光激化學發(fā)光法在D-二聚體單克隆抗體篩選中的應用

侯寒進，蔣佳利，馮文卓，賈俊臻，劉 彥，馬 巍，董 媛

(吉林醫(yī)藥學院，吉林 吉林 132013)

血栓性疾病作為危害人類健康的重大疾病，高漏診率和致死率一直居高不下，因此對血栓疾病診斷的精確度也在不斷提高。D-二聚體是一種可靠的血栓疾病診斷病理性凝血標志物，正常人D-二聚體的水平低于0.5 mg/L[1]。在某些疾病導致的異常凝血狀態(tài)下，如肺栓塞、深靜脈血栓、彌散性血管內凝血等，D-二聚體濃度顯著增高[2]。因此D-二聚體的精確檢測對血栓類疾病的臨床診斷意義重大。

1 D-二聚體檢測方法

1.1 乳膠凝集法

乳膠凝集法自誕生以來，憑借其操作簡單和無需外界器材等優(yōu)勢，在抗體篩查、病毒檢測和細菌篩選等方面被廣泛應用[3-5]。正常情況下聚苯乙烯乳膠顆粒結合后牢固性差，易與特異性抗體剝離脫落，對實驗結果的準確性造成影響。在乳膠凝集法中，調節(jié)pH后使膠體顆粒攜帶電荷增多，電荷黏附能力增加，實驗精確度也隨之提高。

半定量的D-二聚體檢測方法通常采用乳膠凝集法，D-二聚體在調節(jié)pH值后與包被抗體的乳膠粒子結合，發(fā)生凝集反應[6]。檢測時間約2 min，因其簡便快捷的特性，該方法在臨床檢測廣泛使用。乳膠凝集法對D-二聚體檢測建立在特異性抗體上，檢測前需對乳膠顆粒包被抗體。由于D-二聚體與纖維蛋白原降解產物二者同為纖維蛋白在纖維蛋白酶水解后的產物，具有相同抗原表位，因而抗體特異性很大程度上決定了檢測結果的準確性。

1.2 酶聯免疫吸附測定法

酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)應用于D-二聚體檢測的原理與傳統(tǒng)ELISA試劑盒相似。首先將D-二聚體抗體包被到固相載體，隨后加入含有D-二聚體抗原的血漿，二者發(fā)生反應結合在一起后，加入酶標抗體，隨后加入底物顯色并終止后，即可觀察結果[7]。顏色深淺與濃度成正相關，即可用酶標儀測其OD值做標準曲線計算具體濃度。相較于乳膠凝集法，快速ELISA法敏感性更高，穩(wěn)定性更強，更適用于單樣本的檢測[8]。

2 目前現有的D-二聚體抗體

自單克隆抗體制備問世以來，抗體發(fā)展突飛猛進。以D-二聚體為例，目前市售的D-二聚體抗體均來源于鼠源單克隆抗體。此外，田超偉及其團隊構建了噬菌體基因文庫，并成功獲得了D-二聚體抗體，為靶向栓溶劑的發(fā)展奠定了基礎[9]。

3 單克隆抗體篩選方法

目前常用的特異性抗體篩選方法是間接ELISA法。O’donnell等的研究表明，在測定蛋白酶3時，不同于直接ELISA法，間接ELISA有更高的靈敏度，但需要將靈敏度的臨界值調高才能避免一些非特異性結合[10]。然而，即使間接ELISA具有高靈敏度，但其在臨床應用中仍有漏篩的可能[11]。同時在反應過程中，高概率會發(fā)生交互反應[12]。在實際操作中，除了必須加樣操作外，洗板占據了大部分時間，耗時費力的問題仍待解決。

4 光激化學發(fā)光法

4.1 光激化學發(fā)光技術的應用

光激化學發(fā)光(light initiated chemiluminescent assay，LiCA)，是建立在均相免疫檢測技術基礎上的化學發(fā)光反應。其免疫反應體系中，待測抗體包被在感光微球，羊抗鼠二抗包被在發(fā)光微球上。感光微球和發(fā)光微球內分別含有和二甲基噻吩衍生物及Eu螯合物，二者通過轉化高能態(tài)離子氧，在200 nm范圍內完成發(fā)光。憑借其高通量特性，在各領域均有廣泛應用[13]。如賀安等在LiCA技術基礎上研發(fā)的NSE-Alpha LISA試劑盒，對神經元特異性烯醇化酶的檢測可達臨床要求[14]。邊穎及其團隊建立了蛋清IgE光激化學發(fā)光診斷方法，為臨床診斷提供了依據[15]。

4.2 光激化學發(fā)光在抗體篩選中的應用

徐娟等的研究表明，在相同條件下，與傳統(tǒng)的ELISA方法相比，光激化學發(fā)光法需要的試劑即抗體量更少，以信噪比為指標，LiCA具有更好的信噪比[16]。在低濃度樣品的檢測中，ELISA方法因靈敏度低易發(fā)生漏，LiCA中由激發(fā)光產生離子氧，傳遞至發(fā)光微球后最終產生發(fā)射光，信號逐級放大，靈敏度更高。與傳統(tǒng)抗體篩選方法相比，LiCA憑借其高通量篩選，短時間內即可完成大量樣本的檢測，同時機器加樣省去清洗步驟，極大地縮短了反應時間[17]。

目前中國血栓性疾病患者人數達2.9億，伴隨著人口老齡化，這個數字會逐年增長[18]。血栓疾病檢測市場前景巨大，現有的檢測手段依賴于抗原抗體免疫反應，特異性抗體在檢測中成為不可缺少的一環(huán)。而抗體的篩選過程中，傳統(tǒng)方法的效率低下延長了篩選的進程[19]。光激化學發(fā)光為該問題提供了新的解決思路。因高通量的特性，LiCA在將來應用的領域會不斷發(fā)展，應用更加廣泛。