朱旗，董藝超，張璐，馬旭＊ ，夏紅飛＊

（1．國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所遺傳優(yōu)生中心，北京 100081；2．北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730）

早期胚胎停育，又稱稽留流產(chǎn)（missed abortion，MA），是孕早期胚胎停止發(fā)育或死亡、并滯留在宮腔內(nèi)未自然排出的一種特殊情況的自然流產(chǎn)［1］。既往研究表明，許多危險(xiǎn)因素參與了胚胎停育的發(fā)生，如胎兒的染色體異常，母體在孕早期受到物理、化學(xué)因素的不良影響，母體自身的健康狀況如感染、生殖器畸形、內(nèi)分泌失調(diào)、自身免疫疾病等。然而，該疾病的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確。

據(jù)報(bào)道，絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞出現(xiàn)異常，子宮內(nèi)環(huán)境改造不足可以引發(fā)妊娠早期終止［2］。絨毛膜是由滋養(yǎng)層和胚外中胚層構(gòu)成的膜，在胚胎植入過(guò)程中，滋養(yǎng)層細(xì)胞迅速增生并分化為內(nèi)層的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和外層的合體滋養(yǎng)細(xì)胞。滋養(yǎng)層細(xì)胞有節(jié)制地侵入母體子宮蛻膜，對(duì)母體子宮蛻膜進(jìn)行改造，以維持母胎界面的適度環(huán)境。妊娠早期，血管的生成和維持是胚胎發(fā)育以及胎盤(pán)形成的基礎(chǔ)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性生長(zhǎng)因子，可增加滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、侵襲能力，在調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入方面發(fā)揮重要作用［3－4］，已成為胚胎停育發(fā)病機(jī)制研究中的熱點(diǎn)。滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞角蛋白19（cytokeratin－19or keratin－19，CK19）以及波形蛋白（Vimentin）［5－6］，通過(guò)觀察這兩種蛋白的表達(dá)來(lái)研究MA胎盤(pán)中的滋養(yǎng)層細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞組成，了解胎盤(pán)細(xì)胞的變化。細(xì)胞凋亡是個(gè)體發(fā)育過(guò)程中由基因編碼的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程，對(duì)調(diào)控機(jī)體發(fā)育、維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著重要作用。本研究擬通過(guò)檢測(cè)MA患者胎盤(pán)絨毛的VEGF、CK19和Vimentin表達(dá)以及細(xì)胞凋亡情況，來(lái)探討MA絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞的病理學(xué)變化，為臨床上MA的篩選、診斷及治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選擇2011年12月至2013年12月于河北石家莊第六醫(yī)院門診就診的260例MA患者（孕周＜12周）作為研究對(duì)象，年齡19～46歲，孕8周前B超檢查提示胚胎發(fā)育良好，可見(jiàn)原始心管搏動(dòng)，孕8～12周經(jīng)臨床診斷為MA。選擇同期該院自愿行人工流產(chǎn)的正常早孕孕婦（孕周＜12周）作為對(duì)照組，共396例，年齡17～48歲，B超提示胚胎發(fā)育正常。

排除標(biāo)準(zhǔn)：服用緊急避孕藥物；生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、內(nèi)分泌、凝血功能異常；糖尿病、心血管疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、甲狀腺功能異常等其他全身性疾病病史；妊娠期疾病如高血壓、糖尿病等疾?。辉星捌诩霸衅诮佑|有毒有害物質(zhì)；自身或者其配偶染色體異常；不良生活習(xí)慣如抽煙、酗酒、吸毒等；母兒血型不合、多胎妊娠等。

所有樣本均在征得患者知情同意下進(jìn)行采集，其使用和處理均按國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所倫理委員會(huì)相關(guān)管理和監(jiān)督條例及標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，取得倫理委員會(huì)決議（2011第06號(hào)）同意。

取MA組及對(duì)照組患者的胎盤(pán)絨毛組織送至北京龍邁達(dá)科技公司制成組織陣列芯片，樣本按≤25歲、26～30歲、31～34歲、≥35歲年齡區(qū)間分組，每組隨機(jī)挑選10對(duì)（病例及對(duì)照）進(jìn)行分析。

二、方法

1．免疫組化：免疫組化采用二步法染色，VEGF、CK19及Vimentin鼠抗人單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Crutz公司，工作濃度1∶50。山羊抗小鼠IgG二抗（工作濃度1∶50）、DAB顯色試劑均購(gòu)自北京中杉金橋公司，染色步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，PBS代替一抗做陰性對(duì)照。使用H－score評(píng)分法對(duì)免疫組化陽(yáng)性信號(hào)進(jìn)行判定：H－score＝Σpi（i＋1），式中pi表示陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量占切片中所有細(xì)胞數(shù)量的百分?jǐn)?shù)，i代表著色強(qiáng)度［7］。每個(gè)樣本隨機(jī)挑選3個(gè)高倍視野（×400）進(jìn)行觀察，應(yīng)用ImageJ軟件中的IHC Profiler插件對(duì)每張圖片的陽(yáng)性信號(hào)進(jìn)行評(píng)分判定［8］，細(xì)胞內(nèi)呈深棕黃色計(jì)為3分，呈現(xiàn)棕黃色計(jì)為2分，呈現(xiàn)淡黃色計(jì)為1分，均無(wú)著色計(jì)為0分。H－score得分越高，反映陽(yáng)性結(jié)果表達(dá)量越高。

2．細(xì)胞凋亡檢測(cè)：采用Tunel檢測(cè)法，DeadEndTMColorimetric Apoptosis Detection System 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，實(shí)驗(yàn)流程嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟、無(wú)水乙醇水化的組織切片放到4%多聚甲醛中固定，用20μg／ml的蛋白酶K進(jìn)行透化處理，再次固定之后使用平衡緩沖液平衡，隨后用生物素化的核酸混合液在37℃下標(biāo)記60min，清洗之后用0．3%的 H2O2封閉，最后經(jīng)DAB顯色，至淡棕色背景為止。用高壓消毒過(guò)的水代替rTdT酶設(shè)置陰性對(duì)照，陽(yáng)性染色物胞核呈棕黃色。高倍鏡下隨機(jī)觀察3個(gè)視野（×400）計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，凋亡指數(shù)（apoptosis indexes，AI）＝陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Graphpad Prism 7．0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用ANOVA分析。P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞中VEGF表達(dá)水平比較

本研究檢測(cè)了MA組及對(duì)照組絨毛組織中VEGF的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MA組和對(duì)照組絨毛組織中均有VEGF表達(dá)，主要定位于滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及間質(zhì)細(xì)胞中（圖1）。對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，MA組絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞中VEGF表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（P＜0．01）?！?5歲、26～30歲、31～34歲、≥35歲年齡分組中MA組的VEGF表達(dá)量均低于對(duì)照組，其中≥35歲分組中MA組與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）（表1）。

圖1 VEGF在正常早孕絨毛和MA絨毛組織中的表達(dá)（免疫組化，×400）

表1 對(duì)照組和MA組絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞VEGF表達(dá)水平比較（n＝10）

二、CK19和Vimentin在對(duì)照組和MA組絨毛組織中的表達(dá)變化

CK19反映滋養(yǎng)層細(xì)胞分布情況，Vimentin反映絨毛間質(zhì)細(xì)胞的分布情況。本研究檢測(cè)了MA組及對(duì)照組中CK19和Vimentin的表達(dá)。結(jié)果顯示，MA組和對(duì)照組均可見(jiàn)CK19表達(dá)，主要分布于細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和合體滋養(yǎng)細(xì)胞中（圖2），且在MA組及對(duì)照組中的表達(dá)水平無(wú)顯著性差異（P＞0．05）（表2）；Vimentin在MA組及對(duì)照組中均有表達(dá)，主要位于間質(zhì)細(xì)胞中，滋養(yǎng)層細(xì)胞偶有弱陽(yáng)性表達(dá)（圖2），Vimentin在MA組中的表達(dá)水平略高于對(duì)照組，但兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）（表3）。

表2 對(duì)照組和MA組絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞CK19表達(dá)水平比較（n＝10）

表3 對(duì)照組和MA組絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞Vimentin表達(dá)水平比較（n＝10）

圖2 CK19和Vimentin在正常早孕絨毛和MA絨毛組織中的表達(dá)（免疫組化，×400）

三、MA患者絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡情況

為了了解MA患者及正常早孕絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡情況，本研究利用Tunel法檢測(cè)了兩組絨毛組織中的細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，對(duì)照組和MA組的絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞，包括合體滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞均可見(jiàn)細(xì)胞凋亡發(fā)生（圖3），MA組絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡指數(shù)顯著高于對(duì)照組（P＜0．001）（表4）。

表4 對(duì)照組和MA組絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡指數(shù)的比較

圖3 Tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡（×400）

討 論

一、胚胎停育胎盤(pán)絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞入侵情況

胎盤(pán)與母體相接觸的絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞是一種具有侵襲能力的內(nèi)皮細(xì)胞。VEGF作為一種特異性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)以及絨毛血管的形成，是調(diào)節(jié)胎盤(pán)血管生成和螺旋動(dòng)脈重塑的重要因子［9－10］。VEGF異常表達(dá)可引起胚胎種植、胎盤(pán)形成等障礙，是造成自發(fā)流產(chǎn)的重要原因［11］。本研究通過(guò)檢測(cè)MA患者絨毛及正常早孕絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞中VEGF的表達(dá)水平，分析MA絨毛組織及正常早孕絨毛組織中的滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入程度差異。結(jié)果顯示，MA滋養(yǎng)層細(xì)胞中的VEGF表達(dá)量相對(duì)較低，這與多項(xiàng)研究中自然流產(chǎn)胎盤(pán)組織的 VEGF表達(dá)水平較低這一結(jié)果［12－14］相一致，提示MA患者絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞VEGF的低表達(dá)與這一疾病的發(fā)生相關(guān)。由此推測(cè)，妊娠期滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)的VEGF特異性促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖及遷移，促進(jìn)了滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)子宮蛻膜的侵襲，而MA患者絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞的VEGF表達(dá)水平低下，導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖遷移能力異常，侵襲能力下降，對(duì)子宮內(nèi)膜和肌層的侵入程度不足，未能形成充足的胎盤(pán)血管以維持胚胎的供血，最終導(dǎo)致MA發(fā)生。

二、滋養(yǎng)層細(xì)胞和絨毛間質(zhì)細(xì)胞分布情況

細(xì)胞角蛋白Cytokeratin是一種發(fā)現(xiàn)于上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)的細(xì)胞骨架蛋白，起構(gòu)建細(xì)胞纖維骨架并進(jìn)一步參與細(xì)胞分化的作用［15］。CK19已經(jīng)成為一種常見(jiàn)的腫瘤檢測(cè)標(biāo)記物［16］，在腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)。CK19是否也在MA過(guò)程中特異性表達(dá)，尚未有明確報(bào)道。波形蛋白Vimentin是一種Ⅲ型中間絲蛋白，表達(dá)于間充質(zhì)細(xì)胞和部分外胚層細(xì)胞，在正常上皮細(xì)胞中不表達(dá)，是間葉組織來(lái)源細(xì)胞的標(biāo)記。上皮細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelial－mesenchymal transition，EMT）是有極性的上皮細(xì)胞向可以在細(xì)胞基質(zhì)間移動(dòng)的間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的一個(gè)可逆過(guò)程，細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移侵潤(rùn)途徑類似于EMT過(guò)程［17］。本研究顯示正常早孕絨毛組織及MA患者絨毛組織中均有CK19以及Vimentin的表達(dá)，CK19主要分布于滋養(yǎng)層細(xì)胞中，而Vimentin主要表達(dá)于絨毛間質(zhì)細(xì)胞中，MA組和對(duì)照組之間未見(jiàn)CK19及Vimentin的表達(dá)差異，提示MA發(fā)生過(guò)程中滋養(yǎng)層細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞分布沒(méi)有差異。這可能與早期妊娠中胎盤(pán)絨毛的侵襲轉(zhuǎn)移和融合這一動(dòng)態(tài)EMT過(guò)程有關(guān)，在滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的開(kāi)始會(huì)有一部分滋養(yǎng)層細(xì)胞丟失上皮細(xì)胞特征，轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞；而滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生融合時(shí)會(huì)分化出表現(xiàn)上皮細(xì)胞特性的新的合體滋養(yǎng)細(xì)胞，隨著細(xì)胞形態(tài)的動(dòng)態(tài)改變，CK19和Vimentin表達(dá)量也處于不穩(wěn)定的變化過(guò)程中，推測(cè)由此造成了本研究中未觀察到MA組和對(duì)照組間CK19和Vimentin表達(dá)量的顯著性差異。

三、胎盤(pán)細(xì)胞凋亡情況

正常妊娠存在一定程度的滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡，過(guò)度凋亡會(huì)影響細(xì)胞侵襲及血管新生，進(jìn)而影響胚胎植入和生長(zhǎng)并造成流產(chǎn)［18－19］。本研究顯示在 MA患者絨毛及正常早孕絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞中均存在細(xì)胞凋亡，說(shuō)明細(xì)胞凋亡參與妊娠胎盤(pán)絨毛的發(fā)育，調(diào)控胎盤(pán)絨毛組織結(jié)構(gòu)的改建，抑制絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)子宮的過(guò)度侵襲。對(duì)比兩組之間的凋亡指數(shù)，MA組絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡情況較對(duì)照組嚴(yán)重，提示滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡異常與MA的發(fā)生密切相關(guān)。這一結(jié)果與目前許多文獻(xiàn)報(bào)道相符，推測(cè)滋養(yǎng)層細(xì)胞大量凋亡導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖與凋亡平衡打破，使絨毛生長(zhǎng)受限、侵襲不足，從而阻礙孕卵發(fā)育，引發(fā) MA［20－22］。

綜上所述，本研究顯示VEGF在胎盤(pán)絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞中的低表達(dá)及絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡指數(shù)增加與MA發(fā)生密切相關(guān)，提示胎盤(pán)血管生成減少和滋養(yǎng)層細(xì)胞過(guò)度凋亡是造成MA的部分原因，為臨床上通過(guò)檢測(cè)患者絨毛組織的VEGF表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡情況，有針對(duì)性的對(duì)患者進(jìn)行監(jiān)護(hù)和治療，預(yù)防MA發(fā)生這一方案提供了一定的理論基礎(chǔ)。進(jìn)一步研究引起VEGF低表達(dá)及細(xì)胞凋亡異常的分子作用機(jī)制，有助于解釋MA發(fā)生的具體原因，進(jìn)而為預(yù)防和治療稽留流產(chǎn)找到解決方案。