雷 宇，黃 山，路 燕

肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌常見的病理類型。其發(fā)病隱匿，發(fā)展迅速，確診時約有超過一半的患者已失去了根治性手術(shù)機會。晚期肺癌的治療方式除了傳統(tǒng)的放化療，還包括靶向治療以及近年來興起的程序性細(xì)胞死亡蛋白-1(programmed Cell Death Protein-1，PD-1)抑制劑免疫治療，逐漸形成了根據(jù)不同的生物標(biāo)志物選擇不同治療的精準(zhǔn)治療模式[1]。這些治療方式使得一部分患者獲了較好的療效，但是隨之而來的獲得性耐藥鞭策人們繼續(xù)搜尋新的與腫瘤發(fā)生、發(fā)展或治療相關(guān)的生物標(biāo)志物。Trophinin 相關(guān)蛋白(trophinin associated protein, TROAP), 也被稱為Tastin，TROAP基因的功能研究并不深入，目前被認(rèn)為可能與胚胎發(fā)育時期的著床相關(guān)，但機制尚未完全明確[2]。

現(xiàn)通過對多個公共數(shù)據(jù)庫的發(fā)掘和整理，分析TROAP的差異表達(dá)及其對患者預(yù)后的影響。同時檢測30例肺腺癌患者腫瘤組織與癌旁組織中TROAP的表達(dá)，旨在探究其與肺腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其與患者臨床病理特征之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 大數(shù)據(jù)采集分析

1.1.1GEO數(shù)據(jù)庫 對由美國國立生物技術(shù)信息中心建立的GEO數(shù)據(jù)庫中關(guān)于非小細(xì)胞肺癌的RNASeq數(shù)據(jù)集進(jìn)行檢索，對2016年6月發(fā)布的GSE81089數(shù)據(jù)集和2012年9月發(fā)布的GSE40419數(shù)據(jù)集進(jìn)行下載，隨后應(yīng)用Cufflinks軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，標(biāo)準(zhǔn)化，通過質(zhì)控后計算相對表達(dá)量FPKM值，分析TROAP基因表達(dá)的差異性，并計算校正P值。同時還對發(fā)布于2016年5月的GSE74706數(shù)據(jù)集和發(fā)布于2010年5月的GSE19188數(shù)據(jù)集中的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行下載，分析TROAP基因?qū)?yīng)的探針?biāo)鶞y定的mRNA表達(dá)的相對水平，經(jīng)質(zhì)控檢驗及校準(zhǔn)化后，分析該基因差異表達(dá)并計算校正P值。

1.1.2GENT數(shù)據(jù)庫 韓國國立生物科學(xué)與生物技術(shù)研究所建設(shè)的GENT數(shù)據(jù)庫中主要收錄了經(jīng)U133Plus2和U133A表達(dá)譜芯片檢測的347 264例樣本中的基因表達(dá)情況。該數(shù)據(jù)集中的樣本來源廣泛，基本上包含了大部分腫瘤類型與對應(yīng)的正常組織。選取U133Plus2芯片類型進(jìn)行統(tǒng)計分析，對比TROAP基因在不同組織中的表達(dá)變化情況。

1.1.3TCGA數(shù)據(jù)庫 由美國國家癌癥和腫瘤研究所和國家人類基因組研究所聯(lián)合建立的TCGA數(shù)據(jù)庫包含了大部分人類常見的腫瘤類型數(shù)據(jù)，更重要的是其包含部分患者的預(yù)后隨訪數(shù)據(jù)，可以綜合患者生存信息進(jìn)行分析。選取TCGA數(shù)據(jù)庫中的肺腺癌RNASeq數(shù)據(jù)集(LUAD-Illuminal HiSeq)進(jìn)行分析，按照前述方法通過RNASeq數(shù)據(jù)計算TROAP表達(dá)的相對豐度，結(jié)合患者隨訪信息，繪制Kaplan-Meier生存曲線。

1.2 病例資料經(jīng)醫(yī)院倫理委員會討論同意，同時取得患者知情同意后，篩選2018年12月～2019年6月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診并經(jīng)手術(shù)或經(jīng)皮肺穿病理診斷確診的肺腺癌患者30例。其中男性14例、女性16例，年齡33～80(56.60±11.49)歲。所有入選病例均無其他腫瘤病史，均無心、肝、腎等重要臟器的嚴(yán)重器質(zhì)性病變。入選病例的臨床資料相對完整，按照國際肺癌研究協(xié)會(IASLC)第八版分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，其中Ⅰ期：10例；Ⅱ期：2例；Ⅲ期：4例；Ⅳ期：14例。

1.3 檢測方法采用免疫組化法進(jìn)行檢測，每例入選病例選取腫瘤組織與癌旁正常肺組織制作石蠟切片?？鞠?5 ℃干烤過夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇溶液浸泡。經(jīng)過檸檬酸鹽高溫修復(fù)后，過氧化氫溶液(3%)孵育30 min，PBS清洗后滴加(1 ∶500)稀釋后的一抗(兔抗人TROAP多克隆抗體，Novus Biological USA)，4 ℃孵育過夜。PBS清洗后滴加(1 ∶1 000)稀釋后的二抗孵育60 min。PBS清洗后滴加DAB工作液顯色，時間約為30 s，蘇木精復(fù)染后梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。PBS 溶液代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判讀由2位經(jīng)驗豐富的腫瘤病理醫(yī)師獨立閱片并拍照。TROAP定位于細(xì)胞質(zhì)中，通過免疫染色著色后呈現(xiàn)黃褐色。每張切片隨機選取5個視野進(jìn)行讀片，判定細(xì)胞免疫組化染色的顏色強度。細(xì)胞免疫著色為：未染色、淡黃、黃色、黃褐分別計0、1、2、3分。同時判定免疫染色陽性細(xì)胞百分比(0%～100%)。據(jù)此計算TROAP表達(dá)的組織學(xué)得分(histological Score， H-Score)[3]。H-Score=(1×著色強度為1的細(xì)胞百分比)+(2×著色強度為2的細(xì)胞百分比)+(3×著色強度為3的細(xì)胞百分比)。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)庫結(jié)果分析

2.1.1GEO數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果 通過對GEO數(shù)據(jù)庫中多組RNASeq數(shù)據(jù)和表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)的下載、整理和分析。發(fā)現(xiàn)TROAP基因在多個有關(guān)非小細(xì)胞肺癌的數(shù)據(jù)集中，肺腺癌組織內(nèi)的表達(dá)與正常肺組織相比明顯升高(表1)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.1.2GENT數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果 對GENT數(shù)據(jù)庫的分析發(fā)現(xiàn)，在U133Plus2芯片數(shù)據(jù)集中的347 264個樣本數(shù)據(jù)中，TROAP在肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、宮頸癌、膀胱癌、甲狀腺癌、肝癌、大腸癌等多種實體腫瘤與其對應(yīng)的正常組織中的表達(dá)也具有明顯差異(圖1)。

2.1.3TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果 對TCGA數(shù)據(jù)庫中患者生存數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)(圖2)，在肺腺癌RNAseq(LUAD-Illuminal HiSeq)數(shù)據(jù)集的564例肺腺癌患者中，TROAP基因高表達(dá)組(280例)的中位生存是41.2個月，而低表達(dá)組(284例)的中位生存是54.2個月，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004, Log-rank test statistics=8.181)，提示該基因高表達(dá)的肺腺癌患者較低表達(dá)者生存期短，預(yù)后不良。

表1 TROAP基因在肺腺癌與正常肺組織中的表達(dá)差異情況

圖1 TROAP基因在多種腫瘤與對應(yīng)正常組織中的表達(dá)差異

Y軸：表達(dá)譜芯片檢測TROAP基因表達(dá)豐度的對數(shù)值(Log2)；X軸：各種腫瘤與其對應(yīng)的正常組織，C-腫瘤、N-正常組織

圖2 TROAP基因的表達(dá)豐度與肺腺癌患者生存的關(guān)系(Kaplan Meier生存曲線)

2.2 肺腺癌及癌旁肺組織中TROAP的表達(dá)情況免疫組化染色顯示在肺腺癌組織中，該基因存在高表達(dá)，免疫染色呈黃褐色，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中(圖3A)，這與TROAP理論上的細(xì)胞定位一致。而在癌旁正常肺組織中，免疫染色較淡，提示其在正常肺組織中表達(dá)量較低(圖3B)。

圖3 免疫組化檢測TROAP在肺腺癌與癌旁正常肺組織中的表達(dá) ×400

A：TROAP在肺腺癌組織中表達(dá)量較高，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中；B：TROAP在癌旁正常肺組織中無明顯表達(dá)

對30例肺腺癌患者的腫瘤-癌旁配對組織進(jìn)行免疫組化染色，計算H-Score。結(jié)果顯示(圖4A)在30對樣本中，腫瘤組織TROAP的H-Score比癌旁正常組織升高的有25對(83.3%)，其中明顯升高(H-Score升高2倍以上)的有11對(36.7%)。

對TROAP表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)(圖4B)，30例肺腺癌組的H-Score為150.00(100.00，180.00)，30例癌旁正常肺組織的H-Score為80.00(58.75，125.00)。通過Wilcoxon配對樣本的秩和檢驗發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常肺組織相比，肺腺癌組織中的TROAP表達(dá)的H-Score明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-4.198，P=2.69×10-5)。

圖4 TROAP H-Score 在肺腺癌與癌旁正常肺組織中的比較

A：30對腫瘤-癌旁組織中的TROAP H-Score分布情況；B：肺腺癌組與癌旁正常肺組織組中的TROAP H-Score，與正常肺組織相比，*P<0.05

2.3 TROAP的表達(dá)與肺腺癌患者的臨床病理聯(lián)系結(jié)果如表2所示：TROAP表達(dá)的H-Score在腫瘤分期較晚(Ⅲ～Ⅳ期)的患者中明顯高于分期較早(Ⅰ～Ⅱ期)的患者(Z=-2.064，P=0.039)；在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M1)者中明顯高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M0)者(Z=-2.152，P=0.031)；在細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki-67高表達(dá)(≥15%)的患者中明顯高于低表達(dá)(<15%)的患者(Z=-2.728，P=0.006)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。而在患者其他臨床病理特征(性別、年齡、T分期、N分期、有無吸煙史、有無胸腔積液以及EGFR突變狀態(tài))之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

TROAP基因的結(jié)構(gòu)和功能于1995年由Fukuda et al[2]首次報道，該團(tuán)隊在研究滋養(yǎng)層細(xì)胞與子宮內(nèi)膜細(xì)胞的黏附機制時發(fā)現(xiàn)將該基因與TRO基因(Trophinin)的cDNA同時轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞后，原本沒有黏附能力的COS細(xì)胞獲得了黏附子宮內(nèi)膜細(xì)胞的能力。而單獨轉(zhuǎn)染其中之一以后，COS細(xì)胞則無法獲得黏附能力。并發(fā)現(xiàn)TROAP與TRO基因的表達(dá)高峰與胚胎著床的時間窗一致，推測其可以促進(jìn)胚胎細(xì)胞增殖以及滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜的過程[4-5]。在正常組織中，該基因在睪丸、骨髓、小腸、胸腺和胎兒肝臟中表達(dá)量較高，而在其他絕大部分正常組織中表達(dá)量低或缺失[6]。然而TROAP基因在腫瘤組織中的表達(dá)和作用機制卻鮮有報道。一些小樣本研究提示該基因在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，并推測其表達(dá)豐度影響患者的預(yù)后[7-8]。

表2 TROAP在肺腺癌組織中的表達(dá)與患者

本研究分析了多個公共數(shù)據(jù)庫，顯示TROAP基因在肺腺癌組織中的表達(dá)較正常組織明顯升高。在其他多種實體瘤中也具有類似表達(dá)特征。該基因的表達(dá)豐度與肺腺癌患者的生存相關(guān)。高表達(dá)TROAP基因的肺腺癌患者生存期較低表達(dá)者明顯縮短。提示該基因很可能參與腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖和侵襲，并且其表達(dá)水平影響肺腺癌患者的生存，可能作為潛在的肺腺癌發(fā)病、治療以及判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物。

肺腺癌患者TROAP表達(dá)免疫組化染色結(jié)果提示：該基因在肺腺癌患者腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常肺組織。這一結(jié)果與上述多個公共數(shù)據(jù)庫分析得出的結(jié)果相吻合。提示該基因可能參與了肺腺癌的發(fā)生過程。在肺腺癌患者中，TROAP基因的表達(dá)在不同疾病分期、是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及不同Ki-67表達(dá)中存在顯著差異?；颊呒膊》制谕?、存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和Ki-67高表達(dá)者腫瘤組織中的TROAP含量高。Ki-67與細(xì)胞分裂活躍程度正相關(guān)，表示肺腺癌細(xì)胞的增殖速度[9]。提示TROAP表達(dá)越高的患者，腫瘤增殖速度越快，越容易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，同時腫瘤分期也越晚。

就具體分子機制而言，目前的研究[10]表明TROAP通過與TRO和Bystin形成復(fù)合物而被激活，促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的快速增殖并侵入子宮內(nèi)膜基質(zhì)中，其分子機制可能與細(xì)胞膜表面erbB4受體酪氨酸激酶的異常活化有關(guān)。而惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移以及快速增殖的行為恰恰類似于胚胎發(fā)育和著床過程中滋養(yǎng)層細(xì)胞與子宮內(nèi)膜細(xì)胞的黏附，侵入子宮內(nèi)膜基質(zhì)以及隨后的迅速增殖。然而近年來該基因在腫瘤中的機制研究較少，尚待深入探索。一些體外研究[11-12]顯示下調(diào)該基因后，腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力受到抑制，可能與WNT3/survivin信號通路的調(diào)控有關(guān)。此外還有少量研究表明，TROAP基因可能與細(xì)胞有絲分裂過程中紡錘體的形成有關(guān)，其缺失后會造成細(xì)胞分裂時產(chǎn)生多極紡錘體，然而機制尚不十分明確[13]。

本研究還分析了TROAP的表達(dá)與患者EGFR突變狀態(tài)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)與患者EGFR突變狀態(tài)無明顯關(guān)聯(lián)，提示該基因的作用可能是獨立于EGFR這一著名肺癌驅(qū)動基因的。也就是說患者經(jīng)過針對EGFR突變基因的靶向治療出現(xiàn)耐藥后，有望針對TROAP設(shè)計靶向治療藥物而獲得一定的療效。