缺氧誘導(dǎo)通路基因多態(tài)性與肺癌及臨床特征的關(guān)聯(lián)性研究

于偉玲，肖 莎，謝宗宙，黃琰菁，陳 元

肺癌是世界范圍內(nèi)死亡率最高的惡性腫瘤之一。在全球范圍內(nèi)，2012年診斷出約180萬新發(fā)肺癌病例，占世界癌癥總發(fā)病率的12.9%，同年其死亡159萬人，占癌癥死亡總數(shù)的19.4%[1]。目前的流行病研究結(jié)果顯示中國過去10年肺癌發(fā)病率和死亡率呈持續(xù)上升趨勢，平均每年以1.6%的比例上升[2]。

肺癌細(xì)胞的形成和轉(zhuǎn)移與缺氧微環(huán)境適應(yīng)和生長密切相關(guān)[3-4]，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子相關(guān)通路分子異常與肺癌進(jìn)展有重要聯(lián)系[5]，其遺傳多態(tài)性與肺癌發(fā)生密切相關(guān)[6-7]。近期日本人群研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子rs13419896 (Hypoxia-inducible factor, HIF2A)與血管內(nèi)皮生長因子A rs833061-AA (vascular endothelial growth factor A, VEGFA)基因的多態(tài)性與肺癌發(fā)生風(fēng)險相關(guān)[8-9]。由于亞太地區(qū)人在生活環(huán)境和人群遺傳背景具有較高的相似性，而上述結(jié)果在中國地區(qū)的目前無相關(guān)證實(shí)，該研究擬探討上述肺癌易感位點(diǎn)與我國肺癌發(fā)生的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 病例資料樣本來源海南漢族人群，共納入肺癌患者438例，為2011年3月～2017年7月間，?？谑腥嗣襻t(yī)院和海南省人民醫(yī)院病理檢查確診的肺癌患者，456例對照樣本來源于同時期海南地區(qū)健康體檢中心常規(guī)體檢人群，無呼吸系統(tǒng)疾病及肺癌家族史。

1.2 流行病學(xué)調(diào)查制定統(tǒng)一流行病學(xué)調(diào)查量表，內(nèi)容包括：一般人口學(xué)特征、吸煙、飲酒以及既往糖尿病史，排除呼吸系統(tǒng)家族史等。吸煙者定義為不吸煙者、既往吸煙者和目前正在吸煙者，飲酒者同樣定義為不飲酒者、既往飲酒者和正在飲酒者，并收集臨床病理分型和臨床肺癌分期。臨床數(shù)據(jù)整理和分析，按照第8版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 樣本采集在獲取知情同意，并簽署知情同意書后，分別采集肺癌患者和對照組外周靜脈血3 ml，EDTA抗凝，-20 ℃冰箱保存。

1.4 DNA提取采用外周血DNA提取試劑盒(Axygen Biosciences公司)提取人全基因組DNA，提取步驟按操作說明書進(jìn)行，提取的DNA保存于-60 ℃冰箱。

1.5 基因分型rs13419896和rs833061基因分型應(yīng)用Taqman genotyping assays(applied biosystems, ABI)，HIF2A, rs13419896, C__31180907_10和VEGFA, rs833061, C__1647381_10基因分型的探針，反應(yīng)的條件如下2倍Taqman genotyping master mix(ABI) 2.5 μl, 20 SNP genotyping assay mix(ABI) 0.25 μl。模板DNA 2.25 μl。 PCR反應(yīng)條件95 ℃、10 min, 95 ℃變性15 s, 60 ℃延長90 s，共40個循環(huán), 完成后讀取熒光信號完成基因分型。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用STATA 10.0SE軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。配對t檢驗(yàn)比較病例組和對照組間性別、年齡、飲酒及吸煙情況，Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)檢驗(yàn)對照組樣本是否來源于同一個群體；χ2檢驗(yàn)比較兩組間高危因素情況及不同基因型在兩組間的頻率分布， 應(yīng)用Logistic多因素回歸分析計(jì)算OR和95%CI以估計(jì)不同基因型與肺癌風(fēng)險之間的相關(guān)性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點(diǎn)肺癌病例組平均年齡為29～87(55.8±15.1)歲；對照組平均年齡為30～72(48.1±8.07)歲，年齡上肺癌病例組年齡較健康對照組大(P<0.001)，而肺癌病例組與對照組之間性別無明顯差異(P=0.96)。通過吸煙和飲酒行分類分析，不同肺癌病例組吸煙個體和持續(xù)飲酒個體與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體見表1。

表1 病例組和對照組臨床特點(diǎn)[n(%)]

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)rs13419896和rs833061成功分型為98.2%和99.0%。通過Hardy-Weinberg檢驗(yàn)分析對照組是否來源于同一個整體，rs13419896(χ2=1.88，P=0.17)、rs833061(χ2=0.38，P=0.532)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明樣本的收集來源一個總體。

2.3 HIF2A基因rs13419896和VEGFA rs833061多態(tài)性位點(diǎn)與肺癌關(guān)聯(lián)分析分析結(jié)果顯示攜帶rs13419896 A等位基因?qū)Ρ菺等位基因具有降低肺癌發(fā)病風(fēng)險[OR=0.72, 95%CI(0.58～0.88),P=0.001 1]，通過對基因型的加性模型、隱性模型和顯性模型遺傳模型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在加性模型和顯性模型中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。進(jìn)一步分析rs13419896基因型與肺癌中病理類型(χ2= 3.27，P=0.77)和臨床分期(χ2=8.88，P=0.18)無相關(guān)性。而rs833061位點(diǎn)的等位基因C及T在肺癌組和對照組的分布情況分析，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；對rs833061基因型進(jìn)行三種不同遺傳模型分析，亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2。

2.4 HIF2A基因rs13419896基因型與肺癌發(fā)病相關(guān)通過對比rs13419896基因型、年齡、吸煙、飲酒、2型糖尿病等在條件回歸模型中的影響，結(jié)果顯示rs13419896基因型、吸煙、飲酒和年齡與肺癌相關(guān)，見表3。通過多因素回歸分析，調(diào)整吸煙、飲酒和年齡的影響，rs13419896基因型仍可降低肺癌發(fā)生率，而回歸模型中2型糖尿病和性別與肺癌的發(fā)病率無明顯關(guān)聯(lián)，見表3，回歸分析中wald檢驗(yàn)值為156.13。

2.5 肺癌高危因素肺癌分層分析進(jìn)一步對肺癌高危因素進(jìn)行分層分析，將以前有吸煙史和現(xiàn)在仍吸煙的定義為吸煙者，同樣方法定義飲酒者。分析發(fā)現(xiàn)對于不吸煙者，rs13419896 AA基因型具有的保護(hù)作用，而在吸煙人群中保護(hù)作用不明顯；rs13419896 AA基因型對飲酒者和不飲酒者均有降低肺癌的發(fā)生率；對于年齡大于50歲的患者，rs13419896 AA基因型對降低肺癌的發(fā)生率較為明顯，見表4。

3 討論

本研究通過對缺氧通路的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在中國海南地區(qū)HIF2A基因rs13419896多態(tài)性位點(diǎn)與肺癌的發(fā)生具有相關(guān)性，rs13419896位點(diǎn)AA基因型降低肺癌發(fā)生，而同為該位點(diǎn)的等位基因GG型增加肺癌的發(fā)病風(fēng)險，但未發(fā)現(xiàn)該陽性位點(diǎn)與臨床分期和病理類型的關(guān)系。

通過對環(huán)境因素的分析表明，除吸煙外，飲酒和年齡也是中國海南地區(qū)肺癌發(fā)生的重要因素。同時對肺癌高危因素進(jìn)行分層分析表明，對于吸煙患者其rs13419896-AA基因型保護(hù)作用不明顯，而對于不吸煙患者保護(hù)作用較為明顯，提示吸煙可能降低了rs13419896-AA基因型保護(hù)作用，rs13419896-AA保護(hù)作用與吸煙與否有密切相關(guān)。無論是飲酒患者或者不飲酒肺癌患者rs13419896-AA基因型性均有保護(hù)作用，可能的機(jī)制是飲酒不影響rs13419896-AA對肺癌發(fā)生保護(hù)機(jī)制，或者飲酒通過其他的通路致肺癌發(fā)生，本研究的結(jié)果顯示飲酒本身仍是增加肺癌發(fā)生率的高危因素。

表2 rs13419896 和rs833061與肺癌的關(guān)聯(lián)性[n(%)]

表3 多因素Logistic回歸分析分析肺癌的高危因素

表4 rs13419896在吸煙、飲酒和年齡在肺癌組和健康對照組分層分析

本研究結(jié)果與Yamamoto et al[8]對日本九州地區(qū)肺癌患者的研究結(jié)果相同，rs13419896-AA可以顯著降低肺癌的發(fā)生率，而未發(fā)現(xiàn)上述研究中VEGFA基因rs833061與肺癌的相關(guān)性，可能與該多態(tài)性位在中國人群(C/T:0.279/0.721)和日本人群(C/T:0.343/0.656)rs833061等位基因頻率差異有關(guān)。不同于Kim et al[10]在廣島地區(qū)的研究結(jié)果，該研究對76例肺癌患者基因型分析，提示rs13419896-AA基因型增加肺癌發(fā)生率，并且對基因型的生物學(xué)功能進(jìn)行了深入的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其有一定的相關(guān)性。該易感性結(jié)果的差異可能來源于研究中肺癌病例樣本收集較少，或者樣本來源地區(qū)的基因頻率的差異，因而對在該地區(qū)進(jìn)行獨(dú)立大樣本的驗(yàn)證，顯得尤為必要。同時該研究對多態(tài)性位點(diǎn)的生物學(xué)功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)rs13419896 A基因型相對于G基因型在A549、PC-9和 HSC-2細(xì)胞內(nèi)可以增加轉(zhuǎn)錄活性，rs13419896-AA基因型與肺癌的臨床進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)。雖然認(rèn)為肺癌HIF2A組織高表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后不良相關(guān)[10-11]。但有也研究指出HIF家族基因通過調(diào)節(jié)不同靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)揮促瘤與抗腫瘤的雙重作用[12-13]。因而該上述結(jié)果仍然需要進(jìn)一步獨(dú)立的功能分析來證實(shí)，同時聯(lián)系其臨床特征來進(jìn)一步完善對HIF2A在肺癌發(fā)生的認(rèn)識。

少部分遺傳易感性研究出現(xiàn)結(jié)果差異，這些差異主要來源于人群種族和種族內(nèi)人群分層[14]，或者獨(dú)立研究本身的限制，這種情況使得跨區(qū)域的重復(fù)驗(yàn)證性研究具有重要的應(yīng)用意義。雖然本研究分析了海南地區(qū)438例肺癌病人樣本和456例健康對照人樣本中rs13419896與肺癌的關(guān)系，但研究結(jié)果來源單一中心，仍需要多中心的進(jìn)一步驗(yàn)證，明確rs13419896與肺癌的關(guān)系。驗(yàn)證后的結(jié)果將為精準(zhǔn)醫(yī)療和個體化預(yù)防，提供一定的理論基礎(chǔ)和臨床參考。同時rs13419896位于HIF2A的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，為后續(xù)進(jìn)一步的功能驗(yàn)證提供便利，也為探索HIF2A基因SNP位點(diǎn)在缺氧條件下，研究調(diào)節(jié)下游靶基因的機(jī)制提供了可能。