朱宏星 王道營(yíng) 徐為民 孫沖 葛慶豐 高田毅 黃楊

摘 要：以肌球蛋白為對(duì)象，研究血紅素輔基氧化修飾對(duì)肌球蛋白羰基、巰基、表面疏水性、溶解度、ATPase活力、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、內(nèi)源熒光、二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，并對(duì)血紅素輔基氧化修飾肌球蛋白進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。結(jié)果表明：在低濃度血紅素輔基氧化下，肌球蛋白的表面疏水性顯著降低（P<0.05）;高濃度血紅素輔基氧化下，肌球蛋白表面疏水性顯著增加（P<0.05），溶解度顯著降低（P<0.05）;血紅素輔基處理后，肌球蛋白總巰基和活性巰基含量顯著下降（P<0.05），Ca2+-ATP酶活力顯著降低（P<0.05）;肌球蛋白熒光強(qiáng)度降低、峰值藍(lán)移及α-螺旋相對(duì)含量下降，表明血紅素輔基對(duì)肌球蛋白的構(gòu)象產(chǎn)生影響;分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果證實(shí)血紅素輔基能與肌球蛋白結(jié)合，但高度氧化狀態(tài)下不利于維持肌球蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。綜上，血紅素輔基可以通過(guò)氧化修飾肌球蛋白，引起肌球蛋白結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而對(duì)肉品品質(zhì)造成影響。

關(guān)鍵詞：肌紅蛋白血紅素輔基;肌球蛋白;蛋白氧化;分子動(dòng)力學(xué)模擬;肉品品質(zhì)

Abstract： In this paper， the influence of oxidative modification of the hemin prosthetic group of myoglobin on the carbonyl and sulfhydryl groups， surface hydrophobicity， solubility， ATPase activity， sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） profile， endogenous fluorescence， and secondary structure of myosin. Meanwhile， molecular dynamics simulation was performed on myoglobin with oxidative modification of its hemin prosthetic group. The results showed that the surface hydrophobicity of myosin significantly decreased （P < 0.05） when the hemin prosthetic group was oxidized at low concentrations， but significantly increased （P < 0.05） at high concentrations， together with a significant reduction in the solubility （P < 0.05）. Hemin prosthetic group modification significantly decreased the contents of total and reactive sulfhydryl groups and Ca2+-ATPase activity of myosin （P < 0.05）. In addition， this treatment reduced the fluorescence intensity of myosin accompanied by a spectral blue shift and the proportion of α-helix indicating conformational changes in myosin. Molecular dynamics simulation revealed that the hemin prosthetic group could bind to myosin. However， its oxidation at high concentrations was detrimental to maintaining the stability of myosin. In a word， oxidative modification of the hemin prosthetic group could cause structural changes in myosin and consequently affect meat quality.

Keywords： hemin prosthetic group; myosin; protein oxidation; molecular dynamics simulation; meat quality

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201123-282

中圖分類(lèi)號(hào)：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2020）11-0001-08

肌球蛋白為鹽溶性蛋白，是肌原纖維蛋白的重要組成部分。肌球蛋白參與肉凝膠的形成過(guò)程，對(duì)肉制品的保水性具有重要影響[1]。肌球蛋白分子由2 條重鏈（myosin heavy chain，MHC）和4 條輕鏈（myosin light chain，MLC）組成，2 條MHC纏繞形成了桿狀尾部和2 個(gè)球狀頭部，形如“Y”狀[2]。肌球蛋白S1頭部上存在大量的疏水性氨基酸，每個(gè)S1片段上都存在1 個(gè)ATPase活性中心，MLC與S1頭部連接，可調(diào)節(jié)ATPase活性[3]。

肌紅蛋白（myoglobin，Mb）是由1 條多肽鏈的珠蛋白和1 個(gè)血紅素輔基構(gòu)成，為肉品的主要呈色物質(zhì)[4]。血紅素輔基是1 個(gè)具有卟啉環(huán)平面結(jié)構(gòu)的小分子，環(huán)中心為1 個(gè)亞鐵離子或鐵離子[5]。血紅素輔基具有親合性，鐵卟啉上的2 個(gè)丙酸側(cè)鏈以非共價(jià)相互作用與珠蛋白肽鏈中的2 個(gè)堿性氨基酸側(cè)鏈相連，卟啉鐵與珠蛋白肽鏈上氨基酸形成配位鍵，使血紅素輔基結(jié)合在Mb的疏水性空腔中，這些結(jié)合力能夠穩(wěn)定Mb結(jié)構(gòu)[6-9]。但是pH值、溫度、鹽、酶類(lèi)等諸多因素會(huì)影響血紅輔基與珠蛋白結(jié)合力的穩(wěn)定性，引起Mb構(gòu)象改變，從而導(dǎo)致血紅素輔基有可能暴露甚至從Mb中脫落[10-13]。

血紅素輔基是肉品中重要的促氧因子，能顯著促進(jìn)蛋白氧化的發(fā)生[14]。這是由于血紅素輔基能夠與蛋白中特有的肽鏈結(jié)合，同時(shí)血紅素輔基中心可以與蛋白疏水空腔中的氨基酸形成配位作用和氫鍵。目前，對(duì)血紅素輔基功能特性的研究大都集中在血紅素輔基與脂質(zhì)氧化的密切關(guān)系。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)適度氧化也對(duì)肉品保水性具有重要影響[15]。肌球蛋白是肌肉中的重要蛋白成分，對(duì)肉制品的質(zhì)構(gòu)特性和保水性影響顯著，因此，研究血紅素輔基與肌球蛋白的相互作用將為控制肉品氧化、改善肉品保水性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三黃雞 江蘇立華牧業(yè)股份有限公司;三黃雞購(gòu)買(mǎi)后暫養(yǎng)過(guò)夜，次日宰殺，快速取胸大肌，用于肌球蛋白提取。

血紅素輔基 美國(guó)Sigma公司;2，4-二硝基苯肼（2，4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、5，5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5，5-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB）、溴酚藍(lán)（bromophenol blue，BPB）（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FE20/FG2 pH計(jì)、AL電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司;T-25型數(shù)顯勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司;多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek儀器有限公司;Mini-PROTEAN Tetra Cell垂直電泳系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司;JS-680C全自動(dòng)凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司;UniCenMR臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Herolab公司;Centrifuge 5424R小型冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;1500圓二色譜儀 日本Jasco公司;LS-55熒光分光光度計(jì) 美國(guó)Perkin Elmer公司;SCIENTZ-D超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

參考Hayakawa等[16]的方法并略作改動(dòng)。將現(xiàn)殺現(xiàn)取的雞胸肉冰浴降溫，去除筋膜和脂肪后切碎，與3 倍體積預(yù)冷提取液A（0.5 mol/L KCl、0.1 mol/L KH2PO4、50 mmol/L K2HPO4、5 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）-2Na、4 mmol/L焦磷酸鈉，pH 6.5）混合，將混合物在5 000×g下冰浴勻漿5 s。將勻漿液冰浴超聲10 min（超聲功率200 W、工作時(shí)間1 s、間隔時(shí)間3 s），超聲后攪拌20 min，離心（4 ℃、5 000×g、10 min），取上清液用3 層紗布過(guò)濾。濾液用10 倍體積預(yù)冷超純水稀釋，4 ℃混勻靜置4 h，虹吸去除上清液，取沉降物離心（4 ℃、8 000×g、10 min），收集沉淀。沉淀加3 倍體積提取液B（0.3 mol/L KCl、20 mmol/L K2HPO4、20 mmol/L KH2PO4，pH 7.0），攪拌20 min混勻，離心（4 ℃、10 000×g、20 min），取上清液加10 倍體積預(yù)冷超純水混勻，4 ℃靜置過(guò)夜，虹吸去除上清液，取沉降物，離心（4 ℃、8 000×g、10 min），收集沉淀，即為粗肌球蛋白。粗肌球蛋白用3 倍體積透析液（0.6 mol/L KCl、20 mmol/L K2HPO4、20 mmol/L KH2PO4，pH 7.5）溶解并于透析袋（重均分子質(zhì)量10 000 Da）中透析16 h，得到的溶液在10 000×g下離心20 min，上清液即為肌球蛋白溶液。用雙縮脲法測(cè)定溶液蛋白質(zhì)量濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）測(cè)定提取肌球蛋白純度。

1.3.2 血紅素輔基溶液的制備

準(zhǔn)確稱取血紅素輔基粉末0.163 g，用30 mmol/L?NaOH溶液配制成濃度為10 mmol/L儲(chǔ)備液，避光保存。用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.6 mol/L KCl、20 mmol/L K2HPO4、20 mmol/L?KH2PO4，pH 7.5）將儲(chǔ)備液稀釋成濃度為0.0、0.4、1.0、2.0、3.0 mmol/L的血紅素輔基溶液，冷藏避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 肌球蛋白的氧化

向10 mg/mL肌球蛋白溶液中分別等體積血紅素輔基溶液，血紅素輔基終濃度分別為0.0、0.2、0.5、1.0、

1.5 mmol/L，在4 ℃避光條件下孵育16 h，得到不同氧化程度的肌球蛋白溶液樣品。

1.3.4 蛋白羰基含量的測(cè)定

參考Mesquita等[17]的方法略作修改。將0.1 mL 5 mg/mL不同氧化程度的肌球蛋白溶液與0.4 mL 10 mmol/L DNPH溶液（含0.5 mol/L H3PO4）混合。與等量0.5 mol/L H3PO4溶液混合作為對(duì)照組。將混合溶液于25 ℃下暗處反應(yīng)10 min。反應(yīng)完成后，向混合溶液中加入0.2 mL 6 mol/L NaOH溶液，并在25 ℃繼續(xù)反應(yīng)10 min，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定混合溶液吸光度。按式（1）計(jì)算羰基含量。

式中：A為450 nm波長(zhǎng)處溶液吸光度;n為稀釋倍數(shù);ρ為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）;ε為摩爾消光系數(shù)22 000 L/（mol·cm）。

1.3.5 巰基含量的測(cè)定

采用文獻(xiàn)[18]方法并略作修改。

總巰基含量：將0.5 mL 5 mg/mL不同氧化程度的肌球蛋白溶液與4.5 mL 0.02 mol/L的Tris-HCl緩沖液（含10 mmol/L EDTA-2Na、2% SDS、8 mol/L尿素，pH 7.5）混合，然后加入0.5 mL Ellman試劑（0.1% DTNB、0.2 mol/L Tris-HCl，pH 7.5）混勻，在40 ℃下孵育25 min后，于412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定混合溶液吸光度。

活性巰基含量：將0.5 mL 5 mg/mL不同氧化程度的肌球蛋白溶液與4.5 mL 0.02 mol/L的Tris-HCl緩沖液（含10 mmol/L EDTA-2Na、2% SDS，pH 7.5）混合，然后加入0.5 mL Ellman試劑在4 ℃下孵育1 h，于412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定混合物溶液吸光度。

總巰基、活性巰基含量按式（2）計(jì)算。

式中：A為412 nm波長(zhǎng)處溶液吸光度;n為稀釋倍數(shù);ρ為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）;ε為摩爾消光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）。

1.3.6 表面疏水性的測(cè)定

參考Zhang Dong等[19]的方法，將1 mL 5 mg/mL不同氧化程度的肌球蛋白溶液與200 μL 1 mg/mL的BPB溶液混合。將1 mL PBS與相應(yīng)濃度的血紅素輔基溶液和200 μL BPB溶液混合，作為對(duì)照組。將所有樣品在25 ℃下振蕩10 min，離心（8 000×g、10 min、4 ℃）。取上清液用PBS稀釋10 倍，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定上清液吸光度。用BPB結(jié)合量表示肌球蛋白的表面疏水性，按式（3）計(jì)算。

1.3.7 溶解度的測(cè)定

參考Liu Ru等[20]的方法略作修改，將2 mL 5 mg/mL不同氧化程度的肌球蛋白溶液在4 ℃下離心10 min。考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定離心前后肌球蛋白質(zhì)量濃度，按式（4）計(jì)算肌球蛋白溶解度。

1.3.8 Ca2+/K+-ATPase活力的測(cè)定

用pH 7.5、20 mmol/L Tris-HCl緩沖液配制肌球蛋白及血紅素輔基溶液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定Ca2+/K+-ATPase活力。

1.3.9 SDS-PAGE分析

采用SDS-PAGE分別在還原和非還原條件下分析氧化修飾的肌球蛋白交聯(lián)和聚集。參考Xiong YoulingL.等[21]的方法略作修改。200 μL 2 mg/mL不同氧化程度的肌球蛋白溶液與50 μL含體積分?jǐn)?shù)5% β-巰基乙醇的樣品緩沖液（250 mmol/L Tris-HCl，10% SDS、50%甘油、0.5%溴酚藍(lán)）混合，以不含β-巰基乙醇的樣品緩沖液作為對(duì)照。將樣品溶液于95 ℃下加熱5 min后，12 000×g離心5 min。電泳條件：12%分離膠，4%濃縮膠，電極緩沖液為T(mén)ris-Gly緩沖液（含0.1% SDS），上樣量5 μL。恒定120 V下電泳90 min，染色脫色后記錄。

1.3.10 內(nèi)源性熒光光譜分析

采用熒光光譜儀分析血紅素輔基氧化修飾后肌球蛋白熒光光譜的變化。肌球蛋白溶液質(zhì)量濃度0.2 mg/mL，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍290～420 nm，狹縫寬度均為5 nm，掃描速率300 nm/min[22]。

1.3.11 圓二色性光譜分析

采用圓二色性光譜儀分析血紅素輔基氧化修飾后肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。用30 mmol/L PBS將肌球蛋白溶液稀釋至質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL。儀器參數(shù)設(shè)置：掃描速率200 nm/min，帶寬1 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)190～250 nm[23]，室溫下記錄光譜數(shù)據(jù)。

1.3.12 分子動(dòng)力學(xué)模擬

采用YASARA軟件[24]進(jìn)行肌球蛋白與血紅素輔基復(fù)合物體系的分子動(dòng)力學(xué)模擬，主要步驟包括：優(yōu)化體系內(nèi)部氫鍵網(wǎng)絡(luò)[25]，以提高體系的穩(wěn)定性;設(shè)置環(huán)境pH 7.4，自動(dòng)預(yù)測(cè)氨基酸殘基的質(zhì)子化狀態(tài);在盒子中填充水分子，共添加96 959 個(gè)水分子。為保持模擬體系的電荷平衡，在模擬盒子中添加0.9 mg/100 mL NaCl，體系總原子數(shù)331 749 個(gè)。在分子動(dòng)力學(xué)模擬開(kāi)始前，采用最陡下降法和模擬退火方法進(jìn)行模擬體系優(yōu)化，以消除原子間過(guò)近的接觸，然后對(duì)復(fù)合物體系進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，時(shí)間50 ns，模擬過(guò)程中肌球蛋白采用AMBER14力場(chǎng)[26]，血紅素輔基采用GAFF2力場(chǎng)[27]和RESP電荷[28]，水分子采用TIP3P模型。分子間范德華相互作用的截?cái)嘀禐?0 ?，長(zhǎng)程相互作用采用PME方法[29]，截?cái)嘀禐?.0 nm。分子模擬過(guò)程中對(duì)成鍵相互作用采用步長(zhǎng)時(shí)間1.25 fs，對(duì)非鍵相互作用采用步長(zhǎng)時(shí)間2.5 fs，模擬溫度25 ℃，壓力為標(biāo)準(zhǔn)大氣壓。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用軟件IBM SPSS Statistics 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析;運(yùn)用ANOVA-Turkey法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素檢驗(yàn)分析，P<0.05，表示2 組數(shù)據(jù)間具有顯著性差異;采用Origin 8.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白羰基含量的影響

肌球蛋白側(cè)鏈中脯氨酸、組氨酸、賴氨酸和精氨酸等氨基酸殘基含有-NH2或-NH基團(tuán)，這些基團(tuán)極易氧化，氧化后與這些基團(tuán)相連的碳原子易形成羰基[30]，因此羰基含量是評(píng)價(jià)肌球蛋白氧化損傷的敏感指標(biāo)。由圖1可知，添加血紅素輔基后肌球蛋白羰基含量增加，且隨著血紅素輔基濃度的增大，肌球蛋白羰基含量呈上升趨勢(shì)（P<0.05）。血紅素輔基濃度0.2～0.5 mmol/L時(shí)，肌球蛋白羰基含量上升趨勢(shì)較為平緩，說(shuō)明肌球蛋白氧化程度較低，而血紅素輔基濃度1.0～1.5 mmol/L時(shí)，肌球蛋白羰基含量顯著增加（P<0.05）。表明血紅素輔基促使肌球蛋白敏感性氨基酸側(cè)鏈形成了羰基及其衍生物，甚至引起了肽鍵的斷裂[31]。

2.2 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白巰基含量的影響

蛋白質(zhì)氧化會(huì)造成巰基含量減少，因此巰基含量可作為檢測(cè)蛋白質(zhì)氧化程度的指標(biāo)[32]。肌球蛋白約含42 個(gè)巰基，氧化會(huì)使一些敏感性含硫氨基酸的活性巰基發(fā)生氧化形成二硫鍵，也可能進(jìn)一步氧化成磺酸類(lèi)或其他氧化產(chǎn)物，從而導(dǎo)致肌球蛋白結(jié)構(gòu)表面巰基含量下降[33]。由圖2可知，添加血紅素輔基后，肌球蛋白總巰基和活性巰基含量均隨血紅素輔基濃度的增加呈逐漸降低的趨勢(shì)。這一結(jié)果表明血紅素輔基氧化修飾導(dǎo)致肌球蛋白結(jié)構(gòu)伸展，肌球蛋白頭部S1亞基內(nèi)部巰基暴露，同時(shí)活性巰基氧化交聯(lián)形成分子間二硫鍵。

2.3 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白表面疏水性的影響

由圖3可知，在0.2～0.5 mmol/L血紅素輔基濃度下，肌球蛋白表面疏水性降低。推測(cè)存在2 種原因：其一是氧化使肌球蛋白展開(kāi)和聚集同時(shí)發(fā)生，低濃度下，血紅素輔基氧化使肌球蛋白疏水基團(tuán)暴露，疏水基團(tuán)相互作用形成聚集體，導(dǎo)致肌球蛋白表面疏水性氨基酸殘基的掩埋，同時(shí)由于疏水殘基的共價(jià)修飾，以及由于氧化造成表面疏水性氨基酸殘基結(jié)構(gòu)變化部分形成親水基團(tuán)，從而造成肌球蛋白表面疏水性的降低[34];其二是血紅素輔基與肌球蛋白相互作用，發(fā)生了疏水性結(jié)合[35]。當(dāng)血紅素輔基濃度增加到1.0～1.5 mmol/L時(shí)，肌球蛋白表面疏水性顯著升高（P<0.05），表明肌球蛋白在氧化過(guò)程中結(jié)構(gòu)展開(kāi)，大量疏水性氨基酸殘基暴露，導(dǎo)致表面疏水性的提高。

2.4 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白溶解度的影響

蛋白氧化會(huì)引起蛋白質(zhì)間的交聯(lián)、聚集，形成肉眼可見(jiàn)的聚集體[32]。由圖4可知，隨著血紅素輔基濃度的增加，肌球蛋白溶解度整體呈下降趨勢(shì)，低濃度血紅素輔基（0.2～0.5 mmol/L）處理下，肌球蛋白溶解度變化不明顯，說(shuō)明肌球蛋白氧化程度較小;當(dāng)血紅素輔基濃度為1.0 mmol/L時(shí)，肌球蛋白溶解度較未氧化時(shí)降低了14.55%;當(dāng)血紅素輔基濃度增加到1.5 mmol/L時(shí)，溶解度降低了28.13%。這一結(jié)果表明，在氧化攻擊下肌球蛋白之間形成交聯(lián)，導(dǎo)致蛋白大量聚集，同時(shí)蛋白結(jié)構(gòu)伸展，使疏水基團(tuán)外露，引起蛋白疏水相互作用增強(qiáng)，從而降低了蛋白質(zhì)的溶解性。此外，從熱力學(xué)角度分析，蛋白溶解性的降低是化學(xué)平衡移動(dòng)的結(jié)果，蛋白氧化促進(jìn)了蛋白分子間的相互作用，使蛋白質(zhì)有序的三級(jí)結(jié)構(gòu)受到破壞，從而減弱了水分子和蛋白的相互作用[36]。

2.5 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白Ca2+/K+-ATPase活力的影響

ATPase活力可以反映肌球蛋白的完整性，肌球蛋白頭部S1區(qū)存在2 種活性巰基（-SH1和-SH2）。-SH1影響Ca2+-ATPase活性，而-SH1和-SH2同時(shí)影響K+-ATPase活性[37]。由圖5可知：添加血紅素輔基后，肌球蛋白Ca2+-ATPase活力顯著降低，說(shuō)明血紅素輔基的氧化修飾對(duì)肌球蛋白頭部S1區(qū)-SH1影響較大;K+-ATPase活力沒(méi)有顯著變化，說(shuō)明血紅素輔基對(duì)肌球蛋白-SH2影響較小。以上結(jié)果表明，血紅素輔基主要通過(guò)影響肌球蛋白頭部S1區(qū)活性巰基-SH1影響肌球蛋白結(jié)構(gòu)。

2.6 SDS-PAGE分析結(jié)果

由圖6可知：經(jīng)血紅素輔基氧化修飾后，在非還原條件下（不添加β-巰基乙醇），上方區(qū)域存在少量高分子化合物，且有部分堆積在進(jìn)樣口未進(jìn)入濃縮膠，隨著血紅素輔基濃度的增加，高分子化合物的條帶逐漸變寬，表明肌球蛋白經(jīng)氧化修飾會(huì)發(fā)生交聯(lián)聚集，形成聚集體;而在還原條件下（添加β-巰基乙醇），低濃度血紅素輔基作用后，上方區(qū)域條帶基本消失，MHC條帶（分子質(zhì)量220 kDa處）灰度降低不明顯，高濃度血紅素輔基處理的肌球蛋白MHC條帶隨著血紅素輔基濃度的增加明顯變窄，且MHC條帶上方區(qū)域還存在未完全分解的化合物，表明氧化引起MHC斷裂。聚集現(xiàn)象表明血紅素輔基處理導(dǎo)致肌球蛋白巰基氧化交聯(lián)形成了二硫鍵，高濃度血紅素輔基氧化條件下，除二硫鍵以外還存在其他作用力。

2.7 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白構(gòu)象的影響

肌球蛋白中色氨酸、苯丙氨酸等氨基酸能夠發(fā)射熒光，因此肌球蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度變化及峰值的偏移可以反映出其結(jié)構(gòu)變化[33]。由圖7可知，肌球蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度隨著血紅素輔基濃度的增加呈下降趨勢(shì)，表明在血紅素輔基作用下肌球蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，色氨酸殘基被轉(zhuǎn)移到更加疏水的非極性環(huán)境中，血紅素輔基與肌球蛋白之間的相互作用導(dǎo)致肌球蛋白構(gòu)象改變。同時(shí)，熒光最高峰值位置從336.0 nm藍(lán)移至327.5 nm，表明肌球蛋白被血紅素輔基氧化，蛋白間發(fā)生聚集，氨基酸殘基被包埋，暴露程度降低。

2.8 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

通過(guò)圓二色性光譜測(cè)定血紅素輔基氧化前后肌球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。由圖8可知，不同氧化程度的肌球蛋白在208 nm和222 nm附近均出現(xiàn)2 個(gè)負(fù)吸收峰，表明二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為螺旋結(jié)構(gòu)[38]。肌球蛋白桿狀尾部主要是由α-螺旋構(gòu)成，因此α-螺旋含量的變化反映了其桿狀尾部的變化。β-折疊通常由肽鏈之間的氫鍵穩(wěn)定。隨著血紅素輔基濃度的增加，肌球蛋白中α-螺旋相對(duì)含量逐漸減少，說(shuō)明肌球蛋白氧化導(dǎo)致分子內(nèi)氫鍵減少，α-螺旋結(jié)構(gòu)失去穩(wěn)定;當(dāng)血紅素輔基濃度為0.2～0.5 mmol/L時(shí)，β-折疊相對(duì)含量降低，無(wú)規(guī)卷曲與β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量增加，說(shuō)明巰基氧化生成分子內(nèi)二硫鍵，肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生

回折[39];當(dāng)血紅素輔基濃度為1 mmol/L時(shí)，β-折疊相對(duì)含量增加，表明肌球蛋白受氧化攻擊后，部分結(jié)構(gòu)展開(kāi)，相鄰肽鏈之間形成分子間氫鍵。這一結(jié)果表明，肌球蛋白經(jīng)過(guò)氧化后，α-螺旋逐漸解旋，且部分轉(zhuǎn)化為更為松散的β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，包埋在分子內(nèi)部的疏水性殘基暴露，導(dǎo)致表面疏水性上升，肌球蛋白分子間的疏水相互作用增強(qiáng)，發(fā)生聚合[18]。由此可知，肌球蛋白氧化可改變氨基酸與肽鏈間的相互作用，特別是氧化過(guò)程中氨基酸側(cè)鏈間氫鍵的減少，會(huì)極大地影響蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)[40]。

2.9 血紅素輔基與肌球蛋白的分子動(dòng)力學(xué)模擬

為進(jìn)一步研究血紅素輔基對(duì)肌球蛋白的氧化修飾，通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬氧化過(guò)程中二者的相互作用，并對(duì)肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行分析。由圖9可知，在分子模擬氧化修飾過(guò)程中，血紅素輔基與肌球蛋白間的疏水相互作用是二者結(jié)合的主要驅(qū)動(dòng)力，平均數(shù)量約為24，而氫鍵和π-π堆積作用僅為1～2。

圖10顯示了分子模擬血紅素輔基氧化修飾對(duì)肌球蛋白周?chē)被岬挠绊?。模擬50 ns后，血紅素輔基中心Fe離子分別與Asp 436和His 494的側(cè)鏈形成配位鍵。分子模擬結(jié)果證實(shí)，在低濃度條件下，血紅素輔基與肌球蛋白發(fā)生結(jié)合，且疏水相互作用是二者結(jié)合的關(guān)鍵作用力，從而影響了肌球蛋白的結(jié)構(gòu)，但高濃度血紅素輔基處理后，肌球蛋白高度氧化，發(fā)生變性，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，構(gòu)象發(fā)生變化。這些原因使肌球蛋白內(nèi)部熒光生色基團(tuán)附近的環(huán)境發(fā)生細(xì)微變化，進(jìn)而導(dǎo)致肌球蛋白熒光猝滅，二級(jí)結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變。

A、B. 分別表示模擬0 ns和50 ns結(jié)合位點(diǎn)1的血紅素輔基與周?chē)鷼埢慕Y(jié)合模式;C、D. 分別表示模擬0 ns和50 ns結(jié)合位點(diǎn)2的血紅素輔基與周?chē)鷼埢慕Y(jié)合模式;灰色表示血紅素輔基;橙色表示Fe原子;藍(lán)色表示配位鍵;紅色表示原子距離。

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，隨著血紅素輔基濃度的增加，肌球蛋白羰基含量呈增加趨勢(shì);血紅素輔基氧化會(huì)造成肌球蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，巰基及疏水氨基酸暴露，導(dǎo)致二硫鍵含量、表面疏水性的增加;肌球蛋白溶解度、巰基含量、Ca2+/K+-ATPase活性均呈現(xiàn)不同程度的降低，但Ca2+-ATPase活性降低更明顯，這是由于血紅素輔基主要引起肌球蛋白頭部活性巰基-SH1發(fā)生變化;SDS-PAGE結(jié)果表明，血紅素輔基氧化修飾會(huì)造成肌球蛋白二硫鍵的形成，蛋白發(fā)生聚集;血紅素輔基的氧化修飾導(dǎo)致肌球蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度降低，峰值位置藍(lán)移;α-螺旋相對(duì)含量的降低，表明血紅素輔基氧化修飾會(huì)促進(jìn)肌球蛋白尾部解螺旋，蛋白構(gòu)象發(fā)生變化;分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果證實(shí)，低濃度血紅素輔基處理下，肌球蛋白可以保持活性并與之發(fā)生結(jié)合，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度改變，高濃度血紅素輔基處理會(huì)導(dǎo)致肌球蛋白高度氧化變性，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)顯著變化。

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