陸麗峰 周雷升 韓明宏 陳鵬業(yè)(通信作者)

266400山東省青島市西海岸新區(qū)第二人民醫(yī)院，山東青島

乳腺癌是全世界女性最常見的惡性疾病之一。研究報(bào)道，2015年美國有234 190例新發(fā)病和40 730例死亡。作為一種異質(zhì)性疾病，乳腺癌根據(jù)其分子亞型分為不同類型，為確定適當(dāng)?shù)木C合治療和預(yù)后提供有效方法。以往對乳腺癌研究方面做出突出貢獻(xiàn)，包括早期檢測和更有效的治療方法，從而使乳腺癌患者死亡率顯著下降，也有效改善乳腺癌患者預(yù)后。然而，大多數(shù)患者預(yù)后仍然較差。因此，必須開發(fā)一種新的治療策略，以便于更有效治療乳腺癌。能量代謝的改變在癌細(xì)胞中很常見，并且被認(rèn)為是癌癥的標(biāo)志[1]。癌基因誘導(dǎo)的代謝重編程能促進(jìn)癌細(xì)胞生長和增殖。乳酸脫氫酶A(LDHA)是一種糖酵解酶，對癌癥能量代謝至關(guān)重要，在多種癌細(xì)胞中高表達(dá)，并與生存率低有關(guān)。抑制LDHA的表達(dá)能抑制癌細(xì)胞的增殖[2]。然而，LDHA在乳腺癌中的表達(dá)和功能尚不清楚。

資料與方法

主要材料：人正常乳腺細(xì)胞系(MCF-10A)、人乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231和HCC38)購置于美國ATCC公司。 Lipofectamine 2000、 si-LDHA、si-control、MTT粉、Transwell小室均購于美國Invitrogen公司。

qRT-PCR 檢測LDHA 的表達(dá)：用RNA 抽提試劑盒抽提MCF-10A、MDA-MB-231 和HCC38 三種細(xì)胞中的總RNA，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，存于-70℃。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系包括2×QuantiTect SYBR Green PCRMaster Mi×10 μL，10×miScript Universal Primer 2 μL，10×miScript Primer Assay 2 μL，Template cDNA 1 μ g，RNase-free water加至共20 μL。循環(huán)體系為：①Cycle 1：37℃15 min，3個(gè)循環(huán)；②Cycle 2：94℃5 s，55℃5 s，70℃5 s，40 個(gè)循環(huán)；③Cycle 3：4℃5 s，在CFX96 實(shí)時(shí)熒光PCR 系統(tǒng)上檢測。以β-actin 為內(nèi)參，所測定LDHA 的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCT法分析。

MTT實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，將si-LDHA 與si-control 質(zhì)粒按轉(zhuǎn)染說明分別轉(zhuǎn)染于MDA-MB-231細(xì)胞中。細(xì)胞分為si-LDHA組與si-control組。分別取上述兩組轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231 細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)至臨近飽和，每孔加滅菌MTT液(5 mg/mL)20 μL，孵育4 h 后取出，每孔中加入DMSO 150 μL，低速振蕩10 min，選擇570 nm波長在酶標(biāo)儀上測定各孔吸光值，記錄結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞培養(yǎng)與分組同MTT 實(shí)驗(yàn)。在transwell 小室中鋪加8 μL 稀釋好的基質(zhì)膠，過夜形成基質(zhì)膜。取100 μL 即含1×105個(gè)細(xì)胞/mL 的細(xì)胞稀釋液，接種于transwell 小室上層，下腔加500 μL含20%的FBS培養(yǎng)液后，置于37℃溫箱中孵育36 h，取出，用棉簽擦棄小室上層未遷移細(xì)胞，PBS液輕洗，4%多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色下層穿出細(xì)胞，PBS 液洗，倒置，晾干。光學(xué)顯微鏡下觀察并攝相，隨機(jī)選取4 個(gè)高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0 軟件處理；計(jì)量資料以(±s)表示，采用t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

人乳腺癌細(xì)胞中PDL1 表達(dá)水平檢測：qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，人乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231 和HCC38)中PDL1的表達(dá)水平(7.413±0.216 和6.025±0.157)與人正常乳腺細(xì)胞系(MCF-10A)的表達(dá)水平(0.866±0.074)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

敲低LDHA 對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響：MTT 結(jié)果顯示，在人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染si-LDHA組的OD值為(0.486±0.006)，與si-control 組的(0.715±0.014)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示在人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞干擾LDHA 后能抑制癌細(xì)胞的增殖。

敲低LDHA 對人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞侵襲的影響：Transwell 結(jié)果顯示，si-LDHA 組穿過基質(zhì)膠的人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞數(shù)量為(136±11)，與si-control 組的(214±18)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示在人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞干擾LDHA后能抑制癌細(xì)胞的侵襲。

討 論

正常增殖細(xì)胞通過線粒體中的氧化磷酸化產(chǎn)生ATP。相比之下，癌細(xì)胞依賴于有氧糖酵解，其中細(xì)胞攝取和代謝葡萄糖比正常組織更多，但使用較少葡萄糖進(jìn)行氧化磷酸化，即使在氧氣存在下也有利于糖酵解。然而，癌細(xì)胞中這種代謝轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制及其如何促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移仍然未知。LDHA 是一種催化丙酮酸和NADH 轉(zhuǎn)化為乳酸和NAD+的酶，在調(diào)節(jié)糖酵解中具有關(guān)鍵作用。癌細(xì)胞通常具有上調(diào)的LDHA，其促進(jìn)代謝轉(zhuǎn)換為有氧糖酵解并產(chǎn)生乳酸。一些研究表明LDHA 在腫瘤進(jìn)展中的作用。有研究報(bào)道指出，LDHA 的酪氨酸磷酸化通過調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞和含有失調(diào)的成纖維細(xì)胞生長因子受體1(FGFR1)的肺癌細(xì)胞中的NADH/NAD+氧化還原穩(wěn)態(tài)來促進(jìn)癌細(xì)胞代謝并增強(qiáng)腫瘤生長。LDHA 敲低減弱糖酵解并影響線粒體生理學(xué)功能，導(dǎo)致乳腺癌模型中腫瘤生長嚴(yán)重下降[3]。LDHA 的下調(diào)還抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞和鼠4T1 乳腺腫瘤細(xì)胞的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[4]。已知靶向LDHA 的下調(diào)可誘導(dǎo)活性氧(ROS)產(chǎn)生并抑制腫瘤進(jìn)展，并且這些可被抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸部分逆轉(zhuǎn)[5]。這些發(fā)現(xiàn)提供LDHA 在人類癌癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用的證據(jù)，因此可能是治療癌癥希望的靶標(biāo)。

LDHA 是丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的必需物質(zhì)，它優(yōu)先在癌細(xì)胞中表達(dá)，并與較低存活率相關(guān)。研究證明LDHA 對于癌癥起始細(xì)胞的存活和增殖至關(guān)重要。抑制LDHA對癌細(xì)胞(如乳腺癌和肝癌細(xì)胞)具有抗增殖作用[6]。LDHA 的表達(dá)減少能降低ATP 水平，并在淋巴瘤和胰腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。研究表明LDHA 是一種在多種腫瘤細(xì)胞代謝中起關(guān)鍵作用的酶。據(jù)報(bào)道，LDHA 與胃癌、腎細(xì)胞癌等癌癥的臨床病理特征和生存結(jié)果相關(guān)[7]。

為評估LDHA 在乳腺癌中表達(dá)與生物學(xué)功能，我們首先通過qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)LDHA 在人乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，然后通過轉(zhuǎn)染si-LDHA 干擾人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞中LDHA 的表達(dá)。通過MTT 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞中干擾LDHA 后，細(xì)胞增殖能力明顯減弱。Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞中干擾LDHA 后，細(xì)胞的侵襲能力亦明顯被抑制。目前，LDHA 在乳腺癌中的分子調(diào)控機(jī)制研究還處于起始階段，繼續(xù)深入LDHA 在乳腺癌中的研究，將為乳腺癌潛在治療靶點(diǎn)的挖掘提供新的思路。