高 芳，衛(wèi)星如，馬立聰，，田旭陽，黨 彤，賈彥彬,,4

在全球范圍內(nèi)，胃癌(gastric cancer, GC)仍是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。2015年，國家癌癥中心統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國GC每年新發(fā)病例約67.9萬例，其發(fā)病率在惡性腫瘤中高居第2位[1]；且每年GC新發(fā)病例占世界GC總?cè)藬?shù)的47%，大部分患者就診時已為局部晚期或進(jìn)展期，5年生存率為28%[2]，形勢十分嚴(yán)峻。GC已是我國公民最主要的疾病負(fù)擔(dān)，如何對GC進(jìn)行有效防治是我們面臨的一個公共衛(wèi)生問題。

近年來，Toll樣受體家族(toll-like receptors，TLRs)被發(fā)現(xiàn)是一種受體蛋白，在抗病原微生物免疫防御反應(yīng)中起重要作用，與多種胃黏膜疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系[3]。目前，人們普遍認(rèn)為GC的發(fā)生與環(huán)境、幽門螺桿菌感染等因素密切相關(guān)。一些單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)與胃癌變的遺傳易感性關(guān)聯(lián)[4]，提示在GC的發(fā)病過程中，遺傳因素起非常重要的作用[5]。此外，TLR5由于可識別幽門螺桿菌的鞭毛蛋白，與GC的易感性相關(guān)[6]。現(xiàn)在中國包頭地區(qū)漢族人群中，探討TLR5基因多態(tài)性與非賁門胃癌的相關(guān)性，旨在為非賁門胃癌的早期診斷和治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2008年9月～2010年6月間包頭市腫瘤醫(yī)院經(jīng)組織病理學(xué)診斷為非賁門胃癌的288例患者為病例組。所有患者均為新發(fā)病例且未接受過放化療。其中男性224例，女性64例，年齡26～83(59.48±11.23)歲。選取同期281例社區(qū)體檢人群作為對照組，其中男性220例，女性61例，年齡26～85(59.10±11.57)歲；正常對照均無癌癥病史和明顯的胃部疾病。病例組和對照組在年齡和性別方面相匹配(年齡：t=0.40,P=0.69；性別：χ2=0.02,P=0.88)[7]。569例研究樣本均為漢族，相互之間無血緣關(guān)系且在包頭居住5年以上，均簽署了知情同意書。本研究已獲得包頭醫(yī)學(xué)院倫理學(xué)委員會的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1Tag-SNPs的篩選 根據(jù)HapMap數(shù)據(jù)庫(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov)中中國人的數(shù)據(jù)，使用Agorithm-Tagger-pairwise Tagging軟件篩選基因的tagSNPs (參數(shù)設(shè)定為MAF>5%、r2>0.8)。篩選范圍包括TLR5基因第一個外顯子上游20 kb和最后一個外顯子下游10 kb的序列，最終初步篩選出4個SNPs，即rs34270714、 rs5744174、rs851139、rs17163737進(jìn)行研究。

1.2.2基因分型 抽取所有研究對象靜脈血3 ml，用DNA提取試劑盒(北京天根公司)提取外周血白細(xì)胞中的DNA，用TaqMan法對4 個SNP進(jìn)行基因分型。引物、FAM和VIC標(biāo)記探針由Applied Biosystems公司(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)設(shè)計并合成，實(shí)驗設(shè)陰性和陽性對照，實(shí)驗操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行?；蚍中驮诒本┲Z賽基因組有限公司完成，4 個SNP基因分型的成功率均大于98%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。在對照組中用χ2檢驗來檢測基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡；采用t檢驗比較分析年齡在病例組及對照組間的分布差異；采用χ2檢驗比較性別在病例組和對照組的分布差異。用Haploview 4.0軟件構(gòu)建單體型。用非條件性Logistic回歸計算比值比(odds ratio,OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)，評估各等位基因、基因型以及單體型與非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險是否存在關(guān)聯(lián)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各SNP位點(diǎn)等位基因與非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系通過對兩組人群TLR5基因SNP rs34270714、rs5744174、rs851139、rs17163737位點(diǎn)的等位基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示4個位點(diǎn)的SNP均與非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險沒有關(guān)聯(lián)(P>0.05)。見表1。

表1 各SNP位點(diǎn)等位基因與非賁門胃癌的關(guān)系[n(%)]

*由于有缺失的數(shù)據(jù)，因此，列之和不及樣本的等位基因總數(shù)；#平衡了性別和年齡因素

2.2 各SNP位點(diǎn)基因型與非賁門胃癌發(fā)生的關(guān)系在正常對照中，SNP rs34270714、rs5744174、rs851139、rs17163737的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。SNP rs17163737與非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)聯(lián)，與攜帶GG基因型的人群比較，GT基因型攜帶者非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險可提高1.605倍(GTvsGG:OR=1.605, 95%CI=1.131～2.280)，其余SNP與非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險無關(guān)聯(lián)(P>0.05)。見表2。

表2 各SNP位點(diǎn)基因型與非賁門胃癌的關(guān)聯(lián)分析[n(%)]

*由于有缺失的數(shù)據(jù)，因此，列之和不及樣本總數(shù)；#平衡了性別和年齡因素

2.3 TLR5基因的單體型與非賁門胃癌發(fā)生的關(guān)系對TLR5基因的4個SNP進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果顯示：rs5744174-rs851139 -rs17163737存在強(qiáng)連鎖不平衡，構(gòu)成單體型區(qū)域(Block)；然而各單體型與非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險無關(guān)聯(lián)。見表3。

表3 TLR5基因單體型與非賁門胃癌的關(guān)系(%)

*SNP順序為rs5744174-rs851139-rs17163737

3 討論

GC是一種受多因素影響、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的癌癥，雖然在臨床治療及基礎(chǔ)研究中取得了一些進(jìn)展，但GC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制還沒有完全闡明[8]。研究顯示TLR5在正常胃上皮細(xì)胞的頂部和基底外側(cè)特異性表達(dá)，可識別細(xì)菌鞭毛蛋白，但感染幽門螺旋桿菌后，頂部表達(dá)就消失了。Lagunes-Servin et al[9]發(fā)現(xiàn)TLR5與幽門螺桿菌感染密切相關(guān)。也有研究顯示幽門螺旋桿菌可通過避開TLR5而逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)測[10-11]。這些結(jié)果提示，TLR5基因可能與幽門螺旋桿菌感染以及其導(dǎo)致的GC的發(fā)生有關(guān)，是研究GC發(fā)病風(fēng)險的重要的候選基因。

TLR5基因位于染色體1q41，包含6個外顯子。TLR5功能異常與GC、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌的發(fā)生有關(guān)[12]。Zeng et al[13]發(fā)現(xiàn)TLR5遺傳變異和幽門螺桿菌感染之間的交互作用與GC的發(fā)病風(fēng)險關(guān)聯(lián)。Xu et al[6]的研究顯示，TLR5 基因多態(tài)性與GC風(fēng)險顯著關(guān)聯(lián)。然而，非賁門胃癌和賁門癌在病因、病理、癌變以及預(yù)后等方面都存在較大差異[14]。因此，為了保證樣本的均質(zhì)性，本研究將病例限定為非賁門胃癌的患者。

本研究以中國包頭漢族人群為樣本，檢測了TLR5基因多態(tài)性與非賁門胃癌遺傳易感性的關(guān)系。研究結(jié)果顯示：包頭地區(qū)漢族人群中TLR5基因SNP rs17163737與非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)聯(lián)，與攜帶GG基因型的人群比較，GT基因型攜帶者非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險可提高1.605倍(GTvsGG:OR=1.605, 95%CI=1.131～2.280)，SNP rs34270714、rs5744174、rs851139與非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險沒有關(guān)聯(lián)(P>0.05)。同時我們的研究顯示：rs5744174-rs851139 -rs17163737存在強(qiáng)連鎖不平衡，構(gòu)成單體型區(qū)域，然而各單體型與非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險無關(guān)聯(lián)。Xu et al[6]收集了1 300例GC患者和1 300例正常對照，并探討了TLR5基因SNP rs5744174和rs17163737與GC遺傳易感性的關(guān)系。結(jié)果顯示rs5744174、rs17163737與GC的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)聯(lián)，其中與TT基因型相比，rs5744174 CC基因型可增加GC的發(fā)病風(fēng)險；與GG基因型攜帶者相比，攜帶rs17163737 GT和TT基因型者GC的發(fā)病風(fēng)險上升。我們的研究結(jié)果與Xu et al[6]的不太一致，可能的原因為：①兩項研究樣本的遺傳亞結(jié)構(gòu)不同，我們的樣本是中國西北部包頭市的漢族人群，而他們的樣本主要來自中國南方地區(qū)；②兩項研究病例的選擇標(biāo)準(zhǔn)有差異，我們研究的病例限定為非賁門胃癌患者，而Xu et al[6]的研究病例沒有如此限定；③我們的樣本量偏低，可能導(dǎo)致了結(jié)果的差異。

本研究我們篩選4個tagSNPs rs34270714、rs5744174、rs851139、rs17163737，進(jìn)行了初步探討，在今后的研究中我們將繼續(xù)篩選位于外顯子區(qū)和其他非編碼區(qū)的SNP進(jìn)行證實(shí)，同時擴(kuò)大樣本量繼續(xù)深入地研究。