李 越，鞠曉紅，李 瑤，駱曉峰 (吉林醫(yī)藥學(xué)院,吉林 吉林 132013)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)，也稱(chēng)為綠膿桿菌，是臨床實(shí)踐中相對(duì)多見(jiàn)的一種條件致病菌,現(xiàn)已發(fā)展成為院內(nèi)感染的重要病原菌之一。PA的抗性機(jī)制主要是水解酶的生成，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrumβ-lactamases，ESBLs)的生成是導(dǎo)致超廣譜β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的重要原因。ESBLs是以將廣譜和窄譜頭孢菌素、單環(huán)類(lèi)抗生素和盤(pán)尼西林等滅活為特征的一種β-內(nèi)酰胺酶。臨床上抗生素的應(yīng)用越來(lái)越多，導(dǎo)致PA對(duì)ESBLs耐藥的情況呈現(xiàn)出明顯上升的趨勢(shì)。現(xiàn)就PAESBLs耐藥基因的分類(lèi)、流行情況及檢測(cè)方法進(jìn)行綜述。

1 PA ESBLs耐藥基因的分類(lèi)

PA對(duì)超廣譜β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥引起的院內(nèi)感染是抗菌治療中最具挑戰(zhàn)性的目標(biāo)之一。經(jīng)過(guò)對(duì)PA的不斷研究與探索,在其中檢測(cè)出了多種類(lèi)型的ESBLs耐藥基因。據(jù)悉國(guó)外已發(fā)現(xiàn)150多種基因類(lèi)型[1]，主要分為GES、OXA、VEB、PER、SHV及其他少見(jiàn)類(lèi)型，其中在中國(guó)以O(shè)XA和SHV最為常見(jiàn)。經(jīng)研究在PA中已經(jīng)檢測(cè)出的GES型耐藥基因有GES-1、GES-8和GES9等[2]，SHV包括SHV-1、SHV-2、SHV-2a、SHV-5及SHV-12等類(lèi)型，其他的SHV型耐藥基因主要存在于大腸桿菌中[3]，還檢測(cè)出了PER-1、PER-2、PER-3和VEB-1等類(lèi)型的耐藥基因[4]。并且主要存在于PA中的OXA型耐藥基因也被檢測(cè)出來(lái)了，至今OXA型耐藥基因已經(jīng)被分離出58種以上的類(lèi)型，分別命名為OXA-1～OXA-58，其中發(fā)現(xiàn)OXA-2、OXA-10、OXA-11及OXA-17等具有ESBLs活性[5]。對(duì)于ESBLs耐藥基因國(guó)內(nèi)也在不斷對(duì)其進(jìn)行深入的探索，近年來(lái)繼在一位老年重癥患者標(biāo)本首次中發(fā)現(xiàn)了GES-5型后[6],相繼發(fā)現(xiàn)了OXA30、OXA-48、SHV-11和PER-3等耐藥基因型[7]。

1.1 GES型耐藥基因

在分子分類(lèi)中，GES被歸為A類(lèi)酶。它的性質(zhì)與ESBLs的一般特性相似，通常對(duì)盤(pán)尼西林、超廣譜頭孢菌素和氨噻酸單胺菌素類(lèi)抗生素具有耐藥性，對(duì)頭霉素類(lèi)抗生素較敏感，其活性可被克拉維酸、三唑巴坦抑制[8]。因?yàn)镚ES蛋白中含有可以自身轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒，其轉(zhuǎn)化的接合子插入到質(zhì)粒上使細(xì)菌對(duì)超廣譜β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素產(chǎn)生耐藥性[9]，使得不一樣的基因型對(duì)抑制劑的敏感性和底物譜的水解能力存在一些差別[10]。在法國(guó)、南非、希臘及土耳其等地由GES引起的院內(nèi)感染都被多次報(bào)道過(guò)[11]，通常都是引起爆發(fā)式感染。但在國(guó)內(nèi)GES引起的感染比較少見(jiàn)，至今被國(guó)內(nèi)報(bào)道的只有GES-1和GES-5，對(duì)此國(guó)內(nèi)研究還不是很透徹。

1.2 OXA型耐藥基因

OXA主要在PA中檢測(cè)到，在其他細(xì)菌中偶見(jiàn)。OXA在分子分類(lèi)上歸于D類(lèi)酶，在OXA-10、OXA-2和OXA-1基因中都可以形成OXA型耐藥基因。其中以O(shè)XA-10的發(fā)展為主，它們間的同源性在20%～30%之間，PI值介于5.5～8.1[12]。OXA能夠誘導(dǎo)細(xì)菌外排泵的高表達(dá)，而被誘導(dǎo)的外排泵具有主動(dòng)外排的機(jī)制，能夠?qū)⑦M(jìn)入的藥物排出體外，形成耐藥機(jī)制。因此OXA型ESBLs耐藥基因?qū)Ρ竭蚯嗝顾睾图籽跷髁值乃庾饔帽容^強(qiáng)，對(duì)于頭孢菌素類(lèi)的水解能力低于盤(pán)尼西林類(lèi)。克拉維酸等抑制劑也不能完全抑制OXA型耐藥基因的活性,但是在體外可以被NaCI強(qiáng)烈抑制[13]。OXA最初主要在法國(guó)和土耳被檢測(cè)出[14]，近年來(lái)我國(guó)也發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了OXA型耐藥基因型，其中OXA在PA中的檢出率比較高，并對(duì)其耐藥機(jī)制及基因型的分布情況做了初步研究。

1.3 VEB型耐藥基因

VEB是一種不是很典型的小型ESBLs耐藥基因[15]。它的編碼基因主要定位于質(zhì)粒，并且該質(zhì)粒同時(shí)攜帶其他多種非β-內(nèi)酰胺酶抗性基因[16]，誘導(dǎo)PA產(chǎn)生不同的滅活酶、鈍化酶和修飾酶,從而形成完整的耐藥機(jī)制[17]。該酶對(duì)頭孢噻甲羧虧和氨基曲南有高度的抗性,對(duì)克拉維酸具有敏感性,使頭孢噻甲羧虧與克拉維酸有明顯的協(xié)同作用[18]。VEB首次在越南被發(fā)現(xiàn)和報(bào)告，是在綠膿桿菌中被發(fā)現(xiàn)的，隨后在東南亞大量的腸桿菌和綠膿桿菌中被發(fā)現(xiàn)。VEB在中國(guó)比較少見(jiàn)[19]，目前國(guó)內(nèi)正在致力于VEB-1的深入探索。

1.4 PER型耐藥基因

在分子分類(lèi)中，PER被歸為A類(lèi)酶，到目前為止，已發(fā)現(xiàn)3種耐藥基因型，分別是PER-1、PER-2與PER-3[20]。因?yàn)槟退幈硇团c基因型之間有良好的相關(guān)性，使得它具有水解氨曲南和氧亞氨基頭孢菌素的性質(zhì)。并且PER型耐藥基因的活性可以被克拉維酸抑制劑所抑制,但其對(duì)EDTA和與氯唑西林并非特別敏感，對(duì)頭孢他啶有高度的耐藥性,對(duì)哌拉西林-三唑巴坦在一定程度上也有抗藥性[21]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)PER的研究報(bào)道都不是很多，對(duì)其引起的感染嚴(yán)重程度及傳播范圍也不是很清楚。

1.5 SHV型耐藥基因

SHV型是較早發(fā)現(xiàn)的酶型之一[22],它的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變導(dǎo)致酶的催化腔變大，無(wú)法阻止第三代頭孢菌素入酶體而被水解，使酶對(duì)第三代頭孢菌素的親和力被大大提高，從而擴(kuò)大了SHV酶的耐藥譜，使臨床抗感染救治變的很艱巨，并在世界各地已經(jīng)引起了高度重視[23]。在分子分類(lèi)中SHV被歸為A類(lèi)酶?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)SHV的種類(lèi)已經(jīng)有一百多種了，SHV型ESBLs抗性基因的PI在7.0～8.2之間，固呈堿性[24]。SHV不能水解苯唑西林、廣譜頭孢菌素和頭霉素，但是水解氨芐西林的能力非常強(qiáng)，它還能夠高效地水解窄譜頭孢菌素與青霉素[25]。近年來(lái)SHV的研究已經(jīng)成為熱潮，國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道明顯增多了不少，而中國(guó)報(bào)道最多的是SHV-12。

1.6 其他少見(jiàn)類(lèi)型基因

除了GES、OXA、VEB、PER、SHV型耐藥基因外還有BEL、OXY、OKP、PSE等少見(jiàn)類(lèi)型。因?yàn)椴淮_定它們的流行范圍，檢出率極低，國(guó)內(nèi)外對(duì)其的研究也特別少。因此關(guān)于這些少見(jiàn)基因型的研究還有很大的上升空間。

2 PA ESBLs耐藥基因的流行病學(xué)情況

1998年于法國(guó)圭亞那地區(qū)首次發(fā)GES型ESBLs耐藥基因之后就陸續(xù)被其他國(guó)家所發(fā)現(xiàn)，并且分離出GES-1、GES-2、GES-3及GES亞型等多種類(lèi)型[26]。關(guān)于GES的流行病學(xué)情況在法國(guó)、南非、希臘等被多次報(bào)道過(guò)，通常都是由GES引起的爆發(fā)式院內(nèi)感染[27]。國(guó)外文獻(xiàn)曾報(bào)道OXA型ESBLs耐藥基因主要存在于綠膿桿菌中，傳播途徑廣泛，傳播能力強(qiáng)。OXA的許多類(lèi)型最初是在法國(guó)和土耳其被發(fā)現(xiàn)的，北非曾報(bào)道了由OXA-18引起了醫(yī)院感染的暴發(fā)流行[28]，目前GES和OXA型主要地理分布情況還不是特別明確。繼在越南發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌中的VEB-1后，2001年9月,蔣曉飛等在上海瑞金醫(yī)院燒傷科重癥監(jiān)護(hù)室檢測(cè)到綠膿桿菌中的VEB-1型耐藥基因，這是中國(guó)首次有VEB的報(bào)道。2003年，駱俊在華山醫(yī)院的陰溝腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了VEB型耐藥基因[29]，VEB在國(guó)內(nèi)還沒(méi)有被報(bào)道引起院內(nèi)感染。PER-1型耐藥基因首次被發(fā)現(xiàn)是在法國(guó)，也是在PA中被檢測(cè)到。PER-2在阿根廷沙門(mén)菌分離株中以及玻利維亞的PA分離株中被依次檢測(cè)出來(lái)[30]。1974年Matth首次發(fā)現(xiàn)了于TEM相似的SHV-1，之后相繼分離出了SHV-2、SHV-3、SHV-4及SHV-7等一百多種基因型。SHV型耐藥基因相對(duì)其他類(lèi)型的耐藥基因分布比較廣泛，在中國(guó)、法國(guó)、美國(guó)、韓國(guó)、意大利、日本及非洲北部的阿爾及利亞等許多國(guó)家都有關(guān)于其引起院內(nèi)感染的報(bào)道[31]。全世界流行的耐藥基因類(lèi)型各不相同，在中國(guó)以SHV-12為主。近年來(lái)，PA ESBLs抗性基因引起的院內(nèi)感染逐漸增多，主要發(fā)生在有代謝性疾病、血液病、膿腫的患者及重癥患者術(shù)后抵抗力低下的人群中。然而治療情況卻沒(méi)有特別好，國(guó)內(nèi)外關(guān)于它的報(bào)道在逐漸增多，也在研究控制的方法，院方應(yīng)對(duì)此也給予高度重視。

3 PA ESBLs耐藥基因的檢測(cè)方法

PA ESBLs耐藥基因的檢測(cè)方法分為微生物學(xué)檢測(cè)法和分子生物學(xué)檢測(cè)法。微生物檢測(cè)法包括①藥敏紙片擴(kuò)散法：選取所需的藥敏紙片，用標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法對(duì)涂有該菌液的MH瓊脂平板進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)測(cè)量抑菌環(huán)直徑來(lái)確定基因類(lèi)型；②E-test試驗(yàn)：將藥物分別置于試紙條兩端，貼于涂好菌液的帶有刻度的平板上，進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)讀取試紙條兩端對(duì)應(yīng)的刻度值確定所檢測(cè)的基因類(lèi)型；③三維檢測(cè)法：該試驗(yàn)是在紙片法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良而形成的，將待測(cè)的菌液涂布在MH瓊脂平板上，在距離藥敏紙片3 mm的位置挖一個(gè)環(huán)形裂隙，吸取109～1010CFU/mL的菌液，加入裂縫中，菌液不能溢，進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的水解酶會(huì)擴(kuò)散開(kāi)來(lái)，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后分析所檢測(cè)的基因型;④自動(dòng)化儀器法：通過(guò)相應(yīng)的檢測(cè)儀器來(lái)檢測(cè)基因型。然而這些方法受溫度，濕度，酸堿度，培養(yǎng)環(huán)境等外部影響因素太多，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不是很準(zhǔn)確。分子生物學(xué)檢測(cè)法包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè),這些方法都是從基因的相關(guān)水平上進(jìn)行檢測(cè)的，不易檢錯(cuò)，外部影響因素少，因此特異性和靈敏度都非常的高，結(jié)果也更為準(zhǔn)確。

由于超廣譜類(lèi)抗生素使用的越來(lái)越多，使得ESBLs耐藥基因的耐藥性越來(lái)越強(qiáng)。目前，法國(guó)、美國(guó)等國(guó)耐藥基因的研究比較多并且不斷地有新的基因型被發(fā)現(xiàn)。國(guó)內(nèi)主要致力于SHV及OXA型耐藥基因的研究及院內(nèi)感染的控制。針對(duì)這兩種基因型我國(guó)研制出了克拉維酸等抑制劑，但是沒(méi)有顯著效果。因此對(duì)于ESBLs耐藥基因引起感染的控制已經(jīng)成為目前首要的研究任務(wù)。