吳秋麗 嵇元燁 董莉莉 沈曉霞 王志安 王忠華

摘?要：為了探究浙貝母（Fritillaria thunbergii）藥效成分積累量與生物堿合成相關(guān)基因表達水平之間的關(guān)系，該研究采用UPLC-MS、qPCR技術(shù)分別測定不同產(chǎn)地11個樣品中總生物堿（貝母素甲和貝母素乙之和）含量和3個參與生物堿合成途徑相關(guān)基因（HMGR、FPS和DXR）的表達量，同時運用生物統(tǒng)計學(xué)方法分析成熟期鱗莖生物堿含量與各基因表達量之間的相關(guān)性。結(jié)果表明：不同產(chǎn)地浙貝母成熟期鱗莖總生物堿含量存在顯著差異（P<0.05），為0.2105% ～ 0.4612%;HMGR和FPS基因在盛花期組織表達、盛花期至成熟期鱗莖表達變化趨勢同生物堿含量變化趨勢基本一致;DXR基因在成熟期鱗莖中表達量最高，盛花期組織表達、盛花期至成熟期鱗莖表達變化趨勢同生物堿含量變化趨勢大體不一致;HMGR、FPS基因表達量分別與貝母素甲、貝母素乙和總生物堿含量呈顯著或極顯著正相關(guān)性（P<0.05或P<0.01），以FPS基因表達量與生物堿含量相關(guān)系數(shù)為最高，相關(guān)系數(shù)分別為0.672，0.631，0.664，DXR基因與生物堿含量呈低度相關(guān)性。由此可以推斷，生物堿的積累受MVA途徑中HMGR、FPS基因協(xié)同調(diào)控或者修飾作用明顯，受MEP途徑中DXR基因調(diào)控作用不明顯。

關(guān)鍵詞：浙貝母， 生物堿含量， 生物堿合成相關(guān)基因， 基因表達， 相關(guān)性

中圖分類號：Q943.2

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2020）12-1755-09

Abstract：In order to explore the relationship between the accumulation of medicinal components and the expression level of alkaloid synthesis related genes in Fritillaria thunbergii， ultra high performance liquid chromatography mass spectrometry（UPLC-MS） and real-time quantitative PCR（qPCR） techniques were used to determine the total alkaloids （the sum of peimine and peiminine） and the expression level of three genes involved in alkaloid synthesis pathway （HMGR， FPS and DXR） in eleven samples from different producing areas. Meanwhile， biostatistics was used to analyze the correlation between the alkaloid content of mature bulbs and the expression of each gene. The results were as follows：There were significant differences in total alkaloid content of mature bulbs （P<0.05）， ranging from 0.2105% to 0.4612%; The variation trend of the expression of HMGR and FPS genes in the tissue of full-bloom stage and the bulbs from full-bloom stage to maturity stage was basically consistent with the variation trend of alkaloid content; The expression of DXR gene was the highest in mature bulbs， and the change trend of the tissue expression at the full-bloom stage and the bulb expression from the full-bloom stage to maturity stage was generally inconsistent with the change trend of alkaloid content; The expression levels of HMGR and FPS genes were significantly or extremely significantly positively correlated with peimine， peiminine and total alkaloid content， respectively （P<0.05 or P<0.01）， and the coefficients between FPS gene expression and alkaloid content were the highest， which were 0.672， 0.631， 0.664， respectively， meanwhile， the coefficients between DXR gene expression and alkaloid content were low. In summary， the data indicate the accumulation of alkaloids is significantly regulated or modified by HMGR and FPS genes in the MVA pathway， but not by DXR genes in the MEP pathway.

Key words：Fritillaria thunbergii， alkaloid content， alkaloid synthesis related genes， gene expression， correlation

浙貝母（Fritillaria thunbergii）系百合科、貝母屬中一種多年生草本植物，其成熟期干燥鱗莖供入藥所用，性寒，具有清熱潤肺、解毒散結(jié)之效用。因其原產(chǎn)于浙江寧波象山，主產(chǎn)地在浙江，且在浙江省的種植面積占全國總面積高達90%，故簡稱象貝，又稱浙貝（何琛曄等，2018）。目前，市場上的浙貝母藥材以人工栽培為主，浙江省產(chǎn)區(qū)主要集中在鄞州、開化等地，浙江省附近一帶也有種植，包括江蘇、安徽和福建等地（Cui et al.，2018）。以貝母素甲和貝母素乙為代表的甾體類生物堿是貝母屬植物中特有的一類次生代謝產(chǎn)物，也是浙貝母中特有的藥效成分。據(jù)研究表明，甾體類生物堿在祛痰鎮(zhèn)咳、降壓活血、鎮(zhèn)痛抗?jié)?、抗炎抗氧化、抗腫瘤等方面具有重要的藥用價值（Zha et al.，2010;Lee et al.，2015;Ruan et al.，2016;Tang et al.，2018;Chen et al.，2018）。

甾體類生物堿的前體物質(zhì)主要由植物萜類生物合成途徑中一個重要的中間產(chǎn)物異戊烯焦磷酸（IPP）經(jīng)一系列酶催化生成（Laule et al.，2003）。IPP為甲羥戊酸（MVA）途徑和2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸（MEP）途徑中間體，是參與甾體骨架合成的主要途徑，這條途徑參與浙貝母甾體類生物堿的合成（Cardenas et al.，2016;Zhao et al.，2018）。在MVA途徑中，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）是該途徑的第一限速酶，參與催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）生成甲羥戊酸這一不可逆反應(yīng)（Kim et al.， 2014）;法尼基焦磷酸合酶（FPS）是MVA途徑中的一個關(guān)鍵酶，其催化牦牛兒基焦磷酸（GPP）生成法尼基焦磷酸（FPP），F(xiàn)PP是植物體內(nèi)一個重要的中間代謝產(chǎn)物（Dhar et al.，2013）;1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（DXR）是MEP途徑中的重要限速酶。目前，國內(nèi)外對浙貝母甾體類生物堿的研究多集中于藥效成分含量的測定、提取純化工藝研究、藥化及藥理活性分析上，對甾體類生物堿的生物合成途徑及合成途徑中起關(guān)鍵作用的酶的研究報道較少。因此，浙貝母生物堿合成途徑的相關(guān)功能基因的進一步開發(fā)和利用受到了嚴重限制。

本研究對11個不同產(chǎn)地浙貝母盛花期莖、葉、鱗莖及成熟期鱗莖的生物堿（貝母素甲和貝母素乙）含量進行測定，分析不同產(chǎn)地浙貝母生物堿含量差異及HMGR、FPS和DXR基因表達量與生物堿積累量之間相關(guān)性，為后續(xù)完善浙貝母生物堿合成途徑提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為揭示浙貝母藥材質(zhì)量差異的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1 材料

植物材料：以11個不同產(chǎn)地的浙貝1號（浙貝母狹葉品種）盛花期3個組織部位（莖、葉和鱗莖）以及成熟期鱗莖為材料，于2018年3月中旬、5月中旬采自浙東寧波章水，浙南溫州甌海，浙西衢州開化和麗水蓮都，浙北杭州淳安、臨安昌化和余杭，浙中金華婺城和東陽，浙江省臨近省份江蘇南通和安徽六安。不同產(chǎn)地氣象和土壤類型基本情況見表1。將新鮮采集的一部分材料清洗干凈，切片，置于烘箱中低溫烘干至恒重，研磨成粉，過65目篩后用于生物堿含量測定;另一部分材料經(jīng)DEPC處理水洗滌并分裝，放入液氮中速凍后貯存于-80 ℃超低溫冰箱以用于后續(xù)基因表達量的測定。

儀器：ACQUITY UPLC系統(tǒng)（Waters，美國）;SYNAPT G2-Si質(zhì)譜儀（Waters，美國）;CFX96熒光定量PCR儀（Bio-RAD，美國）;SQP電子分析天平（Sartorius公司，德國）。試劑：氨水和乙腈為色譜純;標準品貝母素甲、乙購于上海源葉生物科技有限公司;PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 UPLC-MS測定不同產(chǎn)地浙貝母不同組織中生物堿含量

1.2.1.1 色譜及質(zhì)譜條件?色譜條件：采用ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，流動相為0.1%氨水（A）-0.1%乙腈（B）;梯度洗脫（0～1.0 min，30%A→30%A;1.0～5.5 min，30%A→5%A;5.5～5.8 min，5%A→30%A）;流速為0.2 mL·min-1;柱溫為30 ℃;樣品進樣量為2 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧正離子源（ESI+）檢測模式，貝母素甲、貝母素乙的離子質(zhì)荷比（m/z）分別為432.35和430.33;毛細管電壓為3.0 kV，錐孔電壓為4.0 V，離子源溫度為105 ℃，去溶劑化溫度為300 ℃，去溶劑化氣流為800 L·h-1，錐孔氣流為50 L·h-1。

1.2.1.2 標準曲線繪制?分別精密稱取對照品貝母素甲0.004 8 g，貝母素乙0.005 0 g，加甲醇稀釋至25 mL容量瓶中，再用甲醇稀釋成貝母素甲96、48、38.4、19.2、9.6 mg·L-1，貝母素乙100、50、40、20、10 mg·L-1的混合對照品溶液，搖勻后過0.22 μm微孔過濾器，備用。按“1.2.1.1”項色譜及質(zhì)譜條件對混合對照品溶液進行分析，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，建立線性回歸方程。

1.2.1.3 樣品生物堿含量的提取及測定?生物堿提取參照Luo et al.（2018）方法并將回流法改為搖床震蕩法（條件為溫度32 ℃;時間為12 h;轉(zhuǎn)速為120 r·min-1）。按“1.2.1.1”項色譜及質(zhì)譜條件對11個產(chǎn)地浙貝1號盛花期3個組織部位、成熟期鱗莖生物堿（貝母素甲和貝母素乙）含量進行測定，每個樣重復(fù)3次。

1.2.2 浙貝母總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄?按照Aidlab EASYspin Plus Complex Plant RNA Kit提取浙貝母莖、葉、鱗莖的總RNA。采用NanoDropTM 2000分光光度計（Thermo Fisher， USA）測定浙貝母不同組織部位總RNA濃度以及吸光度比值（A260/280和A260 /230），1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。采用Vazyme HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR 試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于-20 ℃保存。

1.2.3 熒光定量PCR?根據(jù)本課題組已克隆的浙貝母HMGR、FPS、DXR和β-Actin基因序列采用Primer Express 3.0 軟件設(shè)計并篩選出特異性、穩(wěn)定性、重復(fù)性好的引物用于熒光定量表達分析，篩選后的引物見表2（馮亞斌等，2016，2017a，b）。qPCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括：2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 10 μL、上下游引物各0.4 μL、模板cDNA 0.4 μL、ddH2O 8.8 μL。qPCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，重復(fù)40個循環(huán);PCR反應(yīng)之后從60 ℃逐漸升溫到95 ℃制作溶解曲線。以看家基因β-Actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔCT計算基因的表達量（Wu et al.，2015）。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析?采用SPSS Statistics 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，并使用Excel 2010繪制柱狀圖。

2?結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地對浙貝母盛花期及成熟期生物堿積累量的影響

采用UPLC-MS法測定11個產(chǎn)地浙貝1號盛花期3個組織（莖、葉和鱗莖）及成熟期鱗莖中生物堿（貝母素甲和貝母素乙）的含量，結(jié)果如圖1所示。在11個不同產(chǎn)地浙貝1號盛花期3個組織部位及成熟期鱗莖中均含生物堿，不同產(chǎn)地浙貝1號盛花期同一組織部位的總生物堿含量（貝母素甲與貝母素乙含量之和）存在顯著差異（P<0.05），莖中總生物堿含量最高的為章水，葉中總生物堿含量最高的為六安，鱗莖中總生物堿含量最高的為開化，而葉中總生物堿含量最低的為淳安，莖和鱗莖的總生物堿含量最低均為蓮都;不同產(chǎn)地各組織部位生物堿含量存在相同的趨勢，其中鱗莖中總生物堿含量最高，其次為莖，葉中總生物堿含量最低;在莖、葉和新鱗莖3個組織部位中，除甌海、開化和淳安莖外，貝母素乙的含量均高于貝母素甲，且此趨勢在葉中要明顯高于莖和鱗莖。

在11個產(chǎn)地浙貝1號成熟期新鱗莖中，總生物堿含量存在顯著差異（P<0.05），其中甌海、六安產(chǎn)地浙貝母生物堿含量較高，麗水、開化、昌化、南通、婺城、章水產(chǎn)地總生物含量稍低，淳安、余杭、東陽產(chǎn)地總生物堿含量處于最低水平;其貝母素甲的含量均高于貝母素乙;值得注意的是，甌海和蓮都產(chǎn)地成熟期新鱗莖生物堿含量高于盛花期新鱗莖，但其他9個產(chǎn)地卻呈現(xiàn)相反的趨勢。

2.2 不同產(chǎn)地對浙貝母盛花期及成熟期生物堿合成相關(guān)基因表達的影響

以11個產(chǎn)地浙貝1號盛花期的莖、葉、鱗莖及成熟期鱗莖為材料，采用實時熒光定量PCR方法檢測了HMGR、FPS和DXR基因在不同產(chǎn)地、不同組織部位、不同發(fā)育階段的表達差異水平，基因表達結(jié)果如圖2所示。HMGR、FPS和DXR基因在11個不同產(chǎn)地浙貝1號的盛花期3個組織部位及成熟期鱗莖中均有表達，HMGR和FPS基因表達趨勢大體相同，其中以盛花期鱗莖中表達量最高，其次成熟期鱗莖，葉和莖的表達量最低;DXR基因在成熟期鱗莖表達量最高，盛花期三個組織部位中的表達趨勢不同于HMGR、FPS基因;盛花期至成熟期HMGR、FPS和DXR基因表達變化存在顯著差異（P<0.05），其中，甌海產(chǎn)地HMGR、FPS基因表達量同時上調(diào)，蓮都產(chǎn)地HMGR基因上調(diào)，F(xiàn)PS基因下調(diào)，其他9個產(chǎn)地HMGR、FPS基因表達量同時下調(diào);除東陽產(chǎn)地外，其他產(chǎn)地DXR基因均上調(diào)。

同時，采用Pearson雙變量相關(guān)性法（Yong et al.，2016）對HMGR、FPS和DXR基因表達量進行相關(guān)性分析，HMGR與FPS基因呈顯著正相關(guān)性（P<0.05），DXR分別與HMGR、FPS基因呈低度正相關(guān)性（P>0.05）。

2.3 浙貝母生物堿合成相關(guān)基因表達量與生物堿積累量的關(guān)系

為進一步研究浙貝母生物堿合成相關(guān)基因表達量與生物堿積累量之間的關(guān)系，采用Pearson雙變量相關(guān)性法（Yong et al.，2016）對不同產(chǎn)地浙貝1號藥用部位成熟期鱗莖中HMGR、FPS和DXR基因表達量與生物堿含量進行相關(guān)性分析（表3）。貝母素甲、貝母素乙和總生物堿含量分別與HMGR、FPS基因表達量之間呈顯著或極顯著相關(guān)性，且FPS基因與生物堿含量相關(guān)性要高于HMGR基因;DXR基因與貝母素甲呈低度負相關(guān)性（P<0.05或P<0.01），與貝母素乙、總生物堿含量呈低度正相關(guān)性（P>0.05）。

3?討論與結(jié)論

產(chǎn)地環(huán)境是道地藥材形成的重要外在因素，會直接影響到道地藥材的生長發(fā)育及其有效成分的形成和積累（Zhang et al.， 2016）。目前，有效成分已成為道地藥材品質(zhì)評價的重要指標之一（謝彩香等，2016）。本研究發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地浙貝母盛花期不同組織部位生物堿含量均以鱗莖中最高，其次是莖，葉中最低，這表明浙貝母生物堿分布存在明顯的組織特異性，這與虎杖、人參、肉桂等中藥材藥效成分分布具有明顯的組織特性的結(jié)果相一致（于樹宏等，2006;李雁群和吳鴻，2018）。成熟期鱗莖的總生物堿含量均符合2015版《中國藥典》規(guī)定的標準（含量≥0.080%），而道地產(chǎn)區(qū)鄞州章水總生物堿含量處于11個產(chǎn)地的中下水平，這與獨活、丹參等中藥材研究結(jié)果不一致（李貝寧等，2011;胡太德等，2015）。這一方面可能是因為過高的生物堿含量對浙貝品質(zhì)具有不利影響，會使轉(zhuǎn)化為生物堿的初級代謝產(chǎn)物含量降低，另一方面也有可能是因為浙貝母藥材化學(xué)成分復(fù)雜，包括氨基酸、多糖、核苷酸、礦物質(zhì)等，生物堿并不是浙貝母唯一的有效成分，并不能準確判定其品質(zhì)優(yōu)劣，如金銀花、羌活等中藥質(zhì)量等級是由多種物質(zhì)的含量共同決定的（劉長河等，2016;蔣舜媛等，2016）。僅甌海、蓮都產(chǎn)地成熟期鱗莖生物堿含量高于盛花期鱗莖，這可能是由于浙貝母處于快速生長期（3月中旬至5月中旬）時，兩個產(chǎn)地平均氣溫顯著高于其他產(chǎn)地，這不利于鱗莖體積增大（黎開強等，2008; Paek & Murthy，2002）。

隨著分子生物學(xué)的深入發(fā)展，人們對藥材品質(zhì)的關(guān)注也著眼于藥效成分生物合成途徑及其相關(guān)酶基因的研究。李銳等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，卷葉貝母中FPS基因的表達水平與總生物堿含量的變化趨勢一致。本研究同樣也發(fā)現(xiàn)MVA途徑中的HMGR和FPS基因在盛花期組織表達、盛花期至成熟期鱗莖表達變化趨勢同生物堿含量變化趨勢基本一致，這表明HMGR、FPS基因上調(diào)或下調(diào)可能導(dǎo)致生物堿合成量的增加或減少。HMGR和FPS基因之間呈顯著正相關(guān)（P<0.05），表明HMGR、FPS基因可能以協(xié)同調(diào)控或者修飾的方式來調(diào)控浙貝母生物堿的合成;此外，盛花期至成熟期鱗莖僅蓮都產(chǎn)地HMGR、FPS基因表達量之間呈相反趨勢，這可能與生物堿代謝通路中其他酶基因協(xié)同調(diào)控、環(huán)境因素有關(guān)（Zhao et al.，2018）;MEP途徑中的DXR基因在成熟期鱗莖中的表達趨勢與HMGR、FPS基因相同，但在盛花期3個組織部位中的表達趨勢卻不同，盛花期至成熟期鱗莖DXR基因表達趨勢除東陽產(chǎn)地外，其他產(chǎn)地均上調(diào)，這與生物堿含量變化趨勢相反，這可能是由于DXR基因在生物堿合成通路中所起的作用并不關(guān)鍵所致。在本研究所涉及的3 個基因中，藥用部位成熟期鱗莖FPS基因表達量與生物堿含量的正相關(guān)性要高于HMGR基因，而DXR基因與生物堿含量呈低度相關(guān)性，這可能是由于MVA途徑是甾體類生物堿合成的主要途徑，處于MVA途徑的下游FPS基因?qū)ι飰A合成的調(diào)控能力比上游HMGR基因強，而MEP途徑通過中間產(chǎn)物IPP進入MVA途徑中，對生物堿合成的影響較?。↙aule et al.，2003; Eva et al.，2003; Zhao et al.，2018）。綜上所述，本研究初步確定不同環(huán)境生長的浙貝母藥用成分生物堿的積累受HMGR、FPS基因協(xié)同調(diào)控或者修飾作用明顯，受DXR基因調(diào)控作用不明顯，這為今后浙貝母生物堿合成關(guān)鍵酶基因和質(zhì)量差異分析的分子機制研究奠定基礎(chǔ)。

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