李雪蓮 王嵐 楊杰 陳曉琴 劉琦

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550004)

胃腸功能紊亂可導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)吸收障礙，降低機(jī)體防御功能〔1,2〕。當(dāng)腸黏膜發(fā)生破壞時(shí)，會(huì)使機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)及多器官功能失常等〔3〕。臨床上，非甾體類(lèi)抗炎藥(NSAIDs)是常用的抗炎藥物之一，被廣泛用于關(guān)節(jié)炎、傷寒類(lèi)、炎癥、腰痛和膠原類(lèi)等疾病的治療〔4〕。其通過(guò)抑制花生四烯酸代謝過(guò)程中的環(huán)氧化酶來(lái)發(fā)揮藥效，包括抗炎、鎮(zhèn)痛及解熱等藥效〔5〕。但NSAIDs能夠誘發(fā)胃腸道損傷、溶血、穿孔及腎損害等〔6,7〕。盡管NSAIDs具有十分重要的臨床價(jià)值，但其不良反應(yīng)，尤其是對(duì)小腸黏膜出血及損傷作用需要被重視〔8〕。白蛋白的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)是機(jī)體重要的生理功能。首先，可以維持內(nèi)皮屏障的完整性，使內(nèi)膜屏障得到增強(qiáng)〔9〕。其次，其具有協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)的作用，白蛋白會(huì)與機(jī)體內(nèi)的多種物質(zhì)結(jié)合，包括與藥物的結(jié)合，協(xié)助物質(zhì)跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)〔10〕。白蛋白的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)與機(jī)體的防御功能有密切關(guān)系〔11〕。研究證實(shí)，白蛋白與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的氨基酸序列十分相似，因此具有重要的生理意義〔12〕。本研究探討小腸出血損傷對(duì)大鼠腸黏膜內(nèi)跨細(xì)胞白蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，從而為研究NSAIDs腸黏膜損傷的發(fā)生機(jī)制及其對(duì)腸黏膜中白蛋白跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 40只SD雄性大鼠，體重240～280 g，購(gòu)自北京維通利華公司。雙氯芬酸(商品名：戴芬)購(gòu)自德國(guó)克林格公司；一氧化氮(NO)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；牛血清白蛋白購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)公司；異硫氰酸熒光素購(gòu)自上海朝暉制藥廠。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及給藥 采用隨機(jī)法分為對(duì)照組和模型組，每組20只。每組再隨機(jī)分為急性期(T1)亞組和亞急性期(T2)亞組，每組10只。對(duì)照組以1 ml純化水灌胃；模型組以7.5 mg/kg雙氯芬酸灌胃建立腸黏膜損傷模型。T1亞組灌胃1 d斷頸處死；T2亞組灌胃5 d斷頸處死。大鼠禁食，不禁水24 h，用1%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉后斷頸處死，肉眼觀測(cè)全小腸黏膜損傷情況并評(píng)分。實(shí)驗(yàn)結(jié)束取下腔靜脈血10 ml，2 000 r/min離心10 min后取上清液，-20℃保存，用于后續(xù)血液指標(biāo)的測(cè)定；用肝素化生理鹽水30 ml(25 kU/L)經(jīng)腸系膜上動(dòng)脈沖洗小腸血管，收集小腸黏膜標(biāo)本用于后續(xù)檢測(cè)。

1.3小腸損傷程度大體評(píng)分 依據(jù)Reuter評(píng)分法對(duì)大鼠小腸損傷程度進(jìn)行大體評(píng)分。主要分為潰瘍和粘連兩種評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。粘連：0分為無(wú)粘連；1分為粘連較輕；2分為粘連較重。潰瘍?cè)u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為未出現(xiàn)潰瘍；1分為小腸局部充血，然而未見(jiàn)潰瘍；2分為小腸潰瘍不伴充血或腸壁增厚；3分為一個(gè)部位出現(xiàn)潰瘍與炎癥；4分為兩個(gè)或更多部位有潰瘍或炎癥；5分為存在小腸穿孔。潰瘍?cè)u(píng)分和粘連評(píng)分之和為總分值。

1.4小腸損傷的病理評(píng)分 利用Chiu氏評(píng)分法對(duì)小腸損傷程度進(jìn)行病理評(píng)分。分為5個(gè)等級(jí)，即0～5分。5分為小腸絨毛脫落，出血和潰瘍形成；4分為小腸上皮細(xì)胞脫落壞死，部分絨毛脫落，毛細(xì)血管充血或擴(kuò)張；3分為小腸固有層有水腫，小腸黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生壞死，少數(shù)小腸絨毛頂端發(fā)生脫落；2分表示小腸中度固有層水腫，小腸上皮間隙擴(kuò)大，中央乳糜管擴(kuò)張；1分表示小腸毛細(xì)血管充血，并伴有絨毛頂端上皮下出現(xiàn)囊狀間隙；0分表示小腸黏膜絨毛正常。樣本在光學(xué)顯微鏡下觀察，每個(gè)樣本取20個(gè)視野。

1.5檢測(cè)血清NO含量 利用硝酸還原酶法測(cè)定NO含量。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。NO含量(μmol/L)=(測(cè)定管的吸光度-空白管的吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度-空白管的吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(100 μmol/L)×樣本測(cè)試前的稀釋倍數(shù)。

1.6血清白蛋白水平檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取下腔靜脈血10 ml，2 000 r/min離心10 min后取上清液。采用溴酚綠法測(cè)定。

1.7測(cè)定大鼠小腸血管壁的通透性 取500 mg大鼠小腸空腸組織，加入生理鹽水(5 ml/g組織)后勻漿，3 500 r/min離心10 min后取上清液，加入等量飽和硫酸銨混勻，4℃放置12 h，3 500 r/min離心15 min后取上清液測(cè)熒光值，據(jù)此推算小腸組織熒光白蛋白含量，以此反映小腸血管壁的通透性。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件行LSD-t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活情況 對(duì)照組中的T1和T2亞組大鼠全部存活；模型組中的T1亞組全部存活，T2亞組在第5天死亡3只。死亡原因?yàn)槟c道穿孔和腹腔感染。

2.2小腸損傷程度大體評(píng)分 模型組小腸大體損傷指數(shù)評(píng)分明顯高于對(duì)照組(T1、T2亞組均為0.0分)(P<0.05)；與T1模型組(3.0分)相比，T2模型組(5.5分)小腸的損傷情況明顯加重(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.3小腸損傷程度病理評(píng)分 模型組(T1、T2亞組分別為2.5分、5.0分)小腸黏膜損傷病理指數(shù)評(píng)分顯著高于比對(duì)照組(T1、T2亞組均為0.0分，P<0.05)；T1模型組小腸黏膜見(jiàn)潰瘍、糜爛、紅斑，局部見(jiàn)腸腔囊樣擴(kuò)張；T2模型組3只大鼠小腸黏膜存在竇道形成、腸穿孔、腸腔狹窄和潰瘍。T2模型組小腸黏膜的損傷情況比T1模型組更嚴(yán)重(P<0.05)。

圖1 各組小腸損傷程度光學(xué)顯微鏡下觀察

2.4各組血清NO和白蛋白含量比較 T1模型組血清NO含量顯著低于T1對(duì)照組(P<0.05)；T2模型組顯著高于T1對(duì)照組和T1模型組(P<0.05)。T1、T2模型組血清白蛋白含量顯著低于T1、T2對(duì)照組(P<0.05)，與T1模型組相比，T2模型組顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組血清NO、白蛋白含量比較

與T1對(duì)照組比較:1)P<0.05；與T1模型組比較:2)P<0.05；與T2對(duì)照組比較：3)P<0.05

2.5各組小腸血管壁通透性比較 與T1、T2對(duì)照組〔熒光標(biāo)記白蛋白(0.853±0.091)、(0.826±0.094)μmol/g〕相比，T1、T2模型組通透性〔(1.213±0.114)、(1.563±0.207)μmol/g〕明顯增加(P<0.05)，與T1模型組相比，T2模型組顯著升高(P<0.05)。

3 討 論

NSAIDs可誘發(fā)腸黏膜損傷，其導(dǎo)致的腸道損傷包括黏膜炎癥、吸收障礙、黏膜潰瘍、腹瀉、出血穿孔及腸腔狹窄等〔13〕。腸道黏膜屏障由生物屏障、機(jī)械屏障、免疫屏障和化學(xué)屏障構(gòu)成。相互連接緊密的腸黏膜上皮構(gòu)成腸道黏膜的機(jī)械屏障。由腸黏膜上皮細(xì)胞分泌的腸腔內(nèi)正常菌群及消化液、黏液組成。腸道內(nèi)的分泌型抗體及分布在腸黏膜淋巴組織構(gòu)成腸道黏膜屏障的免疫屏障。腸內(nèi)正常菌群對(duì)外來(lái)菌株的抵抗作用構(gòu)成了腸道黏膜屏障的生物屏障。本研究結(jié)果證實(shí)，雙氯芬酸會(huì)導(dǎo)致小腸黏膜損傷，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，會(huì)加重小腸黏膜的損傷程度。由于雙氯芬酸是腸溶性藥物，主要在腸道被吸收，因此會(huì)造成明顯的腸道損傷，腸黏膜可見(jiàn)細(xì)胞脫落和糜爛，且進(jìn)一步檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)由氧化應(yīng)激引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、空腸細(xì)胞自噬形成、絨毛減少及線粒體損傷。

NO可以修復(fù)胃腸黏膜潰瘍，從而保護(hù)胃腸道。同時(shí)，NO對(duì)NSAIDs導(dǎo)致的腸黏膜潰瘍也具有保護(hù)作用，主要通過(guò)抑制腸道運(yùn)動(dòng)過(guò)強(qiáng)、阻止細(xì)菌轉(zhuǎn)移、增加黏液的分泌量來(lái)完成。NSAIDs會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)性NO合酶活性降低，從而減少NO的生成量，使細(xì)胞發(fā)生凋亡，延遲了修復(fù)的過(guò)程〔14〕。研究發(fā)現(xiàn)，NO產(chǎn)量過(guò)高時(shí)，會(huì)引起細(xì)胞的毒性作用，可以抑制細(xì)胞內(nèi)線粒體的呼吸作用，該過(guò)程造成黏膜細(xì)胞氧化損傷，最終損傷腸道黏膜〔15〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NO參與雙氯芬酸誘發(fā)的小腸黏膜損傷過(guò)程。本研究還發(fā)現(xiàn)，在小腸黏膜損傷后，大鼠血清白蛋白的含量也出現(xiàn)下降趨勢(shì)，血清白蛋白下降的主要原因可能是由于毛細(xì)血管通透性的增加，而后期則可能是由于血容量增加和白蛋白合成速率降低的共同作用。同時(shí)，在對(duì)大鼠注射熒光標(biāo)記白蛋白后，發(fā)現(xiàn)雙氯芬酸導(dǎo)致小腸出血損傷后，會(huì)使小腸血管壁的通透性增加。

綜上所述，雙氯芬酸能夠誘發(fā)急性或亞急性的腸黏膜損傷，導(dǎo)致小腸黏膜出血、糜爛甚至潰瘍。并證實(shí)NO可能參與腸黏膜的損傷過(guò)程，同時(shí)小腸出血會(huì)導(dǎo)致血清中白蛋白含量降低，使小腸血管壁的通透性增加。