胡若冰，楊玉秀，李修嶺，丁輝，韓雙印，丁松澤，孫鎖峰

（鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，河南 鄭州 450003）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，以下簡(jiǎn)稱肝癌）是世界范圍內(nèi)常見惡性腫瘤之一，約占人類腫瘤6%，具有浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移性強(qiáng)特點(diǎn)，其病死率僅次于胃癌和肺癌，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康和生活質(zhì)量[1-2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）統(tǒng)計(jì)，2012年全世界一半以上新發(fā)生肝癌患者來(lái)自我國(guó)，肝癌早期臨床癥狀不明顯，確診時(shí)多數(shù)患者已達(dá)中晚期，切除率不超過(guò)30%，肝癌術(shù)后易復(fù)發(fā)，化療易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致肝癌預(yù)后效果較差，5年總生存率不超過(guò)10%[3-4]。因此，研究肝癌發(fā)生機(jī)制并尋找有效治療手段迫在眉睫。肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程極其復(fù)雜，涉及多種分子信號(hào)通路參與。氯喹（chloroquine）是一種治療瘧疾、類風(fēng)濕性疾病的藥物，同時(shí)也是自噬（autophagy）抑制劑，可通過(guò)選擇性地抑制細(xì)胞酸性溶酶體的降解作用而抑制自噬，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5-6]。氯喹可以通過(guò)miR-26 b 靶向調(diào)控Mcl-1水平誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞Hep G2凋亡[7]，氯喹還可以使肝癌組織G0/G1期細(xì)胞周期停滯，誘導(dǎo)DNA損壞并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。細(xì)胞生理反應(yīng)不僅含有增殖、凋亡、侵襲、遷移過(guò)程，還包括細(xì)胞自噬。自噬屬于II型程序性死亡，參與細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程。雖然氯喹對(duì)肝癌細(xì)胞有抑制增殖、促凋亡的作用，但是有關(guān)氯喹對(duì)肝癌組織自噬的研究報(bào)道較少，本研究通過(guò)肝癌細(xì)胞Huh7體外實(shí)驗(yàn)以及建立肝癌Huh7裸鼠腫瘤模型，探討氯喹對(duì)肝癌的抑制作用以及對(duì)自噬的影響，為臨床肝癌治療方案制定，提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)用裸鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），人肝癌細(xì)胞株H u h 7 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院（上海），自噬體膜蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-I I/自噬體膜蛋白微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3-I（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3-II/LC3-I）、p62一抗（Thermo Fisher），LC3（Sigma）、p62（MBL）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物培養(yǎng) SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)用裸鼠75 只（購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），雌雄各半，6～8 周齡，體質(zhì)量18～22 g，平均體質(zhì)量（20.8± 1.5）g。所有裸鼠均飼養(yǎng)于SPF 級(jí)屏障系統(tǒng)內(nèi)。飼養(yǎng)條件：溫度22～26 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，所用飼料、飲用水和墊料等均經(jīng)嚴(yán)格消毒滅菌并定期進(jìn)行更換。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株Huh7 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院（上海），培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中（含1% 青鏈霉素），37 ℃，5% CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)并傳代。待細(xì)胞增長(zhǎng)至107時(shí)終止，PBS 潤(rùn)洗，胰酶消化，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色并顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞＞90%，收集至1.5 mL EP 管中。

1.2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力 為了檢測(cè)不同濃度氯喹對(duì)細(xì)胞活力的影響，將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的Huh7肝癌細(xì)胞以密度為5×104/mL 接種于96 孔板， 0.2 mL/孔，預(yù)培養(yǎng)24 h，分為3 組，每組各3 孔，使其氯喹最終濃度分別為0、25、50 μmol/L，分別于培養(yǎng)6、12、24 h 時(shí)加入20 μL/ 孔MTT （5 mg/mL），棄去培養(yǎng)基，加入150 μL/孔DMSO，震蕩混勻，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔細(xì)胞在570 nm 波長(zhǎng)處的吸光度（absorbance，A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率并繪制濃度- 存活曲線。

1.2.4 Huh7 皮下移植瘤模型的建立與分組 將生長(zhǎng)指數(shù)其的Huh7 細(xì)胞調(diào)整至2.0×108/mL，分別取0.1 mL 細(xì)胞懸液接種于75 只裸鼠右前肢腋部皮下，6 d 后裸鼠皮下即可長(zhǎng)出瘤塊。將75 只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、氯喹低劑量及高劑量組，每組各25 只。氯喹處理組裸鼠分別于建模后第7 天經(jīng)腹腔注射氯喹（Selleck 公司）25、50 mg/（kg·d），對(duì)照組則注射等體積的生理鹽水，連續(xù)處理30 d并密切觀察裸鼠的存活狀態(tài)。30 d 后所有裸鼠腹腔注射0.8% 戊巴比妥（60 mg/kg），待裸鼠失去意識(shí)后處死，收集腫瘤標(biāo)本并備用。測(cè)量各組腫瘤體積，采用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑（a）、短徑（b），腫瘤體積=（ab2）/2。

1.2.5 免疫組化 石蠟組織標(biāo)本包埋后連續(xù)切片，固定于玻片上，50 ℃烘箱中烘1 h 后，二甲苯、100% 乙醇、95% 乙醇、80% 乙醇及75% 乙醇依次進(jìn)行水化，蒸餾水洗滌3 次，然后置于檸檬酸鈉溶液中加熱2 次，每次8 min，PBS 洗滌3 次，3%H2O2溶液中浸10 min，PBS 洗滌3 次后，滴加LC3 和P62 抗體稀釋液，4 ℃孵育過(guò)夜。PBST洗滌3 次后用羊抗兔二抗室溫孵育1 h，PBST 洗滌3 次，DAB 顯色（中杉金橋），蘇木精復(fù)染，0.1%HCl 分化，藍(lán)化，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。免疫組化結(jié)果的評(píng)估由專業(yè)病理學(xué)人員采用進(jìn)行判定，每張組織切片隨機(jī)選取8 個(gè)視野，綜合陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及著色程度兩項(xiàng)內(nèi)容進(jìn)行打分。其中著色程度：與背景一致為 0 分，淺黃色1 分，棕黃色2 分，深褐色3 分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占百分比：陰性為0 分，＜25%為1 分，25%～50%為2 分，51%～75 為3 分，＞75%為4 分。兩項(xiàng)乘積為最終得分。

1.2.6 Western blot 檢測(cè) 分別取各組裸鼠腫瘤組織100 g，加入300 μL 組織裂解液充分裂解 40 min 后，14000 r/min 離心10 min，取上清液加入5×SDS 上樣緩沖液并于沸水浴中煮15 min，電泳及轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別用1:1000 稀釋的LC3 及P62 抗體4 ℃孵育過(guò)夜，次日PBST 洗膜3 次，然后用1:5000 稀釋的羊抗兔二抗室溫孵育2 h 后PBST 洗膜3 次，ECL 顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法；計(jì)數(shù)資料采用率（%）來(lái)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞增殖分析采用重復(fù)測(cè)量方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)ɑ=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 氯喹對(duì)Huh7 肝癌細(xì)胞增殖的影響

不同濃度氯喹（25、50 μmol/L）處理Huh7肝癌細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)氯喹處理6、12、24 h時(shí)增殖抑制率。M TT法檢測(cè)顯示，3 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組間=1912.094，P=0.000），且兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F時(shí)間=29.297，P=0.000），時(shí)間與分組有交互作用（F交互=376.407，P=0.000），顯示時(shí)間因素的作用隨分組的不同而不同。3 組間兩兩比較：在0 h，3組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.137，P=0.873），在6、12、24 h組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=238.906、1120.115、1906.623，P＜0.001）；且在同一時(shí)間點(diǎn)（6、12、24 h）， 3組間兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。時(shí)間兩兩比較：24 h與0、6、12 h比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），12 h與6 h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021），6 h與0 h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.028）。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組 （0 μmol/L）比較，氯喹處理組細(xì)胞存活率均明顯降低（均P＜0.05），呈現(xiàn)出濃度、時(shí)間依賴性（圖1）（表1）。

圖1 各組Huh7 細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線Figure1 The growth curves of each groups of Huh7 cells

表1 各組Huh7 細(xì)胞增殖抑制率比較（±s，%）Table1 Comparison of the inhibitory rates among the three groups of Huh7 cells (±s,%)

表1 各組Huh7 細(xì)胞增殖抑制率比較（±s，%）Table1 Comparison of the inhibitory rates among the three groups of Huh7 cells (±s,%)

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與低劑量氯喹組比較，P＜0.05Note:1) P＜0.05 vs.control group; 2) P＜0.05 vs.low-dose chloroquine group

氯喹濃度（μmol/L） 0 h 6 h 12 h 24 h 0102.13±8.12120.36±8.61154.21±8.31201.60±9.3225100.84±8.896.32±7.531) 90.23±6.121) 82.36±7.651)50100.21±8.581.10±7.521),2) 65.21±6.211),2) 51.02±6.211),2)F 0.137238.9061120.1151906.623 P 0.8730.0000.0000.000

2.2 氯喹對(duì)裸鼠肝癌移植瘤生長(zhǎng)的影響

通過(guò)皮下注射Huh7肝癌細(xì)胞建立肝癌裸鼠模型，并用不同劑量氯喹進(jìn)行干預(yù)30 d，觀察各組腫瘤生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，3組腫瘤體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1120.296，P=0.000）。與對(duì)照組比較，低劑量氯喹組和高劑量氯喹組裸鼠肝癌生長(zhǎng)速度明顯減緩（P=0.034，P=0.004）。與低劑量氯喹組比較，高劑量氯喹組裸鼠肝癌生長(zhǎng)速度明顯下降（P=0.015）。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上3組腫瘤體積比較：在0 、3、6 d時(shí)間點(diǎn)上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；9、12、15、18、21、24、27、30 d時(shí)間點(diǎn)是差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖2）（表2）。

2.3 免疫組化檢測(cè)各組裸鼠移植瘤組織LC3、p62 水平

各組裸鼠LC3、p62免疫組化檢測(cè)及其定量分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低劑量氯喹組、高劑量氯喹組LC3、p62水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與低劑量氯喹組相比，高劑量氯喹組LC3、p62水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖3）（表2）。

圖2 各組裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)曲線Figure2 The growth curves if the xenograft in each group of nude mice

圖3 免疫組化檢測(cè)各組裸鼠移植瘤組織中LC3、p62 的表達(dá)（×200）Figure3 Immunohistochemical staining for LC3 and p62 expressions in the xenografts in in each group of nude mice (×200)

表2 各組裸鼠肝癌組織中LC3、p62 表達(dá)評(píng)分比較（±s）Table2 Comparison of the scores of LC3 and p62 expressions among the three groups (±s)

表2 各組裸鼠肝癌組織中LC3、p62 表達(dá)評(píng)分比較（±s）Table2 Comparison of the scores of LC3 and p62 expressions among the three groups (±s)

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與低劑量氯喹組比較，P＜0.05Note:1) P＜0.05 vs.control group; 2) P＜0.05 vs.low-dose chloroquine group

組別 LC3 p62對(duì)照組 85.32±8.14124.36±12.32低劑量氯喹組 178.25±15.631) 198.37±17.521)高劑量氯喹組 289.28±18.691),2) 312.14±21.881),2)F 142.21785.895 P 0.0000.000

2.4 Western blot 檢測(cè)各組裸鼠移植瘤組織LC3-II/LC3-I、p62 水平

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，低劑量氯喹組、高劑量氯喹組LC3-II/LC3-I、p62水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與低劑量氯喹組比較，高劑量氯喹組LC3-II/LC3-I、p62水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖4）（表3）。

圖4 Western blot 檢測(cè)LC3-II/LC3-I、p62 的表達(dá)Figure4 The expressions of LC3-II/LC3-I and p62 determined by Western blot

表3 各組裸鼠移植瘤組織中LC3-II/LC3-I、p62 表達(dá)量比較 （±s）Table3 Comparison of the expression levels of LC3-II/LC3-I and p62 in the xenografts among the three groups of nude mice (±s)

表3 各組裸鼠移植瘤組織中LC3-II/LC3-I、p62 表達(dá)量比較 （±s）Table3 Comparison of the expression levels of LC3-II/LC3-I and p62 in the xenografts among the three groups of nude mice (±s)

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與低劑量氯喹組比較，P＜0.05Note:1) P＜0.05 vs.control group; 2) P＜0.05 vs.low-dose chloroquine group

組別 LC3-II/LC33-I p62對(duì)照組 0.35±0.120.49±0.11低劑量氯喹組 0.89±0.191) 1.20±0.231)高劑量氯喹組 1.37±0.241),2) 2.10±0.291),2)F 21.68039.298 P 0.0020.000

3 討 論

3.1 氯喹對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

氯喹是含有4-氨基喹啉環(huán)結(jié)構(gòu)人工合成化合物，因其具有較高的趨溶酶體特性而在溶酶體內(nèi)高度聚集，抑制某些酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)生改變。氯喹不但在瘧疾、免疫性類風(fēng)濕疾病方面具有較好治療效果，而且在腫瘤治療過(guò)程中也涉及異常自噬。Hu等[8]認(rèn)為氯喹可以通過(guò)以阻滯肝癌細(xì)胞周期以及DNA損壞以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而影響肝癌組織生長(zhǎng)。朱文斌等[9]研究證實(shí)氯喹可以通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白（cyclin E1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK2）水平，增加細(xì)胞周期抑制蛋白P21、P27含量，阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，從而抑制肺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示氯喹可以降低肝癌細(xì)胞Huh7存活率，同時(shí)裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示氯喹可以降低移植瘤體積，抑制移植瘤生長(zhǎng)，此結(jié)果與前人研究相似，氯喹可能是通過(guò)影響肝癌組織細(xì)周期、凋亡來(lái)抑制腫瘤組織生長(zhǎng)。Lin等[10]發(fā)現(xiàn)氯喹可以通過(guò)靶向基底自噬與增強(qiáng)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)。Liu等[11]顯示氯喹可以阻斷自噬、誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來(lái)抑制肺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)。Gao等[12]發(fā)現(xiàn)氯喹可以抑制TACE誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，失去對(duì)凋亡的抗性，促使細(xì)胞凋亡，從而有助于抑制腫瘤生長(zhǎng)。由此表明氯喹抑制肝癌組織細(xì)胞生長(zhǎng)是通過(guò)阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，影響細(xì)胞增殖，從而組織生長(zhǎng)；同時(shí)還存在另一種猜測(cè)：氯喹可能會(huì)通過(guò)影響肝癌細(xì)胞自噬來(lái)調(diào)節(jié)肝癌組織生長(zhǎng)。

3.2 氯喹對(duì)肝癌細(xì)胞自噬的影響

自噬是真核細(xì)胞內(nèi)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫落的膜結(jié)構(gòu)包裹胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等形成自吞噬體，后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，并降解其內(nèi)容物，以維持細(xì)胞自身生長(zhǎng)代謝和細(xì)胞成分更新，參與細(xì)胞分化，生長(zhǎng)調(diào)控，組織修復(fù)，抗原呈遞以及外界應(yīng)激等多種生理過(guò)程[13-14]。細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)時(shí)，可通過(guò)自噬使胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分循環(huán)利用，以維持細(xì)胞活力[15]。癌癥晚期時(shí)，腫瘤細(xì)胞增殖加快，自噬有助于腫瘤細(xì)胞在藥物毒性、胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)供給壓力下細(xì)胞活力的維持[16]。因此，抑制或阻斷自噬會(huì)提高腫瘤治療效果。

自噬溶酶體功能形式需要活性水解酶參與，氯喹是溶酶體靶向藥物，氯喹可通過(guò)抑制多種蛋白酶活性，從而抑制蛋白水解、糖脂代謝等多種代謝途徑，導(dǎo)致自噬體內(nèi)物質(zhì)無(wú)法通過(guò)溶酶體降解，自噬性囊泡大量累積，溶酶體膜通透性改變一起腫脹、破裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[17-18]。已有研究[19-21]表明，氯喹可促進(jìn)食管癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞死亡。本研究結(jié)果顯示，氯喹處理后裸鼠肝癌組織中自噬相關(guān)蛋白LC3-II和P62蛋白的含量顯著升高。自噬體形成涉及多種蛋白參與，LC3是判斷細(xì)胞自噬活性標(biāo)志物之一。LC3包括LC3-?和LC3-II兩種形式，LC3-?位于胞漿中，LC3-?通過(guò)羧基與脂質(zhì)共價(jià)連接轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-II，聚集于自噬體膜[22-23]。自噬體與溶酶體結(jié)合時(shí)，LC3-?解離循環(huán)至胞質(zhì)中，LC3-II依舊位于自噬溶酶體內(nèi)膜上，LC3-II含量與自噬膜囊泡數(shù)量呈正比[24-25]。P62可經(jīng)自噬過(guò)程被選擇性降解，是細(xì)胞自體吞噬特異性底物[26]。自噬被抑制，P62上游表達(dá)增強(qiáng)或下游降解被阻斷均可導(dǎo)致P62大量積聚，因此，P62水平可作為自噬流的檢測(cè)指標(biāo)[27-28]。本研究與前人研究結(jié)果相似，由此表明，氯喹可能抑制了自噬溶酶體形成和自噬小體在溶酶體的降解，導(dǎo)致自噬體累積。腫瘤細(xì)胞處于激活狀態(tài)，其通過(guò)自噬降解有害物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，保證自身存活。氯喹抑制自噬后，腫瘤細(xì)胞可能由于自噬能力降低導(dǎo)致有害物質(zhì)大量積累，導(dǎo)致無(wú)法適應(yīng)腫瘤微環(huán)境，最終使其生長(zhǎng)受到抑制。此外，已有研究[29-31]證明氯喹聯(lián)合其他化療藥物使用能顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，表明氯喹可以抑制肝癌組織細(xì)胞自噬，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

綜上所述，氯喹可以通過(guò)調(diào)節(jié)肝癌中LC3、P62水平，抑制肝癌組織細(xì)胞自噬，從而抑制組織細(xì)胞增長(zhǎng)。但本研究所得結(jié)論只是基于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)裸鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)多得，臨床中是否具有相同趨勢(shì)以及氯喹臨床應(yīng)用劑量還需要進(jìn)一步探索與研究。