yīng)物渦旋并轉(zhuǎn)移到比色皿中，然后在360 nm（波段）下測量樣品的吸光度（OD）值。以吸光度值為縱坐標標目，以硫酸鹽質(zhì)量濃度為橫坐標標目，建立標準曲線。

兩種巖藻多糖樣品分別溶解在5 mL HCl中制備試樣。使樣品在90 ℃下水解2.5 h。取0.1 mL水解的樣品移液到15 mL離心管中，向其中加入1.9 mL質(zhì)量分數(shù)為3%的TCA和0.5 mL的BaCl2明膠試劑。將反應(yīng)混合物渦旋并轉(zhuǎn)移到比色皿中，然后在360 nm下測量巖藻多糖樣品的吸光度值。對照標準曲線得到巖藻多糖樣品的硫酸鹽質(zhì)量濃度。

1.4 糖醛酸含量的測定

依次分別量取對照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL。將試管放入冰水浴中冷卻，加入0.025 mol/L-1硼砂硫酸溶液5 mL。沸水浴加熱10 min，迅速冷卻后，加入0.2 mL咔唑-無水乙醇。繼續(xù)使用沸水浴加熱15 min。試管溫度冷卻至室溫后，在530 nm處檢測巖藻多糖樣品的吸光度值。以吸光度值為縱坐標標目，以糖醛酸質(zhì)量濃度為橫坐標標目，制得標準曲線。

將300 mg巖藻多糖樣品置于100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度。量取1 mL稀釋后的樣品溶液，置于100 mL量瓶中，再次加水稀釋至刻度，量取1 mL。加入物質(zhì)的量濃度為0.025 mol?L-1的硼砂硫酸溶液5 mL。沸水浴加熱10 min，迅速冷卻后，加入0.2 mL咔唑-無水乙醇。繼續(xù)使用沸水浴加熱15 min。待試管溫度冷卻至室溫后，在530 nm處檢測巖藻多糖樣品的吸光度值，重復(fù)3次。對照標準曲線測得巖藻多糖樣品糖醛酸的質(zhì)量濃度。

1.5 抗氧化性測定

1.5.1 1.1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）清除能力測定

取40 mg DPPH溶解在1 L乙醇溶液中制備DPPH工作液。分別配置質(zhì)量濃度為10，20，30，40，50 μg?mL-1的Trolox（維生素 E）溶液，各取3 mL不同質(zhì)量濃度的Trolox溶液與3 mL的DPPH工作液混合并渦旋，在室溫避光環(huán)境中反應(yīng)40 min。在517 nm處讀取吸光度值。以VE溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標標目，以清除率為縱坐標標目，制得Trolox標準曲線。

將2 mg樣品溶解在1 mL去離子水中分別制得巖藻多糖試樣。取3 mL巖藻多糖試樣與3 mL的DPPH工作液混合并渦旋，并且在室溫避光環(huán)境中反應(yīng)40 min。在517 nm處讀取其吸光度值，試樣的DPPH自由基清除率

其中，A0為空白對照的吸光度值;A1為試樣的吸光度值。

1.5.2 羥基自由基清除能力測定

反應(yīng)物包含巖藻多糖或藻酸鹽溶液（1 mg?mL-1，0.1 mL）、硫酸亞鐵（9 mmol?L-1，1 mL）、過氧化氫（質(zhì)量分數(shù)0.3%，1 mL）和水楊酸乙醇溶液（5 m mol?L-1，0.5 mL），然后在37 ℃下孵育30 min。在510 nm處測得巖藻多糖試樣的吸光度值，試樣的羥自由基清除率

其中，A0為空白對照的吸光度值;A1為巖藻多糖試樣的吸光度值;A2為多糖的本底吸光度值。

2? 結(jié)果與分析

2.1 硫酸鹽含量測定結(jié)果

用氯化鋇-明膠法測定了巖藻多糖中硫酸鹽質(zhì)量濃度的標準曲線，如圖1所示。

按照圖1的標準曲線對2種巖藻多糖樣品（WH-R，WH-10）中硫酸鹽的質(zhì)量分數(shù)進行了測試，結(jié)果如表1所示。

根據(jù)中國醫(yī)藥保健品進出口商會團體標準T/CCCMHPIE 1.42—2018《植物提取物-巖藻多糖》要求，硫酸鹽質(zhì)量分數(shù)應(yīng)大于15%。由表1可知，兩種巖藻多糖樣品的硫酸鹽質(zhì)量分數(shù)為25%～40%，均符合標準。低分子質(zhì)量巖藻多糖樣品中的硫酸鹽質(zhì)量分數(shù)小于巖藻多糖粗品的，可能的原因是純化過程中損失了較多的硫酸鹽，即硫酸基團多存在于高分子巖藻多糖中。因此，來自威海裙帶菜的高分子質(zhì)量巖藻多糖更適宜作為抗凝功能性產(chǎn)品進行開發(fā)和利用。

2.2 糖醛酸含量測定結(jié)果

用葡萄糖醛酸作為標準品測定了巖藻多糖中糖醛酸質(zhì)量濃度的標準曲線，如圖2所示。

按照圖2的標準曲線對2種巖藻多糖樣品（WH-R，WH-10）中糖醛酸的質(zhì)量分數(shù)進行了測定，結(jié)果如表1所示。

由表1可知：低分子質(zhì)量的巖藻多糖（WH-10）中糖醛酸含量較低。高分子質(zhì)量巖藻多糖（WH-R）更適用于降血脂功能性產(chǎn)品的開發(fā)和利用。

2.3 抗氧化性測定結(jié)果

2.3.1 DPPH清除能力測定

DPPH自由基清除法是一種省時、快速的抗氧化劑活性評估方法，常用于評估抗氧化劑分子清除自由基的潛力[11]。據(jù)文獻[12]報道：巖藻依聚糖的抗氧化能力來源于向2，2-二苯基-1-苦基肼基提供氫原子的能力，從而形成2，2-二苯基-1-苦基肼。建立Trolox標準曲線，如圖3所示。

對2種巖藻多糖樣品（WH-R，WH-10）的DPPH自由基清除率進行了測定，得到Trolox質(zhì)量濃度，結(jié)果如表2所示。

通過DPPH清除實驗研究了 WH-R，WH-10的一級抗氧化能力。由表2可知：WH-10的一級抗氧化能力高于巖藻多糖粗提物的。據(jù)文獻[12]報道：巖藻多糖對DPPH自由基的清除能力與所含硫酸鹽質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，但是依據(jù)之前的實驗結(jié)果，WH-10的硫酸鹽含量低于巖藻多糖粗提物，表明巖藻多糖的抗氧化能力可能和其含有的其他物質(zhì)相關(guān)，這一點有待進一步研究。

2.3.2 羥基自由基清除能力測定

通過對羥基自由基清除實驗研究了WH-R，WH-10的二級抗氧化活性。由表2可知：降低巖藻多糖的分子質(zhì)量可增強其對羥基自由基的清除能力，表明從威海裙帶菜中分離的低分子質(zhì)量巖藻多糖可作為有效的羥基自由基清除劑，并有可能被用作食品加工中的功能性成分。

3? 結(jié)? 論

利用中國山東威海海域采摘的裙帶菜樣品制備巖藻多糖粗提物和分子質(zhì)量小于1×104 u的低分子質(zhì)量巖藻多糖。對兩種不同分子質(zhì)量巖藻多糖的硫酸鹽含量、糖醛酸含量進行了分析，同時檢測了巖藻多糖樣品的抗氧化能力。結(jié)果表明：從中國山東威海地區(qū)裙帶菜提取的巖藻多糖粗品和低分子質(zhì)量巖藻多糖就理化成分和抗氧化能力而言有一定的差異。例如，巖藻多糖粗提物的硫酸鹽含量和糖醛酸含量高于分子質(zhì)量小于1×104 u的巖藻多糖分離物，因此高分子質(zhì)量巖藻多糖更適宜作為抗凝產(chǎn)品的開發(fā)原料。但低分子質(zhì)量巖藻多糖對DPPH自由基的清除能力以及對羥基自由基的清除能力略高于巖藻多糖粗品。這突出了從裙帶菜中分離的褐藻糖膠的潛力，可用作食品加工生產(chǎn)中的功能性成分。

參考文獻：

[1] LIU M，LIU Y，CAO M，et al.Antibacterial activity and mechanisms of depolymerized fucoidans isolated from Laminaria japonica [J].Carbohydrate Polymers，2017，172：294-305.

[2] QU Y，CAO Z，WANG W，et al.Monthly variations of fucoidan content and its composition in the farmed brown alga Saccharina sculpera （Laminariales，Phaeophyceae） [J].Journal of Applied Phycology，2019，31（4）：2623-2628.

[3] CHEN C H，SUE Y M，CHENG C Y，et al.Oligo-fucoidan prevents renal tubulointerstitial fibrosis by inhibiting the CD44 signal pathway [J].Scientific Reports，2017，7：40183.

[4] ASHAYERIZADEH O，DASTAR B，POURASHOURI P.Study of antioxidant and antibacterial activities of depolymerized fucoidans extracted from Sargassum tenerrimum [J].International Journal of Biological Macromolecules，2020，151：1259-1266.

[5] JIN W，REN L，LIU B，et al.Structural features of sulfated glucuronomannan oligosaccharides and their antioxidant activity [J].Marine Drugs，2018，16（9）：291.

[6] PARK H，PARK S，JEONG J，et al.Induction of p53-independent apoptosis and G1 cell cycle arrest by fucoidan in HCT116 human colorectal carcinoma cells [J].Marine Drugs，2017，15（6）：154.

[7] YUAN Y，MACQUARRIE D.Microwave assisted extraction of sulfated polysaccharides （fucoidan） from Ascophyllum nodosum and its antioxidant activity [J].Carbohydrate Polymers，2015，129：101-107.

[8] MAK W，HAMID N，LIU T，et al.Fucoidan from New Zealand Undaria pinnatifida：monthly variations and determination of antioxidant activities [J].Carbohydrate Polymers，2013，95（1）：606-614.

[9] REN D，WANG Q，YANG Y，et al.Hypolipidemic effects of fucoidan fractions from Saccharina sculpera （Laminariales，Phaeophyceae） [J].International Journal of Biological Macromolecules，2019，140：188-195.

[10] LU J，SHI K K，CHEN S，et al.Fucoidan Extracted from the New Zealand Undaria pinnatifida-physicochemical comparison against five other fucoidans：unique low molecular weight fraction bioactivity in breast cancer cell lines [J].Marine Drugs，2018，16（12）：461.

[11] LI G，LUO Z，YUAN F，et al.Combined process of high-pressure homogenization and hydrothermal extraction for the extraction of fucoidan with good antioxidant properties from Nemacystus decipients [J].Food and Bioproducts Processing，2017，106：35-42.

[12] WANG J，ZHANG Q，ZHANG Z，et al.Potential antioxidant and anticoagulant capacity of low molecular weight fucoidan fractions extracted from Laminaria japonica [J].International Journal of Biological Macromolecules，2010，46（1）：6-12.

（責(zé)任編輯：顧浩然，包震宇）