衛(wèi)星如，馬立聰,，田旭陽(yáng)，黨 彤，高 芳，賈彥彬,，4

幽門(mén)螺桿菌(helicobacterpylori,H.pylori)是革蘭陰性細(xì)菌，感染了全球50%左右的人口[1]。H.pylori感染與胃腸道疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[2]。然而關(guān)于其作用機(jī)制尚不明確，影響H.pylori感染的因素也不明確。環(huán)境和宿主等多種因素的綜合作用引起了H.pylori的感染，其中宿主因素起著很重要的作用[3]，而且宿主的遺傳改變可以影響H.pylori的感染狀況及臨床轉(zhuǎn)歸[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)作為一種重要的模式受體可以識(shí)別多種病原體關(guān)聯(lián)的分子模式，進(jìn)而觸發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，致使多種炎性因子的生成，其對(duì)于識(shí)別H.pylori感染以及刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答極其重要。該研究旨在檢測(cè)TLR9基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)與H.pylori感染之間的關(guān)系，為以TLRs為基礎(chǔ)的抗H.pylori感染治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集683例正常體檢者，其中男性459例，女性224例。所有研究樣本均為在包頭生活5年以上，互無(wú)血緣關(guān)系的漢族人。所有入選者均無(wú)癌癥病史，無(wú)高血壓、糖尿病，未接受過(guò)H.pylori清除治療及胃部手術(shù)，并通過(guò)內(nèi)鏡窄帶成像術(shù)(narrow band imaging, NBI)胃鏡檢查排除了萎縮性胃炎、不完全腸轉(zhuǎn)化、胃及十二指腸潰瘍等疾病患者，所用樣本采集血樣2 ml，并提供了知情同意書(shū)，本研究經(jīng)包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2H.pylori的檢測(cè)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)樣本中抗H.pylori的特異性抗體，人幽門(mén)螺旋桿菌抗體(helicobacter pylori antibody, HP-Ab)ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自泉州市睿信生物科技有限公司，操作及結(jié)果判斷嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 SNP的篩選根據(jù)Hap Map數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.Hapmap.org)所提供的中國(guó)漢族人群的信息，使用Agorithm-Tagger-pairwise Tagging軟件篩選標(biāo)記單核苷酸多態(tài)性(tag-SNP)，要求最小等位基因頻率(minimum allele frequency, MAF) ≥5%，連鎖不平衡值r2>0.8。在篩選出的SNP中，選擇文獻(xiàn)報(bào)道可能和疾病關(guān)聯(lián)的SNP進(jìn)行研究，本研究選擇了3個(gè)SNP，即rs187084、rs352140和rs164640進(jìn)行研究。

1.4 基因分型采用DNA提取試劑盒(天根生物科技有限公司)提取外周血白細(xì)胞DNA。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragement length polymorphism,PCR-RFLP)技術(shù)對(duì)TLR9 rs187084、rs352140、rs164640進(jìn)行基因分型。用Primer 3設(shè)計(jì)引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成引物。PCR反應(yīng)體系共25 μl，內(nèi)含DNA 50 ng、PCR mix 12.5 μl、上下游引物(5 μmol/L)各1 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，32個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。擴(kuò)增產(chǎn)物用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系共10 μl，內(nèi)含PCR反應(yīng)產(chǎn)物3 μl，10×Buffer 1 μl，內(nèi)切酶3 U。在內(nèi)切酶最適反應(yīng)溫度下作用60 min后，2%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)酶切割后出現(xiàn)的片段大小判斷基因型，內(nèi)切酶及相應(yīng)的反應(yīng)溫度和酶切片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用檢驗(yàn)檢測(cè)樣本是否符合Hardy-Weinberg平衡(hardy-weinberg equilibrium, HWE)。采用Haploview 4.0軟件對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡(linkage disequilibrium, LD)分析，用D’置信區(qū)間法構(gòu)建單體型塊(Haplotype block)。采用非條件Logistic回歸檢測(cè)各SNP在共顯性(codominant)、顯性(dominant)、隱性(recessive)遺傳模型下與H.pylori感染的關(guān)系，以比值比(odds ratio,OR)值以及95%置信區(qū)間(confidence intervals,CI)表示，并計(jì)算最小信息準(zhǔn)則(an information criterion, AIC)、貝葉斯信息準(zhǔn)則(bayesian information criterion, BIC)。其中，AIC、BIC是對(duì)模型擬合效果進(jìn)行評(píng)價(jià)的指標(biāo)，AIC、BIC越小，則模型對(duì)數(shù)據(jù)的擬合越好，模型則為最佳模型。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料比較在683例樣本中，H.pylori陰性305例，年齡39～88(58.71±10.86)歲；男性206例，占67.54%，女性99例，占32.46%。H.pylori陽(yáng)性378例，年齡38～89(58.77±11.36)歲；男性253例，占66.93%，女性125例，占33.07%。研究對(duì)象的年齡和性別分布在H.pylori陰性組和陽(yáng)性組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(年齡:t=0.072,P=0.365; 性別:t=0.028,P=0.866)。

2.2 TLR9基因SNP位點(diǎn)與H.pylori感染的關(guān)系在683例樣本中，TLR9基因rs187084、rs352140和rs164640位點(diǎn)的基因型分布均符合Hardy-Wein-berg平衡定律。分別用3種遺傳模式對(duì)TLR9與H.pylori感染的關(guān)系進(jìn)行分析。SNP rs187084在codominant、dominant、recessive模型中均與H.pylori感染關(guān)聯(lián)，其中codominant模型為最佳模型，與TT基因型相比，攜帶TC基因型可使H.pylori感染的風(fēng)險(xiǎn)降低(TCvsTT:OR=0.520, 95%CI=0.329～0.820)。rs352140在3種遺傳模式下，均未發(fā)現(xiàn)其與H.pylori感染具有相關(guān)性。rs164640在dominant模型中，與野生型AA基因型相比，攜帶AG+GG基因型者H.pylori感染風(fēng)險(xiǎn)增加1.569倍(95%CI=1.126～2.187)。見(jiàn)表2。對(duì)TLR9基因的3個(gè)SNP進(jìn)行連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)：rs164640、rs352140、rs187084三個(gè)位點(diǎn)連鎖程度低，未能構(gòu)建出單體型塊。

表1 TLR9 rs187084、rs352140和rs164640引物序列、內(nèi)切酶和反應(yīng)溫度及酶切片段長(zhǎng)度

表2 不同遺傳模式下，TLR9基因SNP位點(diǎn)與H. pylori感染風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系[n(%)]

*調(diào)整了年齡和性別因素

3 討論

病原微生物侵入人體時(shí)受到模式識(shí)別受體的識(shí)別，進(jìn)而觸發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。TLRs特異性地識(shí)別多種病原體關(guān)聯(lián)的分子模式，在機(jī)體的非特異性免疫應(yīng)答和承載特異性免疫應(yīng)答中起到了重要作用[5]。研究[6]表明TLRs基因多態(tài)性與H.pylori的感染有關(guān)聯(lián)。H.pylori感染人體后，寄居在胃黏膜上皮的黏液層，而TLR9可以識(shí)別H.pylori非甲基化的雙鏈DNA分子[7]。研究[8]表明TLR9通過(guò)cag島激活可以改變H.pylori感染環(huán)境中的惡性風(fēng)險(xiǎn)，而且H.pylori感染與胃黏膜中TLR9的表達(dá)增加有關(guān)[9]。因此，TLR9基因多態(tài)性可能在H.pylori感染和臨床結(jié)果的轉(zhuǎn)歸中起到重要作用。基于此，在本研究中，課題組利用PCR-RFLP方法檢測(cè)包頭漢族人群中H.pylori感染與TLR9 rs187084、rs352140、rs164640的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在codominant遺傳模式下，攜帶rs187084 TC基因型者較TT基因型者H.pylori感染風(fēng)險(xiǎn)降低；SNP rs352140與H.pylori感染無(wú)關(guān)聯(lián)；在dominant遺傳模式下，攜帶rs164640 AG+GG基因型者較AA基因型者H.pylori感染風(fēng)險(xiǎn)增加。

rs187084位于TLR9啟動(dòng)子區(qū)，一些研究顯示了其與某些疾病的關(guān)系，如林茂虎 等[10]發(fā)現(xiàn)rs187084攜帶C等位基因與鮑氏不動(dòng)桿菌感染有關(guān)聯(lián)。也有研究顯示其與一些疾病無(wú)關(guān)，如衛(wèi)美蓉[11]和石源源 等[12]研究顯示rs187084與胃癌的易感性無(wú)關(guān)。課題組研究結(jié)果顯示與TT基因型相比，rs187084攜帶TC基因型可使H.pylori感染的風(fēng)險(xiǎn)降低0.520倍(95%CI=0.329～0.820)。然而關(guān)于rs187084與H.pylori感染的關(guān)系還未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

TLR9有兩個(gè)外顯子，第二外顯子是主要編碼區(qū)。rs352140位于第二外顯子，本研究結(jié)果顯示：rs352140與H.pylori感染沒(méi)有關(guān)聯(lián)，這與舒穎 等[13]研究結(jié)果一致。Loganathan et al[14]研究發(fā)現(xiàn)TLR9 rs352140多態(tài)性是影響印度泰米爾人H.pylori感染的疾病易感性和臨床表現(xiàn)的潛在遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素，結(jié)果的差異可能是由于研究人群的種族不同造成。本研究還檢測(cè)了TLR9基因的3′端下游的SNP rs164640與H.pylori感染的關(guān)系，結(jié)果顯示，rs164640與H.pylori感染相關(guān)聯(lián)。在dominant遺傳模式下，與野生型AA基因型相比，攜帶AG+GG基因型者H.pylori感染風(fēng)險(xiǎn)增加1.569倍(95%CI=1.126～2.187)。目前，關(guān)于SNP rs164640與H.pylori感染的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道，所以，課題組的研究還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。