張 森，郭倩妤，湯德元，曾智勇，石遠(yuǎn)菊，葉 麗，楊 偉，廖少山

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

2019年4月，廣西省某羊場(chǎng)部分羊發(fā)病，發(fā)病羊表現(xiàn)為精神沉郁、食欲廢絕、喜歡獨(dú)處、角落埋頭站立、拉稀、大便出血、病程逐步發(fā)展為食欲廢絕，后期大便帶鮮血，衰弱死亡。為查明該養(yǎng)羊場(chǎng)發(fā)病原因，通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀觀察、病理剖檢、細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定、藥敏試驗(yàn)及支原體PCR檢測(cè)等方法對(duì)送檢的病羊進(jìn)行診斷，確診該發(fā)病羊?yàn)檠虍a(chǎn)氣莢膜梭菌、支原體與大腸桿菌混合感染，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 發(fā)病情況

廣西某羊場(chǎng)的羊存欄數(shù)超過(guò) 1 000只，圈養(yǎng)管理，2019 年 4 月2日出現(xiàn)個(gè)別圈羊有發(fā)病現(xiàn)象，發(fā)病特點(diǎn)為起病急、病程短、死亡率高，病程2～4 d。發(fā)病羊主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲減退、拉稀、大便帶血、體溫升高，并伴有咳嗽、流涕和嚴(yán)重喘氣、鼻腔流出大量白色泡沫，四肢無(wú)力，站立不穩(wěn)，突然倒地死亡。截止到4月4日共有46只羊發(fā)病，死亡39只，發(fā)病羊均表現(xiàn)出相同或相似的癥狀。

2 臨床癥狀

發(fā)病羊表現(xiàn)為精神沉郁，少食，進(jìn)而食欲廢絕，喜獨(dú)處，部分羊體溫升高(40.5～41.5 ℃)，呼吸困難且呈腹式呼吸，呼吸次數(shù)為55 次/min，咳嗽、流涕。聽診心臟有雜音、肺部有腸鳴音。病程后期發(fā)病羊角落埋頭站立，大便帶鮮血，全身肌肉顫抖，四肢無(wú)力，逐漸衰弱死亡，病程約2～4 d。該羊場(chǎng)第1個(gè)圈37只羊發(fā)病后全部死亡，第2個(gè)圈羊正在發(fā)病，初步懷疑為產(chǎn)氣莢膜梭菌及支原體混合感染。

3 剖檢病理變化

對(duì)2只病死羊進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)口鼻有白色泡沫；心臟腫大，心包有積液，內(nèi)有纖維素樣物；肺部有大理石樣病變；胸膜有纖維素樣滲出物；肝臟腫大充血；膽囊腫大；腎臟腫大且被膜出血；脾臟腫大，有壞死灶；瘤胃臌氣；腸系膜淋巴結(jié)腫大；十二指腸、大腸有出血點(diǎn)和大量的出血現(xiàn)象。

4 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)

4.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與形態(tài)觀察 無(wú)菌操作采集發(fā)病羊的血液、肝臟、肺臟、心臟和淋巴結(jié)等病料組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，劃線接種于血瓊脂培養(yǎng)基中，分別于37 ℃條件下需氧和厭氧培養(yǎng) 24～72 h觀察。結(jié)果在需氧血瓊脂培養(yǎng)基中長(zhǎng)出大量光滑、隆起、半透明、灰白色菌落；在厭氧血瓊脂培養(yǎng)基中出現(xiàn)表面光滑、半透明的菌落生長(zhǎng)，并出現(xiàn)溶血環(huán)，且有些菌落有雙溶血環(huán)。分別從需氧血瓊脂培養(yǎng)基、厭氧血瓊脂培養(yǎng)基中挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色及鏡檢，需氧血瓊脂培養(yǎng)基染色后視野內(nèi)有兩端鈍圓、革蘭陰性桿菌；厭氧血瓊脂培養(yǎng)基染色后可見視野內(nèi)有兩端鈍圓、革蘭陽(yáng)性大桿菌。

4.2 細(xì)菌的生化特性鑒定 根據(jù)細(xì)菌微量生化鑒定管說(shuō)明書進(jìn)行操作，從需氧血瓊脂培養(yǎng)基和厭氧血瓊脂培養(yǎng)基中挑取純化培養(yǎng)的菌落，接種于細(xì)菌微量生化鑒定管進(jìn)行生化特性鑒定。結(jié)果表明：需氧血瓊脂培養(yǎng)基中細(xì)菌對(duì)葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、木糖、甘露醇和山梨醇呈陽(yáng)性；硫化氫試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)呈陰性；靛基質(zhì)試驗(yàn)呈陽(yáng)性。厭氧血瓊脂培養(yǎng)基中細(xì)菌對(duì)葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖和果糖呈陽(yáng)性，且產(chǎn)酸產(chǎn)氣，對(duì)木糖、甘露醇和山梨醇呈陰性；在含鐵牛乳試驗(yàn)中出現(xiàn)“洶涌發(fā)酵”現(xiàn)象；硫化氫試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)呈陽(yáng)性；靛基質(zhì)試驗(yàn)呈陰性。結(jié)合細(xì)菌培養(yǎng)特性及生化試驗(yàn)結(jié)果，判斷分離菌為大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌。

4.3 藥敏試驗(yàn) 無(wú)菌操作從需氧血瓊脂培養(yǎng)基、厭氧血瓊脂培養(yǎng)基用接種環(huán)各挑取1個(gè)純化培養(yǎng)的菌落，分別接種于培養(yǎng)基中，涂勻，選用8種常用藥敏紙片貼在培養(yǎng)基中，分別于37 ℃下需氧和厭氧培養(yǎng)24～48 h后觀察結(jié)果，并測(cè)定抑菌圈直徑，判斷其藥敏性。

需氧血瓊脂培養(yǎng)基中細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果：多西環(huán)素、青霉素抑菌圈直徑<10 mm，屬低敏感；鏈霉素、環(huán)丙沙星抑菌圈直徑為12 mm，屬中度敏感；阿米卡星、土霉素抑菌圈直徑為18 mm，屬高度敏感；頭孢曲松和頭孢拉定的抑菌圈>20 mm，屬極敏感。

厭氧血瓊脂培養(yǎng)基中細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果：青霉素、卡那霉素的抑菌圈直徑<10 mm，屬低敏感；頭孢拉定的抑菌圈直徑為11 mm，屬中度敏感；頭孢曲松的抑菌圈為18 mm，屬高度敏感；土霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星抑菌圈>20 mm，屬極敏感。

4.4 支原體的 PCR 檢測(cè) 采集送檢發(fā)病羊的脾臟、肺臟、腎臟、腸系膜淋巴結(jié)等，分別選取病變較嚴(yán)重的部位混合研磨，用液氮反復(fù)凍融3次，再用勻漿器磨20 min后收集勻漿，12 000 r/min 離心 10 min，取上清液按支原體 PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書方法(購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司，MYCO20170703P)進(jìn)行支原體PCR檢測(cè)。PCR 反應(yīng)液 16 μL，TapDNA 聚合酶 2 μL，模板 DNA 2 μL，總體積 20 μL。反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取 5 μL PCR 產(chǎn)物于 1%的 1×TAE 瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)(110V，35 min)，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：檢測(cè)出602 bp條帶，與預(yù)期條帶相符，表明發(fā)病羊存在支原體感染。

5 結(jié)果

本次試驗(yàn)對(duì)發(fā)病羊組織樣品、血液、血清進(jìn)行了細(xì)菌培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)及支原體核酸檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)菌培養(yǎng)及生化試驗(yàn)檢出產(chǎn)氣莢膜梭菌及大腸桿菌感染，且支原體核酸檢測(cè)呈陽(yáng)性。說(shuō)明該養(yǎng)殖場(chǎng)羊只發(fā)生產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌及支原體混合感染。

6 防治

針對(duì)本羊場(chǎng)目前發(fā)病情況，首先應(yīng)將發(fā)病及疑似發(fā)病羊進(jìn)行隔離；對(duì)發(fā)病羊肌內(nèi)注射土霉素0.05～0.1 mL/(kg·bw)，2 次/d，連用3 d；同時(shí)使用ATP、葡萄糖注射液靜脈注射輔助治療；對(duì)所有健康羊立即接種羊三聯(lián)四防滅活苗及綿羊支原體氫氧化鋁疫苗；對(duì)圈舍及周圍水溝使用燒堿嚴(yán)格消毒；同時(shí)建議羊場(chǎng)合理搭配飼料，加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)，保障飼料的新鮮，嚴(yán)禁飼喂發(fā)霉變質(zhì)飼料，保證羊腸道正常菌群平衡，提高抵抗力和抗應(yīng)激能力;對(duì)病死羊及其污染物進(jìn)行無(wú)害化處理或深埋焚燒；若有妊娠母羊產(chǎn)仔，產(chǎn)前需加強(qiáng)免疫。

按照以上方法進(jìn)行處理，3 d后沒(méi)有新的死亡病例發(fā)生，7 d后該場(chǎng)羊只基本恢復(fù)正常，無(wú)明顯臨床癥狀羊出現(xiàn)。