盧錦斌,張利敏,徐秀容*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,陜西 楊凌712100；2.陜西華秦農(nóng)牧科技有限公司,陜西 楊凌712100)

蛋白質(zhì)是維持畜禽健康和生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。畜禽的蛋白質(zhì)來(lái)源是飼料，因此飼料中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定是生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。而蛋白質(zhì)的測(cè)定方法有很多，有傳承一百多年的經(jīng)典方法，也有快速高效的新方法，但這些方法都存在一定的局限性和適用范圍。那么，不同規(guī)模的飼料、食品生產(chǎn)企業(yè)或?qū)嶒?yàn)室所用的方法是否一致？經(jīng)典的凱氏定氮法為何至今仍被廣泛應(yīng)用？對(duì)經(jīng)典方法中存在的主要間題即耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)如何改進(jìn)？本文擬對(duì)凱氏定氮法的改良研究進(jìn)行綜合論述，以期回答當(dāng)代凱氏定氮法的應(yīng)用價(jià)值，并且對(duì)如何更快速準(zhǔn)確測(cè)定蛋白質(zhì)含量提出討論和建議。

1 蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法

1.1 分類

蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法根據(jù)原理可分為間接測(cè)定法和直接測(cè)定法[1]。間接法包括凱氏定氮法、杜馬斯燃燒法等，是先測(cè)出樣品的含氮量再換算出蛋白質(zhì)含量；直接法是依據(jù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)直接測(cè)出樣品的蛋白質(zhì)含量，如超聲波法、分光光度法及近紅外光譜法等。其中，凱氏定氮法被國(guó)際公認(rèn)為測(cè)定蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)方法。

1.2 優(yōu)缺點(diǎn)比較

凱氏定氮法之外的其他方法都各具優(yōu)點(diǎn)，甚至在縮短檢測(cè)時(shí)間、提高檢測(cè)準(zhǔn)確度、節(jié)約能源、減少污染及實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)上的實(shí)時(shí)檢測(cè)等方面領(lǐng)先于凱氏定氮法，但都因存在較大的不足之處而未能廣泛應(yīng)用。如：杜馬斯燃燒法的前處理簡(jiǎn)單，可自動(dòng)加樣，大大節(jié)省檢測(cè)時(shí)間和人力成本，而且在封閉的環(huán)境中進(jìn)行，不會(huì)造成環(huán)境污染，是理想的蛋白質(zhì)測(cè)定方法，但由于其對(duì)反應(yīng)條件的要求較高、儀器較貴且不易維修等原因，不適用于小規(guī)模企業(yè)或?qū)嶒?yàn)室；分光光度法操作簡(jiǎn)便、測(cè)定快速、準(zhǔn)確度高，但一般只適用于檢測(cè)可溶性蛋白且對(duì)于溶液環(huán)境要求高，靈敏度易受干擾，所以不太適用于實(shí)際生產(chǎn)；近紅外光譜分析技術(shù)是無(wú)損檢測(cè)技術(shù)的一種，具有無(wú)損、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)在線實(shí)時(shí)檢測(cè)，可檢測(cè)飼料樣品中的大多數(shù)成分，具有廣泛的應(yīng)用前景，但需要提前建立足夠大的樣品數(shù)據(jù)庫(kù)，這是一個(gè)冗雜的工作，而且近紅外儀器價(jià)格昂貴，現(xiàn)階段對(duì)于大多數(shù)企業(yè)來(lái)說(shuō)尚不適用。

1.3 凱氏定氮法

目前中國(guó)飼料中粗蛋白的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)(GB/T6432-2018)采用的便是凱氏定氮法，其原理是：樣品在濃硫酸中加熱消煮，在催化劑的作用下分解出氨氣與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，再通過(guò)堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，通過(guò)消耗的酸的體積即可計(jì)算該樣品的蛋白質(zhì)含量[2]。

凱氏定氮法雖然準(zhǔn)確，但耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)樣品的消煮至少需要3 h，導(dǎo)致工作效率不高。并且其測(cè)定結(jié)果易受干擾，如消化時(shí)間短、消煮溫度較低或過(guò)高、蒸餾時(shí)間過(guò)短等，都會(huì)影響準(zhǔn)確度。而樣品粉碎度、裝置封閉性等也影響結(jié)果[3-4]。此外，樣品在全過(guò)程中進(jìn)行的重復(fù)性試驗(yàn)也可能產(chǎn)生差異[5]。為解決這些問(wèn)題，一直以來(lái)人們都在對(duì)凱氏定氮法進(jìn)行改良。

2 國(guó)內(nèi)外改良研究概況

對(duì)于凱氏定氮法的改良，圍繞消煮、蒸餾及滴定3個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行。

2.1 消煮環(huán)節(jié)

凱氏定氮法耗時(shí)最長(zhǎng)的環(huán)節(jié)就是消煮過(guò)程，一般至少需要3 h，有時(shí)長(zhǎng)達(dá)6 h。消煮不僅耗時(shí)，而且消耗大量電能。因此，對(duì)消煮環(huán)節(jié)進(jìn)行改良，既可以縮短時(shí)間也可以節(jié)約能源。消煮環(huán)節(jié)的改良從催化劑和消化液兩個(gè)方面入手。傳統(tǒng)凱氏定氮法催化劑為CuSO4·5H2O與K2SO4(1∶15)混合催化劑，即0.4 g CuSO4·5H2O與6 g K2SO4混勻，搭配12 mL H2SO4消化液。也有一些研究人員使用3.4 g混合催化劑搭配10 mL消化液。

2.1.1 催化劑

2.1.1.1 硒 傳統(tǒng)的凱氏定氮法大量使用混合催化劑和濃硫酸易造成環(huán)境污染。硒(Se)是常見(jiàn)的化學(xué)催化劑，具有價(jià)格低、反應(yīng)溫和、對(duì)環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)。自19世紀(jì)30年代以來(lái)，Se就開(kāi)始被用作凱氏定氮法中的催化劑，此后幾十年有關(guān)報(bào)道不斷[6-9]。Ashton[10]使用0.2 g的Se作為催化劑，用凱氏定氮法分別測(cè)定土壤和草中的蛋白含量，發(fā)現(xiàn)當(dāng)草中轉(zhuǎn)化出的含氮量相同時(shí)，Se的催化時(shí)間比CuSO4節(jié)省90 min左右；而如果要把土壤中的氮全部轉(zhuǎn)化成硫酸銨，用Se催化最快只需3 h，而用CuSO4催化則需要24 h，結(jié)果表明以Se作為催化劑的反應(yīng)時(shí)間優(yōu)于CuSO4作為催化劑的時(shí)間。Bremner[11]在綜述前人研究的基礎(chǔ)上對(duì)比了使用硒、汞、銅3種催化劑的凱氏定氮法測(cè)定土壤中蛋白含量的差異，發(fā)現(xiàn)3種催化劑的催化效率排序?yàn)槲?汞>銅。

陸曉濱等[12]試驗(yàn)表明使用硒粉作為催化劑的最佳用量為0.15～0.20 g，并且對(duì)比了分別用硒粉和硫酸銅作催化劑對(duì)樣品的消煮效果，結(jié)果表明當(dāng)達(dá)到同樣催化效率時(shí)，硒粉組用時(shí)30 min，硫酸銅組用時(shí)80 min，說(shuō)明硒粉可大大提高催化效率。李萍等[13]以硒粉替代CuSO4作為催化劑測(cè)定污泥中的蛋白含量，確定了硒粉的最佳添加量為0.15 g，該條件下，當(dāng)污泥中的氮素完全轉(zhuǎn)化為NH4+時(shí)，硒粉催化用時(shí)1 h，CuSO4用時(shí)1.5 h，表明該法與傳統(tǒng)凱氏定氮法相比時(shí)間縮短，且結(jié)果誤差小、穩(wěn)定可靠。在生產(chǎn)中，硒粉與K2SO4被按照一定的比例制成定氮催化片，使用更為方便。

2.1.1.2 過(guò)氧化氫 H2SO4與混合催化劑組合法消化效果好, 但在反應(yīng)時(shí)容易產(chǎn)生大量泡沫，造成反應(yīng)不均勻或氮素隨著泡沫溢出而損失，若不能消除泡沫，則無(wú)法實(shí)現(xiàn)快速分解。在食品檢驗(yàn)中常用H2O2消泡，而適當(dāng)加大H2O2的量可促使樣品快速分解，該方法稱之為雙氧水測(cè)定法。Bowman等[14]向100 mg植物組織中加入3 mL H2O2置于100 ℃預(yù)處理15 min，發(fā)現(xiàn)加入H2O2不僅起到消泡作用，還使植物中的NO3-N減少到最小，測(cè)定的準(zhǔn)確性提高了，整個(gè)消煮過(guò)程也只用了1 h左右。苗雪原[15]采用H2O2-H2SO4-混合催化劑法對(duì)粗蛋白含量為30.4%的魚(yú)用配合飼料進(jìn)行測(cè)定，將混合催化劑和H2SO4用量分別減少到3.5 g和10 mL，試樣仍可以快速分解，且消化總時(shí)間為0.5 h，檢驗(yàn)結(jié)果不僅與原法高度一致，且準(zhǔn)確度與精密度都優(yōu)于國(guó)標(biāo)要求。

H2O2-H2SO4-混合催化劑法是利用H2O2部分替代混合催化劑進(jìn)行反應(yīng)，在實(shí)踐中該方法進(jìn)一步得到改良，采用H2O2完全替代混合催化劑的方案不僅有效而且節(jié)省試劑。趙德志等[16]用H2O2替代國(guó)標(biāo)法中的混合催化劑對(duì)魚(yú)粉和棉粕進(jìn)行測(cè)定，不經(jīng)過(guò)消化爐消煮即可分解樣品，試驗(yàn)結(jié)果與國(guó)標(biāo)法的比值穩(wěn)定在1.715左右，誤差僅為0.041%，符合國(guó)標(biāo)法規(guī)定的<1%。而采用該方法測(cè)定不同產(chǎn)地的同種樣品，所測(cè)值的波動(dòng)性較小，穩(wěn)定性較好。

2.1.1.3 氯化鋇 強(qiáng)堿直接蒸餾法(Direct Distillation，俗稱DD法)是間接測(cè)定飼料蛋白含量的一種簡(jiǎn)便方法，其與傳統(tǒng)凱氏定氮法最大區(qū)別在于將樣品在強(qiáng)堿溶液中消化，使其快速分解，一般采用的是氯化鋇溶液。李秀玲等[17]向裝有1 g甘薯試樣的凱式瓶中加15 mL10%氯化鋇溶液，再加40～50 mL 45%氫氧化鈉溶液，立即連接蒸餾裝置，后續(xù)操作與國(guó)標(biāo)法無(wú)異。試驗(yàn)測(cè)得的不穩(wěn)定氮量與國(guó)標(biāo)法測(cè)得全氮量之間存在回歸方程：y=0.6934x+0.2576，相關(guān)系數(shù)r=0.9840。王濰波[18]用該法測(cè)魚(yú)粉、玉米蛋白粉和豆粕的蛋白含量，結(jié)果與國(guó)標(biāo)法相差不大，標(biāo)準(zhǔn)差在允許范圍之內(nèi)，證明該方法與國(guó)標(biāo)法具有相同準(zhǔn)確度。

2.1.2 消化液 對(duì)凱氏定氮法的改良，大部分是在催化劑方面，而消化液的報(bào)道較少。傳統(tǒng)的H2SO4消化液適用于大多數(shù)樣品，但有時(shí)候消化能力有限。據(jù)梁芳珍[19]考證，Betay于1974年利用H2SO4-HClO4混合消化液測(cè)定植物樣品含氮量，能縮短消化時(shí)間，但用于無(wú)腺棉仁的效果不足。其在此體系基礎(chǔ)之上，提出用H2SO4-HClO4-H2O2混合體系測(cè)定無(wú)腺棉仁蛋白含量，結(jié)果比標(biāo)準(zhǔn)值略低，但在誤差范圍內(nèi)。

2.2 蒸餾環(huán)節(jié)

傳統(tǒng)的凱氏定氮法用的是手動(dòng)蒸餾裝置，一般常用的是半微量蒸餾法。隨著設(shè)備制造技術(shù)的發(fā)展，半自動(dòng)凱氏定氮儀和全自動(dòng)凱氏定氮儀相繼問(wèn)世，凱氏定氮法的自動(dòng)化程度提高。

2.2.1 半自動(dòng)定氮儀 半自動(dòng)凱氏定氮儀是自動(dòng)進(jìn)行蒸餾過(guò)程的裝置，樣品消煮完后放入定氮儀中，關(guān)閉安全門(mén)，啟動(dòng)程序，機(jī)器即可自動(dòng)對(duì)樣品進(jìn)行加試劑、蒸餾。半自動(dòng)凱氏定氮儀的應(yīng)用是對(duì)人力的一大解放，也使得測(cè)定的精確度大大提高。羅源[20]使用KDY-04(A)半自動(dòng)定氮儀測(cè)定不同種類樣品的蛋白含量，測(cè)定結(jié)果與凱氏定氮法相比無(wú)顯著差異，精密度和準(zhǔn)確度均理想。張曉影等[21]指出不同檢測(cè)人員使用半自動(dòng)定氮儀所測(cè)結(jié)果符合允許誤差范圍，滿足試驗(yàn)要求。半自動(dòng)定氮儀自動(dòng)化程度高、精確度高且價(jià)格便宜，能滿足大多數(shù)飼料生產(chǎn)企業(yè)的使用需求。但使用前后要進(jìn)行空蒸，以清洗管道、降低誤差[22]。

2.2.2 全自動(dòng)定氮儀 全自動(dòng)定氮儀的自動(dòng)化程度比半自動(dòng)定氮儀更高，不僅可以自動(dòng)加試劑自動(dòng)蒸餾，還可以自動(dòng)滴定、自動(dòng)計(jì)算。蔣江虹等[23]報(bào)道用FOSS2300型全自動(dòng)定氮儀測(cè)定大豆樣品結(jié)果與經(jīng)典方法無(wú)顯著差異，認(rèn)為該法有效減少人為操作誤差帶來(lái)的影響，可作為優(yōu)選方法推廣使用。黃瑾等[24]用BuchiK-370全自動(dòng)定氮儀測(cè)定不同濃度的飼料蛋白含量，準(zhǔn)確度高，與半微量蒸餾法的最大相對(duì)偏差僅為0.51%，也說(shuō)明了全自動(dòng)定氮儀的使用價(jià)值。但全自動(dòng)定氮儀較為昂貴，小規(guī)模企業(yè)或?qū)嶒?yàn)室可能不具備購(gòu)置條件。

2.3 滴定環(huán)節(jié)

傳統(tǒng)凱氏定氮法的滴定，是在試樣的蒸餾分解液中加入甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑，再用0.1 mol/L或0.02 mol/L的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，當(dāng)溶液由藍(lán)色變?yōu)榛壹t色時(shí)為滴定終點(diǎn)，此時(shí)根據(jù)鹽酸的消耗體積進(jìn)行計(jì)算，從而得出數(shù)值。在前人的改良中，常見(jiàn)的是替換指示劑和標(biāo)準(zhǔn)溶液，也有采用酸度計(jì)標(biāo)定的。

2.3.1 指示劑與標(biāo)準(zhǔn)溶液 凱氏定氮法的指示劑一般是甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑，是甲基紅0.1%乙醇溶液與溴甲酚綠0.5%乙醇溶液等體積混合而來(lái)，常見(jiàn)的還有用甲基紅-次甲基藍(lán)混合指示劑。Scanlan[25]在測(cè)定皮革和面筋中的氮含量時(shí)，選擇苯甲酰胺作為指示劑，試驗(yàn)證明苯甲酰胺作為指示劑優(yōu)于甲基紅指示劑。趙德志[16]在使用雙氧水測(cè)定法時(shí)，使用酚酞試劑作為新方法的指示劑，作為對(duì)照的傳統(tǒng)方法依然用混合指示劑，但是其沒(méi)有對(duì)此進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

李維美等[26]測(cè)定樣品蛋白含量，消煮、蒸餾步驟與傳統(tǒng)凱氏定氮法一樣，僅在滴定階段利用碘酸氫鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液替代鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定結(jié)果變異系數(shù)0.35%比傳統(tǒng)方法要小，準(zhǔn)確度高。

2.3.2 酸度計(jì) 酸度計(jì)又稱作pH計(jì)，是測(cè)定溶液酸堿度的儀器，具有快速、精確的優(yōu)點(diǎn)。賈麗艷等[27]在測(cè)定綠豆粉蛋白含量的滴定過(guò)程中，將酸度計(jì)法與混合指示劑法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法測(cè)得的結(jié)果相近，準(zhǔn)確度和精密度都符合要求。

3 小 結(jié)

凱氏定氮法作為測(cè)定蛋白含量的經(jīng)典方法，在無(wú)損檢測(cè)技術(shù)廣泛應(yīng)用的時(shí)代仍然具有應(yīng)用價(jià)值和代表性。本文探討了凱氏定氮法3個(gè)環(huán)節(jié)的改良問(wèn)題，實(shí)際上關(guān)于凱氏定氮法改良的重點(diǎn)是關(guān)于消煮環(huán)節(jié)的改進(jìn)，如何高效催化樣品又不造成氮的損失是研究這一問(wèn)題的關(guān)鍵。

研究人員對(duì)于凱氏定氮法的改良主要集中在縮短檢測(cè)時(shí)間和提高準(zhǔn)確度這兩點(diǎn)，但不同改良方法對(duì)于不同樣品所測(cè)結(jié)果可能不同。本文總結(jié)前人的研究，提出在凱氏定氮法改良領(lǐng)域尚待解決的一些問(wèn)題：(1)是否存在一種對(duì)于不同飼料原料來(lái)說(shuō)都適用且在縮短檢測(cè)時(shí)間和提高準(zhǔn)確度上面都具有優(yōu)勢(shì)的改良方案？(2)目前的改良法大多針對(duì)單個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行改良，而把不同環(huán)節(jié)改良法組合起來(lái)的改良方案是否更具有檢測(cè)方面的優(yōu)勢(shì)？(3)不經(jīng)過(guò)消化爐消煮即可分解樣品的改良方案其準(zhǔn)確性究竟如何，是否具有可行性？因此，凱氏定氮法的改良還可以進(jìn)一步探討。