陳鵬業(yè) 孫建偉 陸麗峰(通信作者)

266400山東省青島市西海岸新區(qū)第二人民醫(yī)院，山東青島

骨肉瘤是兒童和青少年中最常見的原發(fā)性骨腫瘤類型，常起源于長骨干骺端，占兒科患者所有惡性腫瘤的2.4%。以往骨肉瘤最常見的治療方法是截肢，近年來由于診斷方法和治療技術(shù)的廣泛進步，骨肉瘤患者5年生存率已達60%～70%。盡管許多骨肉瘤患者最初對化療有反應，但發(fā)生轉(zhuǎn)移或復發(fā)患者的生存結(jié)果極差。因此，迫切需要確定骨肉瘤發(fā)展和進展的分子機制，以優(yōu)化治療選擇。miRNA 是一類長度為21～23 個核苷酸的小RNA 分子，通過與相應mRNA 的3'非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合而負向調(diào)節(jié)其靶基因的表達。以往的研究報道，miRNAs可以作為致癌基因或腫瘤抑制因子骨肉瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[1]。有證據(jù)表明，miR-133b 在肌肉組織中特異性表達，在肌肉發(fā)育、心肌分化和心肌肥厚中起重要作用。研究還表明，miR-133b 在胃癌、結(jié)腸直腸癌、膀胱癌、前列腺癌和肺癌等多種癌癥中顯著下調(diào)[2]。miR-133b 靶向表皮生長因子受體(EGFR)，且外源高表達miR-133b能抑制前列腺癌細胞系中的細胞增殖、遷移和侵襲[3]。然而，miR-133b 在骨肉瘤的表達及臨床意義尚不清楚。

資料與方法

主要材料：人骨肉瘤MG-63 細胞，購置于美國ATCC 公司；Lipofectamine 2000、miR-133b mimics、scramble、MTT粉購于美國Invitrogen公司。

MTT 實驗：培養(yǎng)人骨肉瘤MG-63 細胞，將miR-133b mimics 與scramble 質(zhì)粒按轉(zhuǎn)染說明分別轉(zhuǎn)染于人骨肉瘤MG-63細胞中。細胞分為miR-133b mimics組與scramble組。分別取上述兩組轉(zhuǎn)染后的人骨肉瘤MG-63細胞接種于96孔板中，每組設(shè)5 個復孔，培養(yǎng)至臨近飽和，每孔加滅菌MTT 液(5 mg/mL)20 μL，孵育4 h后取出，每孔中加入DMSO 150 μL，低速振蕩10 min，選擇570 nm 波長在酶標儀上測定各孔吸光值，記錄結(jié)果，實驗重復3次。

凋亡實驗：采用AnnexinV-FITC/PI染色法檢測細胞凋亡。細胞分組與MTT實驗相同，收集各組培養(yǎng)至80%密度左右的細胞，用胰酶將細胞消化，再用預冷的PBS液洗滌細胞2次，取約1×106個細胞，加入300 μL 的1×Binding Buffer重懸細胞，再加5 μL AnnexinV-FITC 輕輕混勻，室溫避光孵育15 min 后，加入1 μL PI 混勻，再補 加200 μL的1×Binding Buffer后上機，流式細胞儀檢測。

統(tǒng)計學處理：數(shù)據(jù)應用SPSS 16.0 軟件處理；計數(shù)資料以[n(%)]表示，采用χ2檢驗；計量資料以(±s)表示，采用t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

外源高表達miR-133b 對人骨肉瘤MG-63 細胞增殖影響：MTT 實驗結(jié)果顯示，在人骨肉瘤MG-63 細胞中，miR-133b mimics 組OD 值為(0.451 ±0.008)，與scramble 組的(0.637±0.013)相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。提示在人骨肉瘤MG-63細胞高表達miR-133b能抑制癌細胞的增殖。

外源高表達miR-133b 對人骨肉瘤MG-63 細胞凋亡影響：凋亡實驗結(jié)果顯示，在人骨肉瘤MG-63 細胞中，miR-133b mimics 組細胞凋亡率為(14.68±0.41)%，與scramble組的(6.154±0.26)%相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。提示在人骨肉瘤MG-63 細胞高表達miR-133b能誘導癌細胞發(fā)生凋亡。

討 論

微小RNA(miRs)是在不同物種中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性短鏈非編碼RNA分子(含有約22個核苷酸)，其通過與mRNA的特定序列不完全互補而起到降解和翻譯抑制的作用。以這種方式，單個miRs可以調(diào)節(jié)大量獨立的靶基因并涉及多種生理和生物化學過程，包括多種細胞信號傳導和代謝途徑及基本細胞增殖、分化和凋亡。此外，異常miRs表達是一個重要生物學標志，包括癌癥在內(nèi)的多種疾病。一些miRs對疾病進展具有重大影響，并且已被廣泛研究和證實。 例如miR-133b，miR-133b 屬于經(jīng)典肌肉特異性microRNAs 家族(miR-1、-133 和-206 s)，最初被認為是肌肉特導性，特別是在心臟和骨骼肌中高度富集，并且是肌肉發(fā)育和重塑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[4]。但是現(xiàn)在越來越多的研究表明，miR-133b 在各種人類癌癥中呈現(xiàn)異常表達，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

大量研究證實，miR-133b 在多種惡性腫瘤中表達下調(diào)，如尿路上皮癌、膀胱、胃癌等。這些研究表明，miR-133b的下調(diào)是獨立因素，與患者的侵襲性臨床病理特征、腫瘤亞型和較差的存活率顯著相關(guān)。 同樣有研究還顯示，miR-133b 的低表達與結(jié)直腸癌患者不良預后生存和轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)[5]。這些結(jié)果均表明這些miRNA 具有預測術(shù)后臨床結(jié)果的潛在價值。miR-1 和miR-133b 在復發(fā)的前列腺癌標本中顯著下調(diào)，可作為預測前列腺癌進展的新型生物標志物[6]。血清和分泌物是另一個重要臨床標本，循環(huán)血清miR-133b可被確定為乳腺癌、胃癌中最重要的診斷和預后標志物。在前列腺癌患者的前列腺分泌物中亦顯著下調(diào)，可作為診斷標志物[7]。

為評估m(xù)iR-133b對骨肉瘤細胞生長與凋亡影響，我們首先通過轉(zhuǎn)染miR-133b mimics 來外源高表達人骨肉瘤MG-63 細胞中miR-133b 的表達。通過MTT 實驗發(fā)現(xiàn)在人骨肉瘤MG-63 細胞中高表達miR-133b后，細胞增殖能力明顯減弱。凋亡實驗結(jié)果顯示在人骨肉瘤MG-63細胞中高表達miR-133b后，細胞凋亡率明顯增加。這些結(jié)果為miR-133b參與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的可能分子機制提供一個新的思路，miR-133b 也有望成為骨肉瘤患者的潛在治療靶點。