丁換云，魏迎鳳，陳小飛

(塔里木大學(xué) 植物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300)

鏈格孢屬真菌是一類(lèi)極為常見(jiàn)的真菌，在自然界中分布較廣，對(duì)生態(tài)環(huán)境和基質(zhì)的適應(yīng)性強(qiáng)，既是重要的植物病原菌又是人和動(dòng)物的條件致病菌，同時(shí)又是非常有應(yīng)用潛力的生物資源。目前已發(fā)現(xiàn)的鏈格孢菌有近500種，并且每年都有很多新種被陸續(xù)報(bào)道，只有對(duì)其進(jìn)行正確分類(lèi)，才能更好地對(duì)其進(jìn)行研究和利用[1]。鏈格孢屬真菌種內(nèi)形態(tài)變異性較大，并且不同生物學(xué)性狀和不同地理分布的菌株致病力差異也很大[2]。因此，開(kāi)發(fā)出可用于鏈格孢菌分類(lèi)鑒定和遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記，具有十分重要的理論和實(shí)踐意義。

近年來(lái)，已有多種分子標(biāo)記應(yīng)用于鏈格孢菌遺傳多樣性研究。姚亮亮[3]運(yùn)用RAPD和AFLP技術(shù)研究黑龍江省鏈格孢屬真菌遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)真菌RAPD組群與寄主植物和分離地區(qū)之間沒(méi)有相關(guān)性，而AFLP組群與寄主植物之間有一定相關(guān)性，但與分離地區(qū)之間沒(méi)有相關(guān)性。祖艷青[4]運(yùn)用ISSR和RAPD標(biāo)記技術(shù)研究河南省煙草赤星病菌及內(nèi)生鏈格孢菌的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)兩種標(biāo)記均能檢測(cè)出煙草赤星病菌及相關(guān)鏈格孢菌株的遺傳多樣性。Paul等[5]運(yùn)用RAPD技術(shù)對(duì)來(lái)自加利福利亞導(dǎo)致番茄壞死的69個(gè)A.alternata菌株進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)可以將菌株劃分為兩個(gè)RAPD組群，且各組群與地理來(lái)源沒(méi)有關(guān)聯(lián)。

A.alternata的近緣種A.tenuissima也是一種對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害較大的植物病原真菌，常引起多種植物病害[6-8]。黎妍妍等[9]對(duì)A.tenuissima等4種鏈格孢屬真菌進(jìn)行生物學(xué)特性研究，發(fā)現(xiàn)4種鏈格孢菌存在著致病性差異。朱海霞等[10]研究A.tenuissima對(duì)闊葉雜草的致病性，發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)豬秧秧、藜致病效果突出。然而至今，國(guó)內(nèi)外依然未見(jiàn)有關(guān)鏈格孢菌EST-SSR方面的研究 報(bào)道。

本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的A.alternataEST序列中篩選SSR，分析其在A.alternata轉(zhuǎn)錄組中的分布特點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)A.alternataEST-SSR引物，分析其在近緣種A.tenuissima中的有效性、多態(tài)性和通用性，以期為深入開(kāi)展鏈格孢菌分類(lèi)學(xué)、比較基因組學(xué)以及功能基因組研究提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試菌株：細(xì)極鏈格孢A.tenuissima分離于新疆維吾爾自治區(qū)不同地區(qū)不同寄主，共38株。其中從梨黑斑病樣本分離到5菌株，包括阿拉爾市2株，民豐縣1株，尉犁縣1株，洛浦縣1株；從蘋(píng)果褐斑病樣本中分離到12菌株，其中疏勒縣3株，葉城縣3株，皮山縣2株，阿拉爾2株，阿克陶縣2株；從沙棗黑斑病樣本分離到13株，其中烏魯木齊5株，庫(kù)爾勒3株，民豐縣3株，阿拉爾三棵樹(shù)村1株，第一師五團(tuán)1株；從杏黑斑病樣本上分離到4株，其中阿拉爾3株，策勒縣1株；從新和縣核桃鏈格孢葉斑病樣本分離到4株。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g，定容至1 L。

試劑及儀器：Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(真菌)、2×SanTaqPCR Mix、Sterilized ddH2O、DNA Marker D、Ready-to-use、6×loadingbuffer、15% ficoll、Agarose B，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；Mastercycler pro梯度PCR儀、熒光和化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；DYY-12型電泳儀，購(gòu)自北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1A.alternataEST-SSR信息分析 從NCBI的EST數(shù)據(jù)庫(kù)下載A.alternata的EST序列，運(yùn)用軟件Phred (http://www.phrap.org/consed/consed.html#howToGet)除去長(zhǎng)度小于100 bp的序列，運(yùn)用軟件Phrap(http://www.phrap.org/consed/consed.html#howToGet)除去載體序列及重復(fù)序列，然后拼接得到較高質(zhì)量的EST序列，最后運(yùn)用SSRHunter 1.3軟件結(jié)合人工查找，對(duì)A.alternata的EST序列中的SSR位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為：含二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基，并且重復(fù)基元長(zhǎng)度大于等于12 bp(二堿基重復(fù)次數(shù)≥6次、三堿基重復(fù)次數(shù)≥4次、四堿基重復(fù)次數(shù)≥3次、五堿基重復(fù)次數(shù)≥3次、六堿基重復(fù)次數(shù)≥3次)。對(duì)檢測(cè)出的SSR頻率與長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[11]。

1.2.2A.alternataEST-SSR引物設(shè)計(jì) 采用Primer Premier 5.0 軟件，根據(jù)EST序列中SSR兩端保守序列設(shè)計(jì)A.alternataEST-SSR引物，所選擇的EST-SSR序列兩端分別距離5′和3′端應(yīng)不少于20 bp。引物設(shè)計(jì)時(shí)主要參數(shù)為：引物長(zhǎng)度18～25 bp，GC含量40%～60%，退火溫度(Tm值)為50～65 ℃，PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度應(yīng)為100～500 bp，引物應(yīng)盡量避免二級(jí)結(jié)構(gòu)、發(fā)卡結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)配的出現(xiàn)。每條引物的評(píng)分均高于85分。引物設(shè)計(jì)好后由生工生物工程(上海)有限公司 合成。

1.2.3A.alternataDNA提取與引物檢測(cè) 將保存的A.alternata菌種接種至PDA培養(yǎng)基上，置于27 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待氣生菌絲生長(zhǎng)至快滿皿時(shí)，將菌絲刮下置入滅菌的研缽，烘干后備用。采用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(真菌)提取DNA。

PCR擴(kuò)增體系為25 μL反應(yīng)體系，包括2× SanTaqPCR Mix 12.5 μL、Sterilized ddH2O 10 μL、DNA模板0.5 μL、上下游引物各1 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，50～65 ℃(隨引物而設(shè)置)退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物先用20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，有擴(kuò)增產(chǎn)物的樣品采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染顯色法檢測(cè)產(chǎn)物條帶的多態(tài)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 A.alternata EST-SSR的組成及分布特征

2018年12月28日，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索出A.alternataEST序列共727條，經(jīng)去冗除雜最后拼接得到298條Unigenes，包括84條Contigs和214條Singletons。運(yùn)用軟件檢測(cè)出SSR位點(diǎn)共34個(gè)，位點(diǎn)數(shù)占全部EST序列4.68%，占到Unigenes 11.41%，表明SSR在A.alternata中含量十分豐富。在298條Unigenes中，含有SSR位點(diǎn)的Unigenes 有26條，占全部Unigenes的8.72%；其中只含1個(gè)SSR位點(diǎn)的有21條，占80.77%，出現(xiàn)2個(gè)SSR位點(diǎn)的有4條，占 15.38%，含5個(gè)SSR位點(diǎn)的只有1條，占 3.85%。

在A.alternataEST-SSR中，二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)基元類(lèi)型分別為3、7、8、2、2種，分別占總類(lèi)型的13.64%、31.82%、36.36%、 9.09%、9.09%，核苷酸重復(fù)基元類(lèi)型共有22種，其中四核苷酸基元類(lèi)型最多，而五、六核苷酸基元類(lèi)型最少。檢測(cè)到SSR總數(shù)量為34個(gè)，其中二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)基元的SSR數(shù)量分別為10、9、11、2、2個(gè)，分別占總SSR的29.41%、 26.47%、32.35%、5.88%、5.88%。在所有核苷酸基元類(lèi)型中，二核苷酸基元類(lèi)型(GA/TC)n出現(xiàn)頻率最高，為2.35%(表1)。

表1 A.alternata EST中重復(fù)基元及其比例Table 1 The motifs and their percentages in A.alternata ESTs

2.2 EST-SSR引物通用性檢測(cè)

根據(jù)拼接整理好的298條Unigenes序列，共設(shè)計(jì)13對(duì)EST-SSR引物(表2)，然后對(duì)來(lái)自新疆不同地區(qū)不同寄主的38個(gè)A.tenuissima進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明除4對(duì)引物(con36、con59、con66、sin18)未產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物外，其他9對(duì)引物均擴(kuò)增出與預(yù)期片段大小一致的條帶，有效擴(kuò)增效率為69.23%。而在9對(duì)引物中除4對(duì)引物(con14、sin34、sin104、sin168)只能擴(kuò)增出單一條帶，其余5對(duì)(con78、con80、sin94、sin109、sin153)均能擴(kuò)增出多態(tài)性條帶(圖1，圖2)，擴(kuò)增多態(tài)率為55.56%，說(shuō)明這5對(duì)引物在近緣種中具有通用性。

表2 設(shè)計(jì)合成的13對(duì)EST-SSR引物Table 2 Thirteen pairs of EST-SSR primers were designed and synthesized

1-2.LALAR; 3.LMF; 4.LWL; 5.LLPX; 6-8.PSLX; 9-11.PYCX; 12-13.PPS; 14-15.PALAR; 16-17.PAKT; M.Maker; 19-23.SWLMQ; 24-26.SKRL; 27-29.SMF;30.SSKS; 31.SWT; 32-34.HXH; 35-37.XALAR; 38.XCL

圖1 引物con78在38個(gè)細(xì)極鏈格孢菌中的擴(kuò)增結(jié)果
Fig.1 Amplification result of 38A.tenuissimaEST-SSR markers by primers of con78

1-2.LALAR; 3.LMF; 4.LWL; 5.LLPX; 6-8.PSLX; 9-11.PYCX; 12-13.PPS; 14-15.PALAR; 16-17.PAKT; M.Maker; 19-23.SWLMQ; 24-26.SKRL; 27-29.SMF;30.SSKS; 31.SWT; 32-34.HXH; 35-37.XALAR; 38.XCL

圖2 引物sin94在38個(gè)細(xì)極鏈格孢菌中的擴(kuò)增結(jié)果
Fig.2 Amplification result of 38A.tenuissimaEST-SSR markers by primers of sin94

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)727條A.alternataEST進(jìn)行篩選除冗和拼接，得到298個(gè)片段，共發(fā)掘出34個(gè)SSR位點(diǎn)，平均5.343 kb含有1個(gè)SSR位點(diǎn)。而在其他真菌中，香菇的EST序列平均每 25.942 kb含有1個(gè)SSR位點(diǎn)[12]，大豆疫霉菌的EST序列平均每8.9 kb含有1個(gè)SSR位點(diǎn)[13]，這表明交鏈格孢菌中SSR出現(xiàn)頻率較高，SSR含量豐富。本研究共檢測(cè)出22種重復(fù)基元類(lèi)型，其中出現(xiàn)頻率最高的是(GA/TC)n基元類(lèi)型，以四核苷酸基元種類(lèi)最多，而五、六核苷酸基元種類(lèi) 較少。

隨著植物病原菌基因組研究的發(fā)展，很多植物病原菌的EST已被開(kāi)發(fā)，從EST數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘SSR分子標(biāo)記，為植物病原菌SSR標(biāo)記的發(fā)展提供了一條便利途徑。SSR一般含有2～5個(gè)等位位點(diǎn)，在植物病原菌研究中不僅用于種群遺傳多樣性、近緣種的比較及系譜研究[14-15],而且還可以用于不同寄主分離物之間的比較[16-17]。在種內(nèi)檢測(cè)多態(tài)性水平上，EST-SSR標(biāo)記檢測(cè)水平要低于其他一些從非編碼區(qū)分離的標(biāo)記，然而EST-SSR標(biāo)記檢測(cè)的是基因組表達(dá)部分的變異，是真正與性狀連鎖的標(biāo)記，這將可能對(duì)決定重要表型性狀的等位基因進(jìn)行直接鑒定。另外，EST-SSR分子標(biāo)記一般具有很好的通用性，一旦開(kāi)發(fā)便可以在近緣種(屬)中進(jìn)行應(yīng)用[18]。一般情況下，同屬不同種植物間EST-SSR引物擴(kuò)增成功率為50%～100%[19]。不同種真菌間的擴(kuò)增成功率為 34%[20]。Kumar等[21]研究發(fā)現(xiàn)70%的尖鐮孢菌EST-SSR引物能在潮濕鐮孢菌中通用；Dracatos等[22]研究黑麥冠銹菌EST-SSR引物對(duì)6種真菌的通用性，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增的成功率達(dá)到 22%～53%。由于真菌EST數(shù)據(jù)庫(kù)資源有限，很多學(xué)者便以真菌近緣種的EST數(shù)據(jù)資源，開(kāi)發(fā)可用于真菌本身分類(lèi)鑒定與遺傳多樣性的分子標(biāo)記。如許韜等[23]從大麥白粉菌EST數(shù)據(jù)庫(kù)開(kāi)發(fā)小麥白粉菌的SSR分子標(biāo)記，效果比較理想。李新鳳等[24]開(kāi)發(fā)尖鐮孢菌EST-SSR分子標(biāo)記，并在近緣鐮孢菌種中進(jìn)行通用性檢測(cè)，結(jié)果表明基于尖鐮孢EST序列開(kāi)發(fā)鐮孢菌通用SSR標(biāo)記是可行的。

本研究利用A.alternataEST數(shù)據(jù)庫(kù)，開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)13對(duì)SSR引物中，通用性檢測(cè)表明共有9對(duì)引物能夠在A.tenuissima種內(nèi)有效擴(kuò)增，而具有多態(tài)性引物就有5對(duì)，這表明在不同A.tenuissima菌株間存在著遺傳分化，同時(shí)也說(shuō)明基于A.alternata開(kāi)發(fā)的EST-SSR引物，完全適用于研究A.tenuissima的遺傳多樣性。因此A.alternataEST-SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，為該菌近緣種A.tenuissima的鑒別、遺傳變異等研究提供重要的標(biāo)記資源，為進(jìn)一步研究A.tenuissima的群體遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、分子流行學(xué)打下堅(jiān)實(shí) 基礎(chǔ)。