張 園，劉正杰，林 春，閆亞澤， 袁加紅，王 入，毛自朝，楊煥文

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,昆明 650201; 2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 特色小宗作物研究中心, 昆明 650201; 3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院,昆明 650201)

蘆筍(AsparagusofficinalisL.)是多年生宿根性草本植物，百合科天門冬屬，學(xué)名石刁柏，屬國(guó)宴常用蔬菜，常有“蔬菜之王”美譽(yù)[1]。蘆筍除具備很高食用價(jià)值之外，還能對(duì)人體多種疾病有預(yù)防和治療效果，如降血糖、降血脂、抗癌等[2]。目前，國(guó)際蘆筍市場(chǎng)需求量正在日益增長(zhǎng)，其中中國(guó)蘆筍約占國(guó)際蘆筍消耗量40%，蘆筍產(chǎn)業(yè)已成為蘆筍栽培產(chǎn)地農(nóng)民增收致富重要來源[3-4]。目前，市場(chǎng)上所用蘆筍栽培品種雖然產(chǎn)量和品質(zhì)較好，但多易感病害，特別是莖枯病、褐斑病和炭疽病等，因此篩選高產(chǎn)、高質(zhì)和抗病品種是蘆筍育種工作的重點(diǎn)[5]。蘆筍品種以雜交育種和系統(tǒng)選育等常規(guī)選育方法為主，但常規(guī)選育過程長(zhǎng)，育種流程繁瑣，可控性較差且育種效率較低；與之相比，轉(zhuǎn)基因育種能克服常規(guī)育種手段許多弊端，如可以定向遺傳改良、育種周期短且可控性較高等，因此，越來越受到育種者的重視與廣泛利用[6]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于蘆筍的研究主要集中在常規(guī)育種[5]、種植栽培與管理[7]、采后生理及貯藏技術(shù)[8]、化學(xué)成分與藥理[9]、組織培養(yǎng)[1]等方面，而對(duì)于蘆筍轉(zhuǎn)基因育種等相關(guān)研究較少，且不夠深入。Hernalsteens等[10]將不帶外源質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌侵染蘆筍莖，并在轉(zhuǎn)化材料檢測(cè)到了胭脂堿和農(nóng)桿菌素堿的存在，證實(shí)了應(yīng)用農(nóng)桿菌侵染法在轉(zhuǎn)化蘆筍中的可能性,但該研究并沒有進(jìn)行含有外源質(zhì)粒農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化，也未對(duì)轉(zhuǎn)基因材料農(nóng)桿菌基因表達(dá)情況以及遺傳轉(zhuǎn)化影響因素做深入研究；Limanton-Grevet等[11]用農(nóng)桿菌AGL1將uidA和nptⅡ基因轉(zhuǎn)入蘆筍胚性系。雖然上述研究實(shí)現(xiàn)了蘆筍轉(zhuǎn)基因，但其遺傳轉(zhuǎn)化體系效率較低且研究不夠系統(tǒng)。鹿志偉等[6]在前人研究基礎(chǔ)上，開展了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘆筍遺傳轉(zhuǎn)化影響因素研究，但該研究受體材料仍是以組織培養(yǎng)過程中形成的數(shù)量較少的蘆筍胚狀體為外植體，導(dǎo)致獲得遺傳轉(zhuǎn)化植株的群體不夠大。為解決上述蘆筍轉(zhuǎn)基因研究中存在的問題，本研究以蘆筍組織培養(yǎng)過程中得到的莖尖為外植體，基于瞬時(shí)表達(dá)體系分析影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的諸多參數(shù)，包括農(nóng)桿菌侵染濃度、侵染時(shí)間、乙酰丁香酮(AS)濃度、共培養(yǎng)時(shí)間、分化篩選培養(yǎng)基中卡那霉素濃度及抑菌抗生素種類等。在優(yōu)化的遺傳轉(zhuǎn)化參數(shù)基礎(chǔ)上，獲得轉(zhuǎn)基因植株，并進(jìn)行PCR、GUS組織化學(xué)染色檢測(cè)和qRT-PCR分析，初步建立蘆筍莖尖遺傳轉(zhuǎn)化體系，為后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試劑

供試受體材料為蘆筍品種‘達(dá)寶利’在MS培養(yǎng)基上擴(kuò)繁得到的新的幼嫩莖尖。挑選狀態(tài)良好的蘆筍莖尖至預(yù)培養(yǎng)基(1/2 MS培養(yǎng)基)，置于26 ℃光照培養(yǎng)2 d，作為后續(xù)轉(zhuǎn)化受體材料。農(nóng)桿菌EHA105菌株以及質(zhì)粒載體pBI121由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)特色小宗作物研究中心保存。

卡那霉素、羧芐青霉素、乙酰丁香酮(AS)、DNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等藥品均購(gòu)自上海生物工程有限公司，DNA聚合酶、dNTPs等生化試劑購(gòu)自全式金生物公司，基本培養(yǎng)基等購(gòu)自昆明云科生物技術(shù)有限公司。

培養(yǎng)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)基為YEP(每升培養(yǎng)基含10 g酵母提取液、5 g胰蛋白胨、10 g NaCl和0.5 g MgSO4·7H2O，pH為7.0)。共培養(yǎng)基[12]為1/2 MS+ IBA 0.5 mg·L-1+ KT 0.1 mg·L-1+ 嘧啶醇 0.5 mg·L-1+ AS 150 μmol·L-1；篩選培養(yǎng)基[12]為1/2MS + IBA 0.5 mg·L-1+ KT 0.1 mg·L-1+ 嘧啶醇 0.5 mg·L-1+ Carb 200 mg·L-1+Kan 50 mg·L-1。莖尖抗性篩選、抗性芽的生長(zhǎng)及生根均在上述篩選培養(yǎng)基中完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 轉(zhuǎn)化菌液的制備 將質(zhì)粒pBI121(含GUS基因)經(jīng)凍融法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)農(nóng)桿菌EHA105，涂布于YEP固體培養(yǎng)基，挑取單克隆進(jìn)行PCR陽(yáng)性鑒定，接種于5 mL的YEP液體培養(yǎng)基(含利福平50 mg·L-1+卡那霉素50 mg·L-1)，28 ℃ 220 r·min-1振蕩培養(yǎng)16～18 h，再取50 μL該菌液接種至50 mL新鮮的YEP液體培養(yǎng)基(含利福平50 mg·L-1+卡那霉素50 mg·L-1)，28 ℃ 220 r·min-1振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)8 h后，6 000 r·min-1離心5 min收集菌體，用重懸培養(yǎng)基(MS+AS 150 μmol·L-1+30 g·L-1蔗糖)調(diào)節(jié)OD600值形成侵染液備用。

1.2.2 遺傳轉(zhuǎn)化參數(shù)的確定 在超凈工作臺(tái)上，切取0.1～0.3 cm蘆筍莖尖，置于50 mL離心管中，然后加入侵染液(含AS)浸泡蘆筍莖尖，在恒溫?fù)u床慢速搖5～40 min，再去除菌液，在無(wú)菌濾紙上吸干莖尖表面殘留菌液，接種于共培養(yǎng)基，于20 ℃暗處共培養(yǎng)，選取部分經(jīng)共培養(yǎng)的莖尖，進(jìn)行GUS瞬時(shí)表達(dá)率統(tǒng)計(jì)，以確定最佳轉(zhuǎn)化 條件。

農(nóng)桿菌濃度：用活化好的不同OD600值根癌農(nóng)桿菌菌液(OD600分別為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0)侵染蘆筍莖尖，再接種至共培養(yǎng)基，置于 20 ℃暗處培養(yǎng)3 d。取共培養(yǎng)結(jié)束后的莖尖進(jìn)行組織化學(xué)染色，統(tǒng)計(jì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率。

農(nóng)桿菌侵染時(shí)間：將根癌農(nóng)桿菌調(diào)節(jié)至OD600值為0.6，侵染外植體的時(shí)間分別設(shè)定為5、10、15、20、30和40 min，侵染完成后，將受體材料接種至共培養(yǎng)基上置于20 ℃暗處培養(yǎng)3 d。取共培養(yǎng)結(jié)束后的莖尖進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，統(tǒng)計(jì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率。

AS濃度：向活化好的根癌農(nóng)桿菌以及共培養(yǎng)基中分別添加AS，使AS的濃度分別為0、50、100、150和200 μmol·L-1，將農(nóng)桿菌液侵染蘆筍莖尖后，再接種至共培養(yǎng)基并置于20 ℃暗處培養(yǎng)3 d。取共培養(yǎng)結(jié)束后的莖尖進(jìn)行組織化學(xué)染色，統(tǒng)計(jì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率。

共培養(yǎng)時(shí)間的確定：調(diào)節(jié)根癌農(nóng)桿菌菌液，侵染外植體，轉(zhuǎn)移至添加AS的共培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)2、3、4、5和6 d，取共培養(yǎng)結(jié)束后的莖尖進(jìn)行組織化學(xué)染色，統(tǒng)計(jì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率。

卡那霉素濃度:蘆筍離體莖尖經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后，20 ℃黑暗處共培養(yǎng)3 d，然后接種于添加卡那霉素0、12.5、25、50、75及100 mg·L-1的篩選培養(yǎng)基，26 ℃培養(yǎng)15 d。每個(gè)處理培養(yǎng)約50個(gè)莖尖，每個(gè)處理重復(fù)3次。經(jīng)篩選后統(tǒng)計(jì)外植體的存活率，以確定適宜的卡那霉素濃度。

抗生素類型及濃度：將根癌農(nóng)桿菌在含有不同類型(頭孢霉素和羧芐青霉素)及濃度抗生素(0、50、100、150、200、250和300 mg·L-1)的YEP培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，通過統(tǒng)計(jì)其OD600值并觀察其抑菌效果。

1.2.3 GUS組織化學(xué)染色 共培養(yǎng)后，每個(gè)處理隨機(jī)取10～20個(gè)莖尖，無(wú)菌水清洗5～6次，用無(wú)菌濾紙吸干材料表面水分，放入1.5 mL離心管中，加入GUS組織化學(xué)染色液(成分為： 1 mg·L-1X-Gluc+0.5 mmol·L-1鐵氰化鉀+0.5 mmol·L-1亞鐵氰化鉀+50 mmol·L-1Na2HPO4,30 mmol·L-1NaH2PO4+8 mmol·L-1EDTA+0.5% Triton X-100)，37 ℃恒溫過夜，再用φ=70%乙醇浸泡脫色，直到色素脫去后觀測(cè)染色情況，統(tǒng)計(jì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率，以無(wú)菌水處理的未侵染的莖尖為陰性對(duì)照。GUS瞬時(shí)表達(dá)率的計(jì)算公式為：GUS瞬時(shí)表達(dá)率=顯色的組織數(shù)/檢測(cè)總組織數(shù)×100%，每個(gè)處理均重復(fù)3次。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因抗性植株的獲得 將共培養(yǎng)后的莖尖，經(jīng)含有羧芐青霉素(200 mg·L-1)的無(wú)菌水清洗5～6遍，用無(wú)菌濾紙吸干莖尖表面水分，置于篩選培養(yǎng)基(1/2 MS + IBA 0.5 mg·L-1+ KT 0.1 mg·L-1+ 嘧啶醇0.5 mg·L-1+ 羧芐青霉素200 mg·L-1+ 卡那霉素50 mg·L-1)上篩選抗性莖尖，然后將抗性莖尖繼續(xù)在篩選培養(yǎng)基上長(zhǎng)芽與誘導(dǎo)生根，獲得轉(zhuǎn)基因抗性植株。選取部分轉(zhuǎn)基因抗性植株莖尖、莖部和根部組織，進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色的初步鑒定，方法參照“1.2.3”。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定 取GUS組織化學(xué)染色呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株樣品，用CTAB法提取其DNA[13]。以質(zhì)粒pBI121的DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以未轉(zhuǎn)基因蘆筍植株為陰性對(duì)照。設(shè)計(jì)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因(NPTⅡ)特異引物KanF1： 5′-CACTGAAGCGGGAAGGGACT-3′，KanR1：5′-CGATACCGTAAAGCACGAGGAA-3′，擴(kuò)增片段512 bp，擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。其中，陽(yáng)性率的計(jì)算公式為：陽(yáng)性率=PCR陽(yáng)性數(shù)目/PCR樣品總數(shù)×100%。提取轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因蘆筍植株莖部的RNA，用試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)引物qTUB4F1：5′-CCGATAACTTTGTC TTTGGC-3′、qTUB4R1：5′-GCAAGGATTCCA AGTATGTC -3′和qKanF1：GCAGGATCTCCTGTCATCTCAC、qKanR1：CCATGGGTCAC- GACGAGATCAT，進(jìn)行上述處理樣品的定量Real-time PCR分析，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3 次重復(fù)，目的基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。 數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆筍莖尖遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響因素

2.1.1 蘆筍莖尖對(duì)卡那霉素抗性 由表1可知，在篩選培養(yǎng)過程中，隨著卡那霉素質(zhì)量濃度提高，莖尖變白直至死亡，且其存活率也逐漸減小，當(dāng)質(zhì)量濃度超過50 mg·L-1時(shí)，存活率在8%以下。因此，設(shè)定固體篩選培養(yǎng)基中卡那霉素篩選最佳質(zhì)量濃度為50 mg·L-1。

表1 固體篩選培養(yǎng)基中卡那霉素質(zhì)量濃度的確定Table 1 Determination of kanamycin mass concentration in solid screening medium

2.1.2 抑菌抗生素類型及濃度的確定 通過檢測(cè)YEP液體培養(yǎng)基中農(nóng)桿菌EHA105的OD600值來檢測(cè)頭孢霉素(Cef)和羧芐青霉素(Carb)對(duì)農(nóng)桿菌的抑制效果，由圖1可知，頭孢霉素和羧芐青霉素都有較好抑菌效果，羧芐青霉素對(duì)農(nóng)桿菌EHA105生長(zhǎng)抑制作用稍好。兩種抗生素在質(zhì)量濃度200 mg·L-1以上時(shí)，基本可以完全抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，因此在農(nóng)桿菌EHA105侵染蘆筍莖尖后，培養(yǎng)基中添加羧芐青霉素200 mg·L-1。

2.1.3 農(nóng)桿菌濃度和侵染時(shí)間 由圖2可知，農(nóng)桿菌EHA105濃度對(duì)蘆筍莖尖的GUS瞬時(shí)表達(dá)率影響較大。研究發(fā)現(xiàn)，隨著侵染液濃度升高，GUS瞬時(shí)表達(dá)率呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，當(dāng)菌液濃度為OD600=0.6時(shí)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高，達(dá)18.05%，之后隨著菌液濃度升高，GUS瞬時(shí)表達(dá)率反而下降，而且菌液濃度OD600=1.0時(shí)，農(nóng)桿菌生長(zhǎng)過盛，污染率過高。因此，確定侵染液最佳的根癌農(nóng)桿菌濃度為OD600=0.6。侵染時(shí)間過短，農(nóng)桿菌不能充分與受體材料接觸從而影響轉(zhuǎn)化率，時(shí)間過長(zhǎng)則受體材料會(huì)附著過多農(nóng)桿菌而不易脫菌。為了確定侵染時(shí)間對(duì)蘆筍莖尖GUS瞬時(shí)表達(dá)率的影響，設(shè)置了5、10、15、20、30和40 min的侵染時(shí)間。由圖3可知，隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率呈現(xiàn)先上升而后趨于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，其中在侵染時(shí)間為15 min時(shí)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高，為17.14%。

圖1 頭孢霉素和羧芐青霉素對(duì) 農(nóng)桿菌 EHA105生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of cefotaxime and carbenicillin on the growth of Agrobacterium tumefaciens EHA105

圖2 農(nóng)桿菌菌液濃度對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率的影響Fig.2 Effects of Agrobacterium tumefaciens concentration on the rate of GUS transient expression

2.1.4 乙酰丁香酮(AS)濃度和共培養(yǎng)時(shí)間 乙酰丁香酮(AS)的添加對(duì)于農(nóng)桿菌侵染受體材料至關(guān)重要，觀察不同AS濃度對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率的影響，結(jié)果如表2所示，當(dāng)AS濃度分別為50 μmol·L-1和100 μmol·L-1時(shí)差異最明顯，當(dāng)AS濃度為150 μmol·L-1時(shí)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高，之后提高AS濃度反而略有下降，故AS取最適濃度為150 μmol·L-1。將受體材料蘆筍莖

圖3 農(nóng)桿菌侵染時(shí)間對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Agrobacterium tumefaciens infecting time on the rate of GUS transient expression

表2 AS濃度對(duì)莖尖GUS瞬時(shí)表達(dá)陽(yáng)性率的影響
Table 2 Effects of AS concentration on therate ofGUStransient expression

乙酰丁香酮/(μmol·L-1)AcetosyringoneGUS瞬時(shí)表達(dá)率/%Transient expression rate of GUS08.23±0.54509.34±0.7610016.89±0.8115018.27±1.4420018.01±1.65

尖與根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，觀察不同的共培養(yǎng)時(shí)間(2～6 d)對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率的影響，結(jié)果如圖4所示：隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率呈現(xiàn)先升高后略有降低的趨勢(shì)，其中在共培養(yǎng)5 d時(shí)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率達(dá)最高，為17.89%，其次是4 d時(shí)的 17.45%。由于共培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)可能造成后續(xù)農(nóng)桿菌污染，因此確定共培養(yǎng)時(shí)間為4 d。

2.2 轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)

2.2.1 轉(zhuǎn)基因體系的建立 經(jīng)影響因素研究，優(yōu)化蘆筍遺傳轉(zhuǎn)化體系參數(shù)：將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105，挑取經(jīng)PCR鑒定的重組農(nóng)桿菌單菌落搖菌，配制OD600為0.6的農(nóng)桿菌侵染液(含150 μmol·L-1AS)，以蘆筍莖尖為外植體，農(nóng)桿菌侵染15 min(圖5-A)，共培養(yǎng)4 d(圖5-B)，然后置于篩選培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選，獲得抗性莖尖(圖5-C)，抗性莖尖繼續(xù)在篩選培養(yǎng)基進(jìn)行長(zhǎng)芽和生根培養(yǎng)(圖5-D～圖5-E)，最終獲得抗性轉(zhuǎn)基因植株(圖5-F)。

2.2.2 轉(zhuǎn)基因植株GUS組織化學(xué)染色與PCR檢測(cè) 待獲得抗性轉(zhuǎn)基因植株后，進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示，在抗性植株莖尖、莖部、根等組織部位都能不同程度地被染成藍(lán)色(圖6-A)，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹荒鼙蝗旧?，初步說明GUS基因在抗性植株中可以穩(wěn)定表達(dá)。提取抗性轉(zhuǎn)基因再生植株DNA，以非轉(zhuǎn)基因野生型材料為對(duì)照進(jìn)行nptⅡ基因的PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有抗性轉(zhuǎn)基因植株中能擴(kuò)增出目的條帶(圖6-B)，說明獲得的抗性再生材料初步鑒定為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。統(tǒng)計(jì)PCR初步檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)PCR陽(yáng)性率達(dá)到12.4%以上。

圖4 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率的影響Fig.4 Effects of co-culturetime on the rate of GUS transient expression

2.2.3 轉(zhuǎn)基因植株 qRT-PCR檢測(cè)提取轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照莖部組織的RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行qRT-pCR鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，非轉(zhuǎn)基因材料中沒有nptⅡ基因的表達(dá)，而在轉(zhuǎn)基因材料中有不同程度的表達(dá)(圖7)，說明目的基因已經(jīng)成功在轉(zhuǎn)基因蘆筍中穩(wěn)定表達(dá)。

A.莖尖侵染 Stem tip infection; B.共培養(yǎng) Co-culture; C.抗性篩選 Resistance screening; D.抗性芽 Resistant buds; E.抗性植株生根 Rooting of resistant plants; F.抗性植株 Resistant plants

圖5 ‘達(dá)寶利’莖尖遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立
Fig.5 Establishment of the genetic transformation system for stem tip of ‘Daboli’

3 討 論

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳是目前轉(zhuǎn)化效果最好的植物轉(zhuǎn)化方式之一[14-15]，因此，基于蘆筍再生體系和蘆筍莖尖的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，以及遺傳轉(zhuǎn)化成本與技術(shù)等因素，本研究選擇應(yīng)用較為普遍的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。Bytebier等[16]采用農(nóng)桿菌侵染愈傷組織等方式，經(jīng)抗性篩選與再生獲得轉(zhuǎn)基因蘆筍，但需較長(zhǎng)轉(zhuǎn)化周期。Bruno等[17]對(duì)3種基因型蘆筍體細(xì)胞進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，但其轉(zhuǎn)化率僅為0.6%～4%。Limanton-Grevet等[11]利用AGL1Gin農(nóng)桿菌侵染5個(gè)蘆筍胚性系，建立了轉(zhuǎn)化率為 0.8%～12.8%的蘆筍轉(zhuǎn)基因體系。鹿志偉等[6]在以蘆筍胚狀體為受體材料的遺傳轉(zhuǎn)化研究中，分析了菌液濃度、AS濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間等4個(gè)因素對(duì)蘆筍轉(zhuǎn)基因效率的影響，轉(zhuǎn)化率可達(dá)18%以上。與鹿志偉等[6]相關(guān)研究相比，本研究中農(nóng)桿菌侵染過程的共培養(yǎng)時(shí)間相同，均為4 d；但采用的農(nóng)桿菌侵染最佳濃度為OD600= 0.6，最佳的AS濃度為150 μmol·L-1，侵染時(shí)間為15 min，這些差異可能是由于受體材料不同而造成的。

A:轉(zhuǎn)基因植株GUS組織化學(xué)染色 GUS histochemical staining of transgenic resistant plants.a.對(duì)照莖部 Stem of CK; b.轉(zhuǎn)基因植株莖部 Stem of transgenic plants; c.對(duì)照莖尖 Stem tip of CK; d.轉(zhuǎn)基因植株莖尖 Stem tip of transgenic plants；B:轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè) PCR detection of transgenic plants;P.質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照 Plasmid positive control; WT.非轉(zhuǎn)基因植株 Non-transgenic plants;T103～T109.轉(zhuǎn)基因抗性植株 Transgenic resistant plants; M.D2000 DNA ladder

圖6 轉(zhuǎn)基因抗性植株GUS組織化學(xué)染色與PCR檢測(cè)
Fig.6 GUS histochemical staining and PCR detection of transgenic resistant plants

WT.非轉(zhuǎn)基因植株 Non-transgenic plants;T103～T109.轉(zhuǎn)基因抗性植株 Transgenic plants

圖7 轉(zhuǎn)基因植株qRT-PCR檢測(cè)
Fig.7 qRT-PCR detection of transgenic plants

在共培養(yǎng)結(jié)束后，需將受體材料轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選，從而獲得具有抗性的轉(zhuǎn)化材料，因此需要確定抗性植株的抗生素濃度[18-20]。培養(yǎng)基中添加的抗生素濃度過高則很難獲得轉(zhuǎn)基因植株，給遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立帶來困難；抗生素濃度過低，則會(huì)造成假陽(yáng)性率過高，增加后續(xù)篩選鑒定工作，本研究通過比較莖尖在含不同濃度卡那霉素培養(yǎng)室上的存活率及GUS瞬時(shí)表達(dá)率發(fā)現(xiàn)，篩選最佳濃度為50 mg·L-1。此外，在農(nóng)桿菌侵染莖尖后續(xù)抗性篩選過程中，抑制農(nóng)桿菌過度生長(zhǎng)是建立轉(zhuǎn)基因體系的關(guān)鍵因素之一，需要選擇合適的抗生素和使用濃度，本研究選擇羧芐青霉素200 mg·L-1，雖然更高的濃度對(duì)抑菌效果會(huì)更好，但也會(huì)影響莖尖的存活與生長(zhǎng)，因此抑菌抗生素需要選擇比較適中的濃度。

由于蘆筍遺傳轉(zhuǎn)化方面的研究報(bào)道相對(duì)較少，且蘆筍遺傳轉(zhuǎn)化的效率與其他物種一樣，受多個(gè)因素的影響[21-22]，因此建立蘆筍穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系并不容易。本研究嘗試以蘆筍再生體系建立過程中較為常見且數(shù)量較多的莖尖為外植體，探討影響蘆筍莖尖遺傳轉(zhuǎn)化的不同影響因素，建立了穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，拓展了蘆筍遺傳轉(zhuǎn)化受體類型，為后續(xù)蘆筍功能基因驗(yàn)證提供研究 平臺(tái)。