黎貴蕓 邊莉

癌癥的發(fā)生發(fā)展既是多基因參與、多階段逐漸形成所致，又是腫瘤細(xì)胞與其所處微環(huán)境的適應(yīng)性過程。腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）由細(xì)胞外基質(zhì)、血管、浸潤的炎癥細(xì)胞、多種相關(guān)的組織細(xì)胞和細(xì)胞因子、生長因子以及代謝物、微生物菌群等所形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)［1］，其為腫瘤細(xì)胞賴以生存的“土壤”，為腫瘤細(xì)胞生長、播散提供必要條件，在這片“土壤”中，巨噬細(xì)胞為關(guān)鍵的參與者。

巨噬細(xì)胞為固有免疫的重要組成部分和適應(yīng)性免疫啟動(dòng)的關(guān)鍵因子，不同組織中的巨噬細(xì)胞具有不同的功能，如小膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)元存活、脾紅髓巨噬細(xì)胞能夠去除衰老的紅細(xì)胞［2-3］。巨噬細(xì)胞可塑性極強(qiáng)，在特定的環(huán)境、不同的刺激因素下塑造出的特性、活化狀態(tài)、表型和功能各不相同，主要分為抵御細(xì)菌感染、激活免疫、抑制腫瘤發(fā)生的經(jīng)典活化型（M1）巨噬細(xì)胞，和化療耐藥、免疫抑制、促進(jìn)腫瘤發(fā)展的交替活化型（M2）巨噬細(xì)胞，M1和M2型為巨噬細(xì)胞活化的兩種極端表型［4］，也是傳統(tǒng)的巨噬細(xì)胞分型方式。但是大部分實(shí)驗(yàn)中活化的巨噬細(xì)胞并不完全隸屬于M1或M2，而是處于二者之間不斷轉(zhuǎn)化的狀態(tài)［5］，鑒于M1、M2的復(fù)雜性，為了標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)流程，有研究建議巨噬細(xì)胞的分型應(yīng)該包括3項(xiàng)原則：1）巨噬細(xì)胞的來源（人外周血單核細(xì)胞、小鼠骨髓、小鼠腹膜巨噬細(xì)胞等）；2）激活劑類型（M＜IL-4，interleukin-4＞，M＜Ig，immunoglobulins＞，M＜IL-10＞，M＜interferon-γ，IFN-γ＞，M＜lipopolysaccharide，LPS＞等）；3）巨噬細(xì)胞活化的標(biāo)記［6］。

1 巨噬細(xì)胞的起源與自行更新

巨噬細(xì)胞主要由骨髓中的造血干細(xì)胞（hemato?poietic stem cells，HSCs）分化產(chǎn)生或胚胎時(shí)期卵黃囊（yolksac，YS）中祖細(xì)胞衍生而來［7-8］。目前，公認(rèn)的研究確定巨噬細(xì)胞有3種不同的發(fā)育途徑：1）組織駐留巨噬細(xì)胞（tissue resident macrophage，TRMs）：這群細(xì)胞主要包括卵黃囊或胎肝祖細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞前體。胚胎巨噬細(xì)胞的起源分為兩個(gè)階段，在原腸胚早期（embryonic day 6.5-8.5，E6.5-8.5），從胚外中胚層的YS 出現(xiàn)第一種具有造血功能的前體細(xì)胞，啟動(dòng)早期造血功能，產(chǎn)生巨噬細(xì)胞及其他有核細(xì)胞，這一階段稱為早期造血階段；之后紅髓系祖細(xì)胞（erythromyeloid progenitor，EMP）在E8.5～E10.5 后遷移進(jìn)入胎肝（fetal liver，F(xiàn)L），并在FL里分化為包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞［9］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞為胚胎巨噬細(xì)胞的典型代表，穩(wěn)態(tài)條件下通過局部增殖實(shí)現(xiàn)自行更新并持續(xù)到成年期［10］；2）造血干細(xì)胞HSCs 來源的巨噬細(xì)胞：真皮、腸道、脾臟邊緣的胚胎巨噬細(xì)胞在出生后迅速被HSCs 的單核細(xì)胞取代，并依賴單核細(xì)胞募集替代更新［11-13］；3）混合來源的巨噬細(xì)胞：有研究將CD45.1；Myb+/+小鼠的骨髓細(xì)胞移植到CD45.2；Myb-/-小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)受體小鼠外周組織巨噬細(xì)胞表達(dá)CD45.1，而肺、脾、腎中混有表達(dá)CD45.1 和CD45.2 的巨噬細(xì)胞，表明這些組織中的巨噬細(xì)胞群既有組織駐留的巨噬細(xì)胞，又有造血干細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞［14］。

2 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞

浸潤到腫瘤中的巨噬細(xì)胞稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophages，TAMs），與正常的巨噬細(xì)胞相比，TAMs 為一種傾向于免疫抑制表型、分化不完全的巨噬細(xì)胞。新近研究表明，在腫瘤中胚胎來源的巨噬細(xì)胞與單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞可能具有不同的表型和功能［15-17］，通常認(rèn)為TAMs 主要源自循環(huán)單核細(xì)胞，但肺癌和胰腺癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)高達(dá)50%的巨噬細(xì)胞為組織常駐巨噬細(xì)胞，在上述腫瘤中，HSCs 起源的TAMs 參與免疫抑制和抗原呈遞，胚胎衍生的TAMs 負(fù)責(zé)組織重塑和傷口愈合。腫瘤微環(huán)境中的各類細(xì)胞因子對巨噬細(xì)胞的募集極其重要，CCL-2/CCR2、CCL-5/CCR5 等趨化因子軸可募集血液中的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞到腫瘤區(qū)域，腫瘤細(xì)胞分泌的IL-10、巨噬細(xì)胞集落因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）等也可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向腫瘤部位遷移，另外，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）、透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）等也參與巨噬細(xì)胞的招募與轉(zhuǎn)運(yùn)［18］。癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞之間的互作通過多種細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞招募大量的巨噬細(xì)胞到腫瘤部位，而TAMs又反過來分泌多種細(xì)胞因子維持腫瘤細(xì)胞增殖、重塑細(xì)胞外基質(zhì)、誘導(dǎo)血管和淋巴管新生，為腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移提供條件［19］。TAMs 通過表達(dá)分泌不同的調(diào)節(jié)分子如內(nèi)皮細(xì)胞酪氨酸激酶-2（tyrosine kinase-2，Tie2），集落刺激因子-1（colony stimulating factor-1，CSF-1）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）構(gòu)成腫瘤轉(zhuǎn)移微環(huán)境來加速腫瘤細(xì)胞活化、腫瘤血管再生、腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［20-22］。

3 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中PD-L1的調(diào)節(jié)機(jī)制及其在腫瘤中的作用

程序性死亡受體-1配體（programmed death receptor-1 ligand，PD-L1）也稱為B7-H1或CD274，屬于B7家族的細(xì)胞表面糖蛋白。在生理?xiàng)l件下，組織細(xì)胞表達(dá)的PD-L1 與淋巴細(xì)胞表面的程序性死亡受體-1（pro?grammed death receptor-1，PD-1）結(jié)合使機(jī)體免受過度炎癥反應(yīng)造成的損害，同時(shí)也在自身免疫耐受及防治自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用［23］。當(dāng)腫瘤發(fā)生時(shí)，高表達(dá)PD-L1的腫瘤細(xì)胞，抑制淋巴細(xì)胞的功能及細(xì)胞因子的釋放，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，從而抵抗淋巴細(xì)胞的殺傷作用，發(fā)生腫瘤免疫逃逸［24］。

PD-L1 介導(dǎo)的免疫抑制還受蛋白質(zhì)糖基化和泛素化的廣泛調(diào)控，多數(shù)細(xì)胞表達(dá)的PD-L1 具有高度糖基化的模式［25］，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)可檢測到33 kDa 的非糖基化PD-L1和45～55 kDa糖基化PD-L1，PD-L1蛋白胞外結(jié)構(gòu)域T180 和S184 區(qū)域有糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）的磷酸化基序，非糖基化的PD-L1 在GSK3β 磷酸化作用后會(huì)被泛素/蛋白酶體系統(tǒng)降解［26］。PD-L1除了通過增加自身糖基化水平穩(wěn)定自身蛋白外，還可以通過降低自身泛素化水平延長蛋白半衰期，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）觸發(fā)核因子κB（nuclear factor κappa-B，NFκB）途徑，誘導(dǎo)癌細(xì)胞表達(dá)去泛素化酶，抑制PD-L1的泛素化降解，從而增強(qiáng)PD-L1/PD-1相互作用以避開T 細(xì)胞免疫監(jiān)視［25］。趨化素樣因子MARVEL 跨膜結(jié)構(gòu)域超家族-6（chemokine-like factor MARVEL transmembrane domain containing 6，CMTM6）蛋白可阻止PD-L1 與E3 泛素連接酶（STIP1 homology and U-box containing protein 1，STUB1）產(chǎn)生泛素化來延長PD-L1 蛋白的半衰期，小鼠黑色素瘤模型中敲除CMTM6 會(huì)下調(diào)PD-L1 表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤特異性T 細(xì)胞活性［27-28］。除了腫瘤細(xì)胞，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞也可高表達(dá)PD-L1，并通過不同的機(jī)制介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)。

高表達(dá)PD-L1 的TAMs 介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)主要通過與CD8+T 淋巴細(xì)胞上的PD-1 受體結(jié)合，募集并激活磷酸酶SHP2，引起下游蛋白激酶Syk 和PI3K 的去磷酸化，進(jìn)而下調(diào)mTOR、AKT 和ERK2 等通路的信號，抑制效應(yīng)T細(xì)胞的增殖、存活及IFN-γ和TNF-α的分泌，發(fā)揮負(fù)向調(diào)控T 細(xì)胞活性的作用，并介導(dǎo)其發(fā)生凋亡，導(dǎo)致殺傷腫瘤的淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，削弱免疫系統(tǒng)的抗腫瘤效應(yīng)［29］。

3.1 TAMs表達(dá)PD-L1的調(diào)控機(jī)制

在巨噬細(xì)胞表達(dá)PD-L1的調(diào)節(jié)機(jī)制中，細(xì)胞因子、趨化因子的誘導(dǎo)和維持作用最重要，見圖1。有研究通過體外培養(yǎng)腹腔巨噬細(xì)胞，模擬富含巨噬細(xì)胞的腫瘤微環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)，活化T細(xì)胞分泌的INF-γ介導(dǎo)巨噬細(xì)胞高表達(dá)PD-L1，阻斷INF-γ后PD-L1的表達(dá)下調(diào)［30］。淋巴瘤細(xì)胞分泌的可溶性因子IL-27B（EBI3）激活Stat3途徑調(diào)控TAMs表達(dá)PD-L1，而TAMs衍生的IL-27p28與淋巴瘤衍生的IL-27形成異二聚體IL-27，也能夠參與調(diào)控PD-L1的表達(dá)［31］。腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞自分泌/旁分泌IL-10，激活A(yù)kt/PI3K信號通路，上調(diào)單核巨噬細(xì)胞表達(dá)PD-L1［32］。腫瘤細(xì)胞分泌的CSF-2可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌CXCL8，CXCL8進(jìn)而上調(diào)巨噬細(xì)胞表達(dá)PD-L1［33］。分泌性磷蛋白（secreted phosphoprotein 1，SSP1）也是調(diào)控TAMs中PD-L1表達(dá)的重要因子，抑制SPP1的表達(dá)，則下調(diào)M2 型巨噬細(xì)胞PD-L1、IL-10 和精氨酸酶-1（arginase-1，Arg-1）的表達(dá)［34］。巨噬細(xì)胞PD-L1的表達(dá)還可通過自身COX2/mPGES1/PGE2通路調(diào)節(jié)［35］。

圖1 腫瘤微環(huán)境中TAMs表達(dá)PD-L1的調(diào)控機(jī)制

巨噬細(xì)胞表達(dá)PD-L1除了受特定細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)外，還受內(nèi)源性致癌途徑的調(diào)控。有研究在白血病、肝細(xì)胞癌Tet-off 轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，抑制myc 基因表達(dá)，可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞PD-L1 蛋白水平降低，體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)myc通過與編碼PD-L1基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合而直接調(diào)控PD-L1 的基因表達(dá)［36］。自噬（autophagy）、缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）等在巨噬細(xì)胞表達(dá)PD-L1的調(diào)控作用中也發(fā)揮重要作用。腫瘤細(xì)胞釋放的自噬體TRAP 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)變，并通過TLR4-MyD88-p38-STAT3信號通路上調(diào)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞PD-L1 和IL-10 的表達(dá)，抑制T 細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤生長［37］。有研究通過染色質(zhì)免疫沉淀和熒光素酶報(bào)告基因檢測發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α 與PD-L1 近端啟動(dòng)子中的乏氧反應(yīng)元件HRE 直接結(jié)合，選擇性上調(diào)巨噬細(xì)胞PDL1 的表達(dá)，在缺氧條件下阻斷PD-L1 的表達(dá)可下調(diào)巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-6 和IL-10，阻斷巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的T細(xì)胞活化作用［38］。ROS則可通過轉(zhuǎn)錄因子NF-κB介導(dǎo)巨噬細(xì)胞上調(diào)PD-L1 的表達(dá)［39］。除此之外，有研究通過對非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）、腎細(xì)胞癌、黑色素瘤行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，程序性死亡受體-2配體（programmed death recep?tor-2 ligand，PD-L2）蛋白與PD-L1 蛋白存在明顯的位置相關(guān)性，并且與其他細(xì)胞因子上調(diào)PD-L1一致，PD-L2 也驅(qū)動(dòng)調(diào)節(jié)PD-L1 的表達(dá)［40］。而在BRCA1/P53缺失的乳腺癌小鼠模型中，紫杉醇治療可誘導(dǎo)體內(nèi)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表達(dá)PD-L1，導(dǎo)致出現(xiàn)免疫抑制性腫瘤微環(huán)境［39］。

3.2 PD-L1+的TAMs與腫瘤的關(guān)系

TAMs的存在通常與實(shí)體瘤的不良預(yù)后相關(guān)。有研究證實(shí)，TAMs表達(dá)PD-L1后腫瘤微環(huán)境處于免疫抑制狀態(tài)。腫瘤基質(zhì)細(xì)胞中的PD-L1表達(dá)為總體生存期的獨(dú)立預(yù)測因子。膽管細(xì)胞癌中，PD-L1陽性病例中巨噬細(xì)胞的數(shù)量顯著高于PD-L1陰性，并且PD-L1陽性的患者總生存期比PD-L1陰性的患者差［41］。在肝細(xì)胞癌中大量PD-L1+巨噬細(xì)胞的浸潤與患者總生存期（overall survival，OS）和無病生存期（disease frss survial，DFS）呈負(fù)相關(guān)，腫瘤周圍基質(zhì)中巨噬細(xì)胞的密度與腫瘤大小、腫瘤多樣性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)［42］。有研究在113例Ⅰ期NSCLC中發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞低表達(dá)PD-L1的患者5年OS為94%，顯著高于腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞高表達(dá)PD-L1的患者（OS為20%）［43］。

但PD-L1+的TAMs 與腫瘤的關(guān)系仍存爭議。肝細(xì)胞癌中PD-L1+巨噬細(xì)胞的浸潤密度與OS 和無復(fù)發(fā)生存期（relapse-free survival，RFS）呈正相關(guān)，PDL1+巨噬細(xì)胞浸潤的腫瘤中CD8+T 細(xì)胞密度顯著升高，免疫應(yīng)答相關(guān)基因IFNG、GZMB 和PRF1 表達(dá)也升高［44］，說明PD-L1+巨噬細(xì)胞在腫瘤中表現(xiàn)出免疫活化的狀態(tài)，對患者的預(yù)后具有保護(hù)作用。在原發(fā)性睪丸淋巴瘤中PD-L1+CD68+的巨噬細(xì)胞可作為獨(dú)立預(yù)后因素［45］。有研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1陽性的胃癌樣本中具有M2 樣表型（CD163+）的巨噬細(xì)胞的密度顯著高于PD-L1 陰性的樣本，其陽性表達(dá)密度雖與患者年齡、性別、腫瘤大小、Lauren分型和腫瘤分期等臨床參數(shù)無明顯相關(guān)性，但可作為一個(gè)潛在靶向治療的指標(biāo)［46］。研究證實(shí)，腫瘤中浸潤的PD-L1+巨噬細(xì)胞還與抗PD-L1 抗體的療效相關(guān)。有研究在近500 例NSCLC 中發(fā)現(xiàn)，80%的CD68+巨噬細(xì)胞表達(dá)PD-L1，在抗PD-1/PD-L1治療時(shí)，這部分患者有更長的OS［47］。

3.3 PD-L1免疫組織化學(xué)定量檢測標(biāo)準(zhǔn)

腫瘤中巨噬細(xì)胞PD-L1 免疫組織化學(xué)（immuno?histochemistry，IHC）染色評分與抗PD-1/PD-L1的療效相關(guān)，既往臨床研究表明，NSCLC中浸潤的巨噬細(xì)胞PDL1 IHC結(jié)果呈3分（陽性細(xì)胞%＜1%為0分，1%≤陽性細(xì)胞%＜5%為1分，5%≤陽性細(xì)胞%＜10%為2分，≥10%為3分）的患者對抗PD-L1抗體MPDL3280A治療反應(yīng)明顯，僅17%患者疾病進(jìn)展，而腫瘤細(xì)胞PD-L1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果呈3分的NSCLC患者中有38%患者疾病進(jìn)展惡化［48］。Powles等［49］在205例轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌的研究中也發(fā)現(xiàn)，患者對抗PD-L1抗體MPDL3280A的治療效果與腫瘤浸潤性巨噬細(xì)胞PD-L1的IHC評分相關(guān)，但與腫瘤細(xì)胞IHC評分無關(guān)。

目前，中性福爾馬林固定石蠟包埋組織（formalin fixation and paraffin embedding，F(xiàn)FPE）的PD-L1 IHC評分為確認(rèn)患者是否接受抗PD-1/PD-L1治療的唯一依據(jù)，但現(xiàn)階段采用的評分方法、取用的臨界值因PD-L1抗體克隆號、腫瘤類型和抗PD-1/PD-L1藥物的不同而不同。結(jié)合文獻(xiàn)及相關(guān)資料，現(xiàn)有詳細(xì)判讀細(xì)則的檢測抗體有Dako 22C3和VENTANA SP142、SP263，見表1。Dako 22C3檢測試劑盒僅對腫瘤細(xì)胞PD-L1染色進(jìn)行判讀，VENTANA SP142和SP263檢測試劑的判讀包含腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤免疫細(xì)胞PD-L1染色的判讀（表1數(shù)據(jù)來自下述官網(wǎng)：1）https：//www.agilent.com；2）http：//reagent-catalog.roche.com；3）http：//reagent-catalog.roche.com）。

表1 PD-L1免疫組織化學(xué)判讀

4 結(jié)語

TAMs 作為腫瘤微環(huán)境中重要的組成成分，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。在臨床研究中，巨噬細(xì)胞已成為當(dāng)前腫瘤治療的熱點(diǎn)，卻因其復(fù)雜的機(jī)制網(wǎng)絡(luò)，尚不能靈活運(yùn)用。PDL1+的巨噬細(xì)胞在臨床研究中尚存爭議，這可能與TAMs 表型不同有關(guān)。因此，通過分析不同起源、不同表型的TAMs在腫瘤中發(fā)揮的作用以及更新機(jī)制，為尋找抗腫瘤治療的精準(zhǔn)靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。