李溢真, 于志洋, 田 欣, 宋 琳, 3

海蒿子多糖的結(jié)構(gòu)組分及生物活性研究

李溢真1, 于志洋1, 田 欣2, 宋 琳2, 3

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 山東 青島 266109; 2. 青島科技大學(xué) 海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院, 山東 青島 266071; 3. 無(wú)窮食品有限公司, 廣東 饒平 515726)

采用水提醇沉法制備海蒿子多糖, 利用紅外光譜法(FT-IR)和PMP柱前衍生化法研究海蒿子多糖的理化特性及糖元組成, 并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和ELISA法, 研究免疫相關(guān)因子和細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的mRNA表達(dá)。結(jié)果表明, 海蒿子多糖總糖含量為24.32%, 硫酸根含量為5.39%, 具有α糖苷鍵。單糖分析表明, 海蒿子多糖主要由半乳糖、巖藻糖、甘露糖組成。進(jìn)一步體外免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 海蒿子多糖具有促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖的作用, 能夠提高巨噬細(xì)胞系免疫因子IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-α的mRNA表達(dá)量。此外, 海蒿子多糖還能抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖, 提高Bax/Bcl-2的比例, 說(shuō)明其具有抑制腫瘤的效果。ELISA分析表明, 海蒿子粗多糖能顯著提高RAW264.7分泌NO、IL-1β、TNF-α和IL-6細(xì)胞因子。因此, 海蒿子多糖不僅具有免疫增強(qiáng)活性, 還具有一定的抗腫瘤活性。

海蒿子; 多糖; 理化性質(zhì); 免疫活性

海蒿子()屬于褐藻門(mén)(Rhaeo-phyta), 馬尾藻科(Sargassaceae), 馬尾藻屬(),生長(zhǎng)于潮間帶的石沼中和大干潮線下1~4米深處的巖石上, 為多年生海藻[1]。

《中藥大辭典》記載, 海蒿子性苦、咸、寒, 入肺、脾、腎經(jīng), 具有軟堅(jiān)、消痰、利水、瀉熱之功效, 可用于治療瘰癘、癭瘤、積聚、水腫、腳氣和睪丸腫痛等病癥[2]。方飛等[3]證實(shí)海蒿子多糖對(duì)-OH清除率為26%, 對(duì)O2–的清除率為80%, 對(duì)過(guò)氧化脂的抑制率為40%, 具有明顯的抗氧化作用。張華峰等[4]研究表明, 海蒿子活性多糖能明顯降低高血脂小鼠血清中總膽固醇、甘油三酯的含量。劉斌[5]用不同的提取溫度和不同濃度的乙醇醇沉可以獲得性質(zhì)不同的褐藻糖膠; 通過(guò)離子交換和凝膠柱層析技術(shù)分離獲得電荷、分子量均單一的褐藻糖膠組分, 并通過(guò)MTT法發(fā)現(xiàn)多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞A549, P388具有一定的生長(zhǎng)抑制作用。郭利民[6]以小鼠乳腺癌tsFT210細(xì)胞、小鼠白血病P389細(xì)胞和人白血病K562細(xì)胞為材料, 采用流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)等方法, 對(duì)分離得到的14個(gè)化合物進(jìn)行抗腫瘤活性的初步評(píng)價(jià), 發(fā)現(xiàn)海蒿子具有一定抗腫瘤作用。Cao等[7]研究微波輔助水相兩相萃取用于同時(shí)提取和分離海蒿子多糖, 表現(xiàn)出較好的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性, 并且可以顯著改善胰島素抗性模型細(xì)胞中的葡萄糖消耗。然而, 關(guān)于水提醇沉法獲得海蒿子多糖的免疫活性和抗腫瘤活性的機(jī)理報(bào)道甚少。本文就海蒿子粗多糖的結(jié)構(gòu)組分、免疫活性和抗腫瘤活性進(jìn)行研究, 并探討其免疫活性和抗腫瘤活性的機(jī)理, 為進(jìn)一步探究海蒿子粗多糖的生物活性提供一定理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海蒿子保存于中國(guó)科學(xué)院海洋研究所, 肺癌細(xì)胞A549、小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7來(lái)自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所。

氯仿、苯酚、濃硫酸、氯化鋇(分析純, 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司), 甘露糖、葡萄醛酸、鼠李糖、半乳糖、木糖、核糖標(biāo)準(zhǔn)品, 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、硫酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma 公司)、1-苯基-3甲基-5吡唑啉酮(PMP)、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、磷酸緩沖液、二甲基亞砜(北京索萊寶科技有限公司), Gibco胎牛血清(ThermoFisher scientific公司), 甲醇, 乙腈(色譜純, 德國(guó)Merck公司), CCK-8試劑盒(尚寶生物科技有限公司), 明膠(天津市北辰方正試劑廠), 一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所), 鼠源IL-1β、TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒(上海朗頓科技有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

3 500 Da透析袋(北京索萊寶科技有限公司), 萬(wàn)能粉碎機(jī)(FW100, 天津市泰斯特儀器有限公司), 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-5205, 上海亞榮儀器有限公司), 多管架平衡離心機(jī)(TDZ5-WS, 湘儀離心機(jī)儀器有限公司), 冷凍干燥機(jī)(SCIENTZ-18N, 寧波新芝生物科技有限公司), 電熱恒溫水浴鍋(HH-2, 國(guó)華電器有限公司), 傅里葉變換紅外光譜儀(Thermo scientific Nicolet-360, 美國(guó)Thermo公司), 酶標(biāo)儀(iMarkTM BIO-RAD, 美國(guó)BIO-RAD公司), 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Forma 3110, 美國(guó)Thermo公司), 高效液相色譜儀(Shimadzu-20A, 日本島津公司)。

1.3 海蒿子多糖的制備

跟據(jù)李俊卿等[8]的方法, 稍作改動(dòng)。取適量海蒿子進(jìn)行粉碎, 經(jīng)過(guò)100目篩, 收集待用。量取4 200 mL蒸餾水, 加熱, 保持水溫在90℃左右, 稱量海蒿子粉末200 g, 倒入蒸餾水中, 浸提5 h。將浸提后的混合物離心(2 000 r/min, 15 min), 棄沉淀, 取上清液, 濃縮到原體積的1/3左右, 經(jīng)截留分子量為3 500 kDa的透析袋進(jìn)行透析除去小分子物質(zhì), 時(shí)間為3天。然后濃縮, 醇沉(按照無(wú)水乙醇︰多糖溶液體積比 3︰1),4 ℃過(guò)夜。次日, 進(jìn)行離心(4 000 r/min, 20 min), 棄上清, 收集沉淀, 冷凍干燥并收集多糖(SPPS)。

1.4 海蒿子多糖的化學(xué)成分測(cè)定

1.4.1 總糖含量

總糖含量采用苯酚-硫酸法[9]測(cè)定, 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后配制0.1%海蒿子多糖溶液, 取100 μL于比色管中, 加入蒸餾水至終體積為1 mL。依次加入1 mL 5%苯酚溶液, 5 mL濃硫酸, 靜置30 min后, 測(cè)定485 nm處的吸光度。重復(fù)三次, 取吸光度平均值, 帶入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線, 測(cè)得海蒿子總糖含量。

1.4.2 硫酸根離子含量

以100~110℃烘烤至充分干燥的K2SO4為標(biāo)準(zhǔn)品, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 根據(jù)Bah-ramzadeh[10]的方法, 海蒿子多糖酸水解后, 加氨水中和至pH 6~7。脫色并過(guò)濾, 定容至25 mL。然后再取被測(cè)樣品100 μL, 加入蒸餾水至200 μL, 然后依次加入0.2 mol/L HCl 3.8 mL, 明膠BaCl2溶液1 mL, 30 min后在500 nm處比濁。最后計(jì)算SO42–的濃度。

1.5 單糖組成

根據(jù)宋琳[11]的方法, 稱取10 mg海蒿子多糖于安瓿瓶中, 加入1 mL水, 1 mL 4 mol/L的三氟乙酸(TFA), 于105~110 ℃水解2~6 h。樣品用NaOH中和至pH 5~6, 并定容至10 mL, 取0.2 mL樣品, 加入0.2 mL核糖作為內(nèi)標(biāo)。從中取0.1 mL加入0.12 mL 0.5 mol/L PMP溶液和0.1 mL 0.3 mol/L NaOH溶液, 混勻, 70℃反應(yīng)60 min。放至室溫后, 加0.1 mL 0.3 mol/L HCl, 中和混勻, 加0.5 mL氯仿萃取, 離心(7 000 r/min, 5 min), 棄去有機(jī)層, 重復(fù)3次。吸取上清0.1 mL進(jìn)行HPLC檢測(cè)。色譜柱YMC-Pack ODS-AQ(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 柱溫25℃, 流速 1.0 mL/min, 檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm, 流動(dòng)相A︰0.4%三乙胺水溶液︰乙腈=9︰1。流動(dòng)相B︰0.4%三乙胺水溶液︰乙腈=4︰6。

1.6 FT-IR分析

采用Seedevi[12]的方法, 稱取2 mg左右的海蒿子多糖, KBr壓片, 在紅外光譜波數(shù)范圍4 000~400 cm–1下掃描樣品。

1.7 海蒿子多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7的增殖作用

根據(jù)Nie等[13]的實(shí)驗(yàn)方法, 稍加修改。將RAW 264.7細(xì)胞以1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種在96孔板中, 并用不同濃度(25, 50, 100, 200, 400 μg/mL)的海蒿子多糖處理, 空白對(duì)照則加入等體積的培養(yǎng)基, 在37℃和5% CO2下培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清, 向每個(gè)孔中加入混有20 μL CCK-8溶液的完全培養(yǎng)基, 并繼續(xù)孵育4小時(shí), 在450 nm下測(cè)量吸光度以評(píng)估細(xì)胞活力。細(xì)胞相對(duì)存活率計(jì)算公式為:

細(xì)胞相對(duì)存活率 = (A450實(shí)驗(yàn)組/A450對(duì)照組)×100%。

1.8 海蒿子粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞免疫因子mRNA的表達(dá)量的影響

根據(jù)王昭晶[14]的方法, 并稍作改變。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組, 待細(xì)胞培養(yǎng)48 h后, 利用試劑盒提取總RNA, 反轉(zhuǎn)錄生成cDNA后, 選擇基因IL-1β, IL-6, iNOS及TNF-β, 進(jìn)行Q-PCR分析, 根據(jù)公式2–ΔΔCT計(jì)算免疫相關(guān)因子的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)中使用的引物和作為內(nèi)源參照的β-actin基因序列如下:

β-actin: 5′-GCAGAAGGAGATCACTGCCCT-3′和5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′;

IL-1β: 5′-GGGATGATGATGATAACCTG-3′和5′-TTGTCGTTGCTTGGTTCTCCT-3′;

IL-6: 5′-CATGTTCTCTGGGAAATCGTGG-3′和5′-AACGCAACTAGGTTTGCCGAGTA-3′;

iNOS: 5′-GGTCTTCCTGGGCTCGATCTG-3′和5′-GCCGTGGCCAACATGCTACT-3′;

TNF-α: 5′-GATCTCAAAGCAAACCAACTAGTG-3′和5′-CTCCAGCTGGAAGACTCCCAG-3′。

1.9 海蒿子多糖對(duì)A549的抑制作用

采用Wang等[15]的實(shí)驗(yàn)方法, 利用CCK-8檢測(cè)海蒿子多糖對(duì)A549的抑制作用。將A549細(xì)胞以2×104個(gè)/mL接種在96孔板中, 每孔100 μL。同時(shí)用不同濃度(0, 25, 50, 100, 200, 400 μg/mL)的海蒿子多糖處理, 空白對(duì)照組則加入等體積培養(yǎng)基, 并將細(xì)胞在37℃和5%CO2下孵育48小時(shí), 棄上清, 每孔中加入混有20 μL CCK-8溶液的完全培養(yǎng)基, 孵育4小時(shí)。最后, 在450 nm下測(cè)量吸光度以評(píng)估細(xì)胞活力。

1.10 腫瘤凋亡相關(guān)基因的表達(dá)

根據(jù)Wang等[16]的方法, 并稍作修改。選擇基因Bcl-2和Bax用于研究細(xì)胞A549細(xì)胞的凋亡。待細(xì)胞培養(yǎng)48 h后, 使用總RNA提取試劑盒從A549細(xì)胞中提取總RNA, 然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA, 設(shè)計(jì)引物按照SYBR qPCR master Mix 試劑盒上的說(shuō)明進(jìn)行熒光定量PCR分析。反應(yīng)中使用的引物和作為內(nèi)源參照的β-actin基因序列如下:

β-actin: 5′-GCAGAAGGAGATCACTGCCCT-3′和5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′;

Bax: 5′-GACCCGGTGCCTCAGGATGC-3′和5′-GTCTGTGTCCACGGCGGCAA-3′;

Bcl-2: 5′-ATCCAGGATAACGGAGGC-3′和5′-CAGCCAGGAGAAATCAAAC-3′。

1.11 海蒿子多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌細(xì)胞因子的影響

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的巨噬細(xì)胞RAW264.7 (1×105個(gè)/mL)接種于12孔板中, 24?h后棄去培養(yǎng)基, 用PBS沖洗巨噬細(xì)胞。然后, 加入含有不同濃度(25, 100, 400?μg/ mL)多糖的1?mL完全培養(yǎng)基。空白對(duì)照為不加多糖的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24?h后, 收集上清液, 用ELISA試劑盒測(cè)定上清液中NO、IL-1β、TNF-α和IL-6的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)成分及單糖組成分析

通過(guò)表1可以看出, 海蒿子多糖中總糖含量為24.32%, 硫酸根含量為5.39%。由單糖組成結(jié)果可知海蒿子多糖主要由半乳糖、巖藻糖、甘露糖組成。

表1 海蒿子多糖的化學(xué)組成及單糖摩爾比

注: Man: 甘露糖; Rha: 鼠李糖; Gal: 半乳糖; GlcA: 葡萄糖醛酸; Glc: 葡萄糖; xyl: 木糖; Fuc: 巖藻糖; Nd: 未檢出

2.2 紅外光譜(FT-IR)分析

如圖1所示, 4 000~400 cm–1處的幾個(gè)吸收峰是多糖的典型特征峰。在3 498.24 cm–1處的峰吸收帶和在2 932.27 cm–1處的弱吸收峰分別是O–H和C–H的拉伸特征峰。在1 614.57 cm–1和1 418.32 cm–1處的兩個(gè)特征吸收峰表示C=O的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)和對(duì)稱伸縮振動(dòng), 表明海蒿子多糖中存在羧基。1 255.73 cm–1處的吸收峰為S=O對(duì)稱伸縮振動(dòng)。1 039.92 cm–1的吸收峰歸因于C–O–H變形振動(dòng)[17]。831.17 cm–1處的吸收峰說(shuō)明海蒿子多糖具有α糖苷鍵。

2.3 海蒿子多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7相對(duì)存活率的影響

利用CCK-8試劑盒檢測(cè)不同濃度海蒿子多糖對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖的影響。如圖2所示, 海蒿子多糖在25~400 μg/mL濃度范圍內(nèi)均表現(xiàn)出增殖效果, 與對(duì)照組相比, 增殖效果顯著。在濃度為25 μg/mL時(shí), RAW264.7的增殖率較低, 相對(duì)存活率為109.82%, 增殖率隨著濃度的增加而增加, 但增加程度并不明顯。在400 μg/ mL時(shí), 增殖率達(dá)到最大, 細(xì)胞相對(duì)存活率為157.57%, 呈劑量依賴關(guān)系。

圖1 海蒿子多糖的紅外圖譜

2.4 海蒿子多糖對(duì)免疫因子mRNA相對(duì)表達(dá)的影響

為了研究海蒿子多糖的免疫增強(qiáng)作用, 使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了不同濃度海蒿子多糖對(duì)iNOS, IL-6和IL-1β和TNF-β的mRNA表達(dá)的影響。圖3a、b中的結(jié)果顯示與對(duì)照組相比, IL-1β與IL-6的mRNA表達(dá)量均顯著增加, 并呈現(xiàn)劑量依賴性。400 μg/mL海蒿子多糖處理后IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)分別是對(duì)照組的20.68倍和2.69倍。同樣, 圖3c、d中與對(duì)照組相比iNOS、TNF-α的mRNA表達(dá)也顯著增加, 呈劑量相關(guān)關(guān)系, 多糖濃度在100 μg/mL時(shí), iNOS、TNF-α的mRNA的表達(dá)量是分別對(duì)照組的3.16倍和2.36倍。在濃度200?μg/mL、400 μg/mL時(shí)出現(xiàn)mRNA表達(dá)量下降的現(xiàn)象, 但是與空白組相比, 依然能促進(jìn)iNOS、TNF-α的mRNA表達(dá)量增加。以上結(jié)果表明, 海蒿子多糖能夠促進(jìn)免疫相關(guān)細(xì)胞因子mRNA的顯著表達(dá), 海蒿子多糖具有免疫增強(qiáng)活性。

圖2 SPPS對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的相對(duì)存活率的影響

圖3 不同濃度SPPS對(duì)IL-1β (a)、IL-6 (b)、iNOS (c)和TNF-α (d) mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

2.5 海蒿子多糖對(duì)A549的抑制作用

為了研究海蒿子多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞A549的抑制作用, 用不同濃度的海蒿子多糖處理A549, 從圖4中可以看出, 海蒿子多糖的濃度在25~400 μg/mL范圍內(nèi), 抑制率呈先上升后先下降的趨勢(shì)。100 μg/mL時(shí), 海蒿子多糖對(duì)A549抑制率達(dá)到40.38%。在濃度200?μg/mL時(shí)出現(xiàn)了抑制率首次下降的現(xiàn)象, 但是與空白組相比, 依然能抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖。表明海蒿子粗多糖具有一定的抗腫瘤的效果。

圖4 SPPS對(duì)A549細(xì)胞的抑制率的影響

2.6 海蒿子多糖對(duì)凋亡相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)海蒿子多糖對(duì)A549細(xì)胞中Bax, Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平的影響。如圖5所示, 海蒿子多糖濃度為25 μg/mL時(shí), Bax/Bcl-2相對(duì)mRNA表達(dá)量的比值為1.05。海蒿子多糖濃度為100 μg/mL時(shí), Bax/Bcl-2相對(duì)mRNA表達(dá)量的比值為2.10。海蒿子多糖濃度為400 μg/mL時(shí), Bax/Bcl-2相對(duì)mRNA表達(dá)量的比值為1.91。海蒿子多糖通過(guò)提高Bax/Bcl-2相對(duì)mRNA表達(dá)量的比例抑制A549細(xì)胞的增殖, 且與CCK-8檢測(cè)的結(jié)果一致。

圖5 SPPS對(duì)Bcl-2(a)、Bax(b) mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

2.7 免疫相關(guān)因子的ELISA分析

本實(shí)驗(yàn)利用ELISA檢測(cè)海蒿子多糖對(duì)RAW264.7產(chǎn)生NO含量的影響, 從圖6中可以看出, 不同濃度的海蒿子多糖刺激RAW264.7產(chǎn)生的NO量不同, 隨著糖濃度的升高, NO的含量也呈遞增趨勢(shì)。在400 μg/mL時(shí), RAW264.7產(chǎn)生的NO含量最高為55.46 μmoL/mL, 且顯著高于對(duì)照組。說(shuō)明海蒿子粗多糖能顯著刺激NO的分泌, 調(diào)節(jié)RAW264.7的免疫活性。

為了研究SPPS的免疫增強(qiáng)作用, 利用ELISA檢測(cè)了不同濃度海蒿子多糖對(duì)RAW264.7分泌IL-1β(a)、TNF-α(b)和IL-6(c)的含量的影響。圖7a、b、c中的結(jié)果顯示與對(duì)照組相比, 添加SPPS后IL-1β、TNF-α與IL-6的濃度均顯著增加, 并呈現(xiàn)劑量依賴性。400 μg/mL SPPS處理后IL-1β、TNF-α和IL-6的含量分別達(dá)到87.09 ng/L、1 063.15 ng/L和134.71 ng/L。結(jié)果表明, 海蒿子多糖具有免疫增強(qiáng)活性。

圖6 SPPS對(duì)RAW264.7分泌NO的影響

3 討論

本研究通過(guò)傳統(tǒng)的水提醇沉法來(lái)制備海蒿子多糖, 通過(guò)化學(xué)成分分析和單糖組成分析發(fā)現(xiàn)海蒿子多糖含有一定量的硫酸基。Bahramzadeh等[17]研究發(fā)現(xiàn), 來(lái)自馬尾藻的褐藻糖膠對(duì)巨噬細(xì)胞的活化能力與硫酸基團(tuán)有密切的關(guān)系。由此推測(cè), 海蒿子多糖的免疫增強(qiáng)活性與其硫酸基有關(guān)。單糖組成分析結(jié)果表明, 海蒿子多糖中主要為半乳糖, 巖藻糖和甘露糖。先前的研究[18-19]已經(jīng)證明多糖的生物活性取決于能否有效的與免疫細(xì)胞表面受體的結(jié)合, 而含有甘露糖的多糖最有可能被免疫細(xì)胞表面受體識(shí)別, 引發(fā)免疫反應(yīng)。根據(jù)紅外光譜分析結(jié)果, 海蒿子多糖中存在硫酸鹽基團(tuán)[20]、α糖苷鍵。糖結(jié)構(gòu)的特征是吡喃糖結(jié)構(gòu), 同時(shí)α糖苷鍵與半乳糖4-硫酸鹽相匹配[21],這與單糖組成分析一致。劉瑋等[22]研究發(fā)現(xiàn)具有α-糖苷鍵的姬松茸多糖具有抗炎癥的效果。由此推測(cè), 海蒿子多糖的免疫活性與其含有的硫酸基團(tuán)以及α糖苷鍵有關(guān)。本研究證明, 海蒿子粗多糖具有一定的免疫增強(qiáng)活性效果。

巨噬細(xì)胞與中性粒細(xì)胞一起, 構(gòu)成了宿主防御的第一道防線[23]。其中, 巨噬細(xì)胞釋放各種炎癥物質(zhì)和細(xì)胞免疫因子, 如NO, IL-1β, TNF-α和IL-6等, 都是宿主免疫過(guò)程中抵抗外來(lái)和內(nèi)部微生物、病原體和細(xì)胞所必需的[24]。iNOS是NF-κB誘導(dǎo)的關(guān)鍵產(chǎn)物[25], 已有研究表明多糖激活巨噬細(xì)胞, Toll樣受體(Toll-like receptors, TRL)接受信號(hào), 激活NF-κB中的轉(zhuǎn)錄因子, 從而使細(xì)胞產(chǎn)生一系列的免疫反應(yīng)[26]。NO是免疫和炎癥調(diào)節(jié)的中介物, 可以殺死或抑制許多微生物的生長(zhǎng); NO的合成是巨噬細(xì)胞非特異性免疫的重要機(jī)制, 參與各種生理和病理過(guò)程[27]。IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α等發(fā)揮機(jī)體的免疫功能, 巨噬細(xì)胞在先天性免疫中發(fā)揮著重要的作用[28]。海蒿子多糖刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7, 促進(jìn)其增殖, 并顯著提高了免疫相關(guān)因子IL-1β, IL-6, iNOS和TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量。刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放NO和分泌細(xì)胞因子等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明海蒿子多糖具有較好的免疫增強(qiáng)活性, 在提高機(jī)體免疫功能上具有一定研究?jī)r(jià)值。

圖7 SPPS對(duì)RAW264.7分泌IL-1β(a)、TNF-α(b)和IL-6(c)的影響

Bcl-2蛋白家族通過(guò)凋亡與抗凋亡蛋白之間的相互作用與線粒體凋亡途徑密切相關(guān)。Bcl-2位于線粒體外膜上發(fā)揮重要作用并防止細(xì)胞凋亡。Bax是位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的促細(xì)胞凋亡因子, 當(dāng)被凋亡信號(hào)刺激時(shí), 它在線粒體上被激活, 破壞線粒體膜的完整性并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[29]。細(xì)胞凋亡激活后Bcl-2與Bax的比例決定了細(xì)胞的存活或死亡, Bax表達(dá)占優(yōu)勢(shì)時(shí)細(xì)胞死亡, Bcl-2 表達(dá)占優(yōu)勢(shì)時(shí)細(xì)胞存活[30]。本研究發(fā)現(xiàn)海蒿子多糖可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖, 并提高Bax/Bcl-2的比例, 表明海蒿子多糖可以通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡達(dá)到抗腫瘤的效果, 在抗腫瘤方面具有一定的活性。

本研究通過(guò)海蒿子多糖的結(jié)構(gòu)組分分析, 揭示了其單糖組成和糖苷鍵組成; 以及通過(guò)海蒿子多糖對(duì)RAW264.7的影響, 表明海蒿子多糖不僅能刺激巨噬細(xì)胞, 使TNF-α, iNOS, IL-6和IL-1β的mRNA表達(dá)增強(qiáng), 刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放NO和分泌細(xì)胞因子等。起到良好的免疫增強(qiáng)作用; 還能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖, 具有一定的抗腫瘤效果。

[1] Xiao H, Chen C, Li C, et al. Physicochemical characterization, antioxidant and hypoglycemic activities of selenized polysaccharides from[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2019, 32: 308-315.

[2] 趙宇, 張立新, 李志富, 等. 中藥海蒿子多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2005(2): 247-250. Zhao Yu, Zhang Lixin, Li Zhifu, et al. Isolation, purify-ca--tion and structure study of polysaccharides from Chinese medicine[J]. Journal of Shandong Agricultural University (Natural Science Edition), 2005(2): 247-250.

[3] 方飛, 唐志紅. 海蒿子多糖的抗氧化活性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(16): 9590-9591. Fang Fei, Tang Zhihong. Study on antioxidant activity ofpolysaccharide[J]. Anhui Agricultural Sciences, 2011, 39(16): 9590-9591.

[4] 張華鋒, 高征, 羅亞飛, 等. 海蒿子活性多糖降血脂作用的研究[J]. 中成藥, 2009, 31(12): 1925-1927. Zhang Huafeng, Gao Zheng, Luo Yafei, et al. Study on the hypolipidemic effect of active polysaccharides of[J]. Traditional Chinese Medicine, 2009, 31(12): 1925-1927.

[5] 劉斌. 中藥海藻海蒿子多糖的分離與鑒定及其抗腫瘤活性初步研究[D]. 青島: 中國(guó)海洋大學(xué), 2005. Liu Bin. Isolation and identification of polysaccharides from the Chinese herb seaweedand preliminary study on its anti-tumor activity[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2005.

[6] 郭立民. 中藥海藻海蒿子的抗腫瘤活性成分研究[D]. 青島: 中國(guó)海洋大學(xué), 2006. Guo Limin. Research on anti-tumor active ingredients of[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2006.

[7] Cao C, Huang Q, Zhang B, et al. Physicochemical cha-racterization andhypoglycemic activities of poly-saccharides fromby microwave-assisted aqueous two-phase extraction[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2018, 109: 357- 368.

[8] 李俊卿, 趙宇, 李志萍, 等. 海蒿子多糖DEI、DEII組分分離純化、結(jié)構(gòu)及抗癌活性研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā), 2005(5): 35-38. Li Junqing, Zhao Yu, Li Zhiping, et al. Separation, purification, structure and anticancer activity of thepolysaccharide DEI and DEII[J]. Natural Product Research and Development, 2005(5): 35-38.

[9] Dubois M, Gilles K, Hamilton J K, et al. Colorime-tric method for the determination of sugars and related subs-tances[J]. Analytical Chemistry, 1956, 28: 350-356.

[10] Bahramzadeh S, Tabarsa M, You S, et al. Purification, structural analysis and mechanism of murine macropha-ge cell activation by sulfated polysaccharides from[J]. Carbohydrate Polymers, 2019, 205: 261-270.

[11] 宋琳. 幾種大型海藻硫酸多糖免疫相關(guān)活性及轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究[D]. 青島: 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院海洋研究所), 2016.Song Lin. Immunomodulatory-related activity and RNA- Seq research of six macroalgaes’ sulfated polysaccharides[D]. Qingdao: University of Chinese Academy of Sciences (Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences), 2016.

[12] Palaniappan S, Meivelu M, Sadhasivam S. Isolation and chemical characteristics of rhamnose enriched polysaccharide from[J]. Carbohydrate Polymers, 2018, 195: 261-270.

[13] Nie C, Zhu P, Ma S, et al. Purification, characterization and immunomodulatory activity of polysaccharides from stem lettuce[J]. Carbohydrate Polymers, 2018, 188: 236-242.

[14] 王昭晶, 羅巔輝, 聶開(kāi)穎. 網(wǎng)格狀與線狀鼠尾藻多糖抗炎作用研究[J]. 中國(guó)海洋藥物, 2019, 38(2): 17-23. Wang Zhaojing, Luo Dianhui, Nie Kaiying. Study on the anti-inflammatory effects of the polysaccharides ofandlinear[J] .Marine Medicines of China, 2019, 38(2): 17-23.

[15] Wang C, Zhu J, Ma J, et al. Functionalizedstriata polysaccharide micelles for targeted intracellular delivery of Doxorubicin:andevaluation[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2019, 567: 118- 436.

[16] Wang Y, Wang S, Song R. Ginger polysaccharides induced cell cycle arrest and apoptosis in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2019, 123: 81-90.

[17] Saman B, Mehdi T, Sangguan Y, et al. Purification, struc-tural analysis and mechanism of murine macrophage cell activation by sulfated polysaccharides from[J]. Carbohydrate Polymers, 2018, 205: 261-270.

[18] Souza B W S, Cerqueira M A, Bourbon A I, et al. Che-mical characterization and antioxidant activity of sulfa-tedpolysaccharide from the red seaweed[J]. Food Hydrocolloids, 2012, 27: 287-292.

[19] Meng Q, Wang Y, Chen F, et al. Polysaccharides from: Extraction optimization, antitumor, and immune-enhancement effects[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2018, 115: 835-845.

[20] Li C, Li X, You L, et al. Fractionation, preliminary structural characterization and bioactivities of polysaccharides from[J]. Carbohydrate Polymers, 2017, 155: 261-270.

[21] Wongpraserta K, Rudtanatipa T, Praiboonb J. Immuno-s-timulatory activity of sulfated galactans isolated from the red seaweedand development of resistance againstwhite spot syndrome virus (WSSV) in shri-mp[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2014, 36: 52-60.

[22] Chen C, You L J, Abbasi A M, et al. Optimization for ultrasound extraction of polysaccharides from mulberry fruits with antioxidant and hyperglycemic activity in vitro[J]. Carbohydrate Polymers, 2015, 130: 122-132.

[23] Jackaman C, Tomay F, Duong L, et al. Aging and cancer: The role of macrophages and neutrophils[J]. Ageing Research Reviews, 2017, 36: 105-116.

[24] Yan J, Han Z, Qu Y, et al. Structure elucidation and immunomodulatory activity of a β-glucan derived from the fruitingbodies of[J]. Food Che-mistry, 2018, 240: 534-543.

[25] Wang L, Li Y, Zhu L, et al. Antitumoractivities and im-munomodulatory of rice bran polysaccharides and its sulfates in vitro[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2016, 88: 424-432.

[26] Liu X, Wang X, Xu X, et al. Purification, antitumor and anti-inflammationactivities of an alkali-soluble and car-boxymethyl polysaccharide CMP33 from[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2019, 127: 39-47.

[27] Shu Y, Liu X, Ma X, et al. Immune response mechanism of mouse monocytes/macrophages treated with κ-carra-geenan polysaccharide[J]. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2017, 53: 191-198.

[28] Xie S, Hao R, Zha X, et al. Polysaccharide of Dendrobium huoshanense activates macrophages via toll- like receptor 4-mediated signaling pathways[J]. Carbo-hydrate Polymer, 2016, 146: 292-300.

[29] Chen P, Liu H P, Ji H H. A cold-water soluble polysaccharideisolated frominduces the apoptosis of HepG2 cells through mitochondrial passway[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2019, 125: 1232-1241.

[30] 陳玉燕, 李紅玲, 趙龍. 不同壓力高壓氧對(duì)腦出血大鼠Bcl-2/Bax比值的影響[J]. 中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志, 2019, 34(1): 16-21. Chen Yuyan, Li Hongling, Zhao Long. Effect of hyperbaric oxygen at different pressures on Bcl-2/Bax ratio in rats with cerebral hemorrhage[J]. Chinese Journal of Rehabilitation Medicine, 2019, 34(1): 16-21.

Physicochemical properties and immunomodulatory activities of crude polysaccharides isolated from

LI Yi-zhen1, YU Zhi-yang1, TIAN Xin2, SONG Lin2, 3

(1. College of Life Sciences, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 2. College of Marine Science and Biological Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266071, China; 3. Wuqiong food Co., Ltd, Raoping 515726, China)

polysaccharides (SPPS), a group of natural polysaccharides, were isolated fromthrough water extraction and alcohol precipitation. Infrared spectroscopy (FT-IR) and 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP) pre-column derivatization were employed to study the physical and chemical properties, as well as the monosaccharide composition of SPPS. Quantitative real-time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) techniques were employed to study the mRNA expression of immune-related and apoptosis-related factors. The total sugar content of SPPS was 24.32%, while the sulfate content was 5.39%. The FT-IR spectra analysis indicated that SPPS contain sulfuric acid groups and has α-glycosidic bonds. In regard to the monosaccharide composition, the most abundant components in SPPS were galactose, fucose, and mannose. Bioassays indicated that SPPS significantly enhance the proliferation of RAW264.7 macrophage cells and also stimulate the corresponding mRNA expression of iNOS and interleukins (IL-6, IL-1β, and TNF-α) in a dose-dependent manner. In addition, SPPS effectively suppressed the proliferation of A549 cells and increase the ratio of Bax/Bcl-2, indicating its anti-proliferative activity against A549 cells. The ELISA analysis revealed that the crude SPPS significantly increased the production of NO, IL-1β, TNF-α, and IL-6 cytokines in RAW264.7 cells. These results indicate that SPPS demonstrated both immunomodulatory and anti-tumor activities.

; polysaccharides; physicochemical properties; immunomodulatory activity

Apr. 18, 2020

R932

A

1000-3096(2020)11-0010-09

10.11759/hykx20200418002

2020-04-18;

2020-04-29

山東省自然基金(ZR201702170401); 青島科技大學(xué)2019年創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201910426018)

[Natural Foundation of Shandong Province, No. ZR201702170401; 2019 The Innovative Entrepreneurial Training Plan Program of Qingdao University of Science & Technology, No. 201910426018]

李溢真(1991-), 女, 漢族, 山東濟(jì)南人, 碩士研究生, 研究方向?yàn)楹Ｑ蠡钚晕镔|(zhì), E-mail: lyzliyizhen@163.com; 宋琳(1987-),通信作者, 女, 漢族, 山東青島人, E-mail: lylinsong@hotmail.com

(本文編輯: 楊 悅)