昆蟲病原真菌鑒定方法研究進展

黃 姍 孔麗娜 閆金國 王大鵬

（濰坊護理職業(yè)學(xué)院，山東青州 262500）

昆蟲病原真菌是能侵入昆蟲體內(nèi)寄生，從而使昆蟲發(fā)病致死的一類真菌的統(tǒng)稱，也稱蟲生真菌。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，蟲生真菌能有效控制害蟲種群數(shù)量。據(jù)統(tǒng)計，60%的死亡昆蟲是由真菌流行病發(fā)生引起的[1]。昆蟲病原真菌種類多，寄主范圍廣，安全有效，不傷害天敵，不易產(chǎn)生抗性，在害蟲控制上具有獨特優(yōu)勢。早在20世紀(jì)80年代，昆蟲病原真菌的研究就得到了廣泛重視，而其種類的精確鑒定和系統(tǒng)發(fā)育進化關(guān)系的分析是研究的前提?；诖?，本文對昆蟲病原真菌主要的鑒定方法進行總結(jié)，從鑒定原理、應(yīng)用現(xiàn)狀及取得的成果等方面進行論述，以期為昆蟲病原真菌的系統(tǒng)發(fā)育進化關(guān)系分析、精確的分類鑒定及菌種資源開發(fā)提供理論指導(dǎo)。

1 昆蟲病原真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

真菌的形態(tài)學(xué)鑒定是指依據(jù)真菌的形態(tài)特征和生理生化等特性進行分類的一種鑒定方法。昆蟲病原真菌的形態(tài)特征主要包括菌落特征和顯微特征兩個方面，形態(tài)學(xué)鑒定一般先通過菌落特征初步對真菌進行分類，再通過顯微鏡觀察真菌孢子的形態(tài)，進一步確定真菌的種屬。近年來，自動成像分析、電子顆粒體積、分?jǐn)?shù)幾何學(xué)分析等現(xiàn)代形態(tài)學(xué)技術(shù)的發(fā)展明顯提高了真菌形態(tài)學(xué)鑒定的準(zhǔn)確率。但由于描述真菌表型的各種詞語具有很大的主觀性，沒有統(tǒng)一特定的標(biāo)準(zhǔn)，加之真菌種類繁多、形態(tài)特征復(fù)雜，某些表型特征不穩(wěn)定，易受環(huán)境影響，形態(tài)學(xué)鑒定具有很大的局限性。

2 昆蟲病原真菌的分子生物學(xué)鑒定

2.1 基于PCR的核酸序列分析 PCR技術(shù)的出現(xiàn)使真菌鑒定有了新的突破。編碼核糖體rDNA分子的基因序列因其結(jié)構(gòu)上的高度保守性和基因間隔區(qū)（IGS）的多變性，被廣泛應(yīng)用于揭示生物進化發(fā)育關(guān)系。目前，在真菌鑒定中應(yīng)用最廣泛的核酸序列是核糖體rDNA的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS（位于28SrDNA的3′端與18SrDNA的5′端之間的序列稱為核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS，ITS1位于18SrDNA和5.8SrDNA之間，ITS2位于5.8SrDNA和28SrDNA之間）。在真菌的分類鑒定中，核糖體小亞基編碼基因18SrDNA和基因間隔區(qū)（ITS）序列是最常用的。以上序列分析可以鑒定到種、亞種、變種甚至菌株的水平[2]。相關(guān)學(xué)者分析了20個種的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITSl和ITS2序列，發(fā)現(xiàn)這兩個序列僅在種間存在差異，種內(nèi)是完全一致的[3]。邱君志等的研究發(fā)現(xiàn)16株座殼孢核糖體大亞基LSUrDNA序列的分子聚類結(jié)果與其形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，這表明核糖體大亞基LSUrDNA序列可用于本屬種和種以下分類單元的鑒定[4]。目前，國內(nèi)外一般利用PCR擴增病原菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS進行病原菌的鑒定、檢測及病害診斷。此方法具有快速、準(zhǔn)確、簡便等優(yōu)點，深受微生物學(xué)家的重視，為昆蟲病原真菌的分子生物學(xué)研究奠定了重要基礎(chǔ)。

目前，ITS序列提供的遺傳信息有限，有時并不能有效區(qū)分關(guān)鍵進化節(jié)點。近年來，逐漸廣泛應(yīng)用的多基因序列聯(lián)合分析技術(shù)極大地提高了微生物系統(tǒng)進化分析及種類鑒定的準(zhǔn)確性。Kepler等基于ITS、GAPDH、CAL、ACT、CHS多基因聯(lián)合分析，對膠孢炭疽菌復(fù)合體Colletotrichum gloeospori-oides complex進行了系統(tǒng)進化分析[5]。重慶大學(xué)王萌等采用管家基因ef1-α、rpb1、rpb2、β-tubulin聯(lián)合對10株綠僵菌菌株的分類地位進行了系統(tǒng)進化分析。研究結(jié)果表明，通過單基因及多基因聯(lián)合序列分析能更準(zhǔn)確地對供試菌株進行分類鑒定[6]。

2.2 基于限制性內(nèi)切酶的限制性片段長度多態(tài)性分析 限制性片段長度多態(tài)性RFLP是利用限制性內(nèi)切酶對不同的基因組進行酶切得到長短、種類、數(shù)目不同的限制性片段對真菌進行鑒定的方法。RFLP技術(shù)不僅適用于昆蟲病原真菌群體水平的研究，還適用于系統(tǒng)發(fā)育進化分析方面的研究。但RFLP技術(shù)依然存在缺陷性，這是因為限制性酶切圖譜中特征性的條帶主要是基因組DNA中具有高度重復(fù)序列的酶解片段，如mtDNA和rDNA，但mtDNA或rDNA在生物進化演變過程中均是保守序列，產(chǎn)生的RFLP是有限的，并不能完全反映不同菌株之間存在的差異。

2.3 隨機擴增多態(tài)性DNA分析 隨機擴增多態(tài)性DNA分析是基于PCR的分析技術(shù)。擴增的產(chǎn)物通過凝膠電泳顯示DNA片段的數(shù)量和大小，可以反應(yīng)DNA片段的多態(tài)性，從而比較菌株之間存在的基因差異。此技術(shù)具有用量少、鑒定迅速等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于絲狀真菌的鑒定、分類研究，特別適用于遺傳背景不清的基因分析。

2.4 PFGE技術(shù) 脈沖電場凝膠電泳技術(shù)在真菌的分離鑒定中應(yīng)用廣泛。時連根等的研究發(fā)現(xiàn)，白僵菌的3種菌株6條染色體的大小在供試的3個菌株間存在差異，其核型在各菌株間存在多型性，3個菌株的染色體大小在2.5～7.2 Mbp，核型大小在26.5～29.0 Mbp[7]。

采用PFGE技術(shù)得到的核型圖譜為真菌分類提供了依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，金龜子綠僵菌、白僵菌屬和彎頸霉屬存在種的特異性和種內(nèi)核型多態(tài)性。核型多態(tài)性的研究將隨著脈沖電泳技術(shù)的進一步改進而得到更加廣泛深入的發(fā)展，更多的同源DNA探針也將應(yīng)用于染色體DNA進行分子雜交。

當(dāng)然，PFGE技術(shù)還存在一些問題，如不能有效分離分子量相近的染色體DNA，脈沖電泳中分離的每一條染色體帶不純，目的染色體上獲得的DNA片段易被污染，DNA降解造成的分型失敗等，這些問題都需進一步研究改進。

3 結(jié)語

綜上所述，昆蟲病原真菌的分類鑒定可采用多種方法，但每種方法都存在優(yōu)缺點，研究者應(yīng)該根據(jù)實際情況加以選擇，或?qū)⒍喾N方法相結(jié)合共同確定蟲生真菌的分類。