宋宇塵，雷 爽*，韓新民，袁海霞，周榮易，劉 睿

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023； 3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

注意缺陷多動障礙（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD）為兒童期發(fā)病特別是學(xué)齡期兒童常見的心理行為障礙性疾病，其主要特征是與年齡不相符的注意力不集中、多動、沖動［1］。本病與成年高犯罪率有關(guān)，持續(xù)到成年的ADHD 可伴隨更加嚴(yán)重的心理行為障礙且更難治療，嚴(yán)重影響患者的健康成長、家庭和睦及社會和諧。ADHD 的發(fā)病機(jī)制尚未明確，學(xué)術(shù)界認(rèn)可的假說中“多巴胺（dopamine，DA）缺陷理論”的接受度和討論度最高［2］。哌甲酯和托莫西汀為當(dāng)前治療ADHD 的一線藥物，但因其不良反應(yīng)使接受度較低，限制了廣泛應(yīng)用。中醫(yī)藥治療ADHD 因臨床療效確切、遠(yuǎn)期療效好、不良反應(yīng)少，近年來受到患兒家長的肯定和歡迎。南京中醫(yī)藥大學(xué)韓新民教授的經(jīng)驗(yàn)方安神定志靈是依據(jù)多部中醫(yī)古代兒科著作相關(guān)理論及30 多年治療兒童多動癥的經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)制而成，臨床對照研究證實(shí)了安神定志靈對ADHD 心肝火旺證的積極作用［3］。課題組前期研究表明復(fù)方安神定志靈能夠升高SHR大鼠前額葉與紋狀體DA 水平，調(diào)節(jié)DA 受體功能［4-6］。但DA 系統(tǒng)十分復(fù)雜，DA 的合成、清除等環(huán)節(jié)障礙均可能導(dǎo)致ADHD 的發(fā)生。課題組前期對SHR 大鼠腦突觸體DA 合成相關(guān)因子進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)安神定志靈可以通過控制DA合成速度發(fā)揮對核心癥狀的療效［7］。前額葉皮質(zhì)在注意力和工作記憶的功能至關(guān)重要［8］，基于以上前提，為進(jìn)一步探討安神定志靈的作用機(jī)制，課題組以前額葉皮質(zhì)DA 合成關(guān)鍵因子酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）及清除關(guān)鍵因子多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（dopamine transporter，DAT）為切入點(diǎn)，探究經(jīng)驗(yàn)方安神定志靈的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat，SHR）大鼠40 只，雄性WKY 大鼠8 只，雄性SD 大鼠8 只，3 周齡，體質(zhì)量（76.7±7.3）g，生產(chǎn)許可證SCXK（京）2012-0001，動物飼養(yǎng)設(shè)施許可證號SYXK（蘇）2014-0001，動物倫理審查批準(zhǔn)編 號ACU170803。大鼠自由飲食進(jìn)水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d［9］。

1.2 藥物 所用同批次中藥購自南京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂中藥房，且由南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源學(xué)教研室主任巢建國教授鑒定為正品，全方12 味中藥飲片藥用部位及產(chǎn)地、批號見表1。中藥煎劑根據(jù)前期研究的水提取方法制備，以保證藥物有效成分的足量析出［10］。采用負(fù)壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將藥液濃縮至1.78 g／mL（高劑量），用生理鹽水把濃縮藥液稀釋為0.45、0.89 g／mL（低、中劑量）。鹽酸托莫西汀膠囊（擇思達(dá)，strattera，美國LILLY DEL CARIBE Inc 公司，進(jìn)口藥品注冊證號H20110150，40 mg／片），加生理鹽水配置成0.67 mg／mL 混合液，4 ℃下保存?zhèn)溆?。每日恢?fù)至室溫并搖勻后，灌胃使用。

1.3 儀器 MM400 球磨儀（德國Retsch 公司）；5427R 離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；Shandon 全自動染色機(jī)（美國Thermo 公司）；Trans-Blot SD 型蛋白半干轉(zhuǎn)印儀、Chemi-Doc MP 型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；Tissue-Tek-VIP6 型全自動真空組織脫水機(jī)（日本Sakura 公司）；Histostar 包埋機(jī)、Finesse E＋手動切片機(jī)（美國Thermo 公司）；Light Cycle 型DNA 熒光定量分析儀（瑞士Roche 公司）；Quantsdudio7 型熒光PCR 儀（美國Life 公司）；熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）。

表1 安神定志靈藥物組成

1.4 試劑 β-actin 抗體（英國Abcam 公司，貨號ab5694）；Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody（英國Abcam公司，貨號ab112）；Anti-Dopamine Transporter antibody（英國Abcam 公司，貨號ab111468）；BCA 試劑盒（美國Thermo 公司，批號23227）；ECL 化學(xué)發(fā)光底物（美國Thermo 公司，批號32109）；PBS 緩沖液（每1 L 中含8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4，pH 調(diào)至7.4）；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司，貨號9109、RR036A、RR820A）。1.5 Real-time PCR 引物合成 引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列見表2。

表2 引物序列

2 方法

2.1 給藥、分組 將40 只SHR 大鼠根據(jù)開場實(shí)驗(yàn)總運(yùn)動距離以隨機(jī)數(shù)字表法分為5 組，每組8 只，即模型組，擇思達(dá)組（0.045 mg／kg），安神定志靈低、中、高劑量組（6.7、13.4、26.7 g／kg）（安神定志靈中劑量等同于臨床等效劑量），另將8 只WKY 大鼠設(shè)為正常組1，8 只SD 大鼠設(shè)為正常組2，用藥劑量根據(jù)體表面積法換算而得［11］。適應(yīng)性飼養(yǎng)后每日早8：00 稱重，各組大鼠灌胃體積均為1.5 mL／100 g，正常組1、2 及模型組均用生理鹽水灌胃，2 次／d，持續(xù)28 d。

2.2 樣品采集 末次給藥后禁食12 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，處死動物，剝開顱骨，取腦，快速于冰上分離前額葉，保存至－80 ℃冰箱。

2.3 Western blot 法檢測前額葉皮質(zhì)TH、DAT 蛋白表達(dá) 前額葉組織50～80 mg 加入RIPA 裂解混合液（含PMSF）1 mL，于球磨儀裂解30 min，參考課題組前期實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作［7］。一抗稀釋度分別為兔源TH 一抗（1∶200）、兔源DAT 一 抗（1∶1 000）、羊抗兔二 抗（1∶3 000），曝光。Image Lab 5.1 軟件分析條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，目的蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值的比值表示其相對表達(dá)量。

2.4 Real-time PCR 檢測前額葉皮質(zhì)TH、DATmRNA 表達(dá) 按照實(shí)驗(yàn)操作步驟提取前額葉總RNA，分析純度后逆轉(zhuǎn)錄，檢測濃度，96 孔板加樣，離心10 min，注意避光，放入熒光PCR 儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增條件95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃20 s，循環(huán)40 次；反應(yīng)條件37 ℃15 min，85 ℃5 s，描繪溶解曲線，重復(fù)3 次，對RQ值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.5 免疫熒光法檢測前額葉皮質(zhì)TH、DAT 表達(dá) 每組隨機(jī)選取大鼠3 只，末次給藥后禁食12 h，麻醉后分離心臟，在右心耳剪一小口，從心尖用4%多聚甲醛溶液灌注固定，灌注結(jié)束后剝離顱骨，取出腦組織，置4 ℃、4%多聚甲醛中固定12 h 以上，于高濃度蔗糖溶液中沉底。石蠟切片脫蠟至水，用PBS 洗3 次，5 min／次，抗原修復(fù)，用3%H2O2（溶劑為PBS）溶液室溫封閉10 min，雙蒸水洗滌，PBS 洗1 次，除去多余液體，滴加一抗，室溫下孵育1 h，PBS 洗3 次，5 min／次，滴 加1∶200 稀釋的 Alexa Fluor488、594 熒光標(biāo)記二抗體，室溫避光作用1 h，傾去多余的二抗，PBS 緩沖液漂洗2 次，5 min／次，加入DAPI室溫作用5～10 min，抗淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad 6 統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，分別與正常組1、正常組2、模型組、擇思達(dá)組進(jìn)行兩兩比較，采用LSD-t、Dunett-t法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠前額葉皮質(zhì)TH、DAT 蛋白表達(dá) 灌胃28 d后，與正常組1、2 比較，模型組TH 蛋 白表達(dá)降低（P＜0.05），DAT 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組比較，擇思達(dá)組、復(fù)方安神定志靈低劑量組TH 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），擇思達(dá)組、復(fù)方安神定志靈中劑量組DAT蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 復(fù)方安神定志靈對大鼠前額葉皮質(zhì)TH、DAT 蛋白表達(dá)的影響（n＝8）

3.2 各組大鼠前額葉皮質(zhì)TH、DATmRNA 表達(dá) 灌胃28 d后，與正常組1、2 比較，模型組THmRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05），DATmRNA 表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，擇思達(dá)組、復(fù)方安神定志靈低劑量組THmRNA 表達(dá)水平升高（P＜0.05），擇思達(dá)組、復(fù)方安神定志靈中劑量組DATmRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 復(fù)方安神定志靈對大鼠前額葉皮質(zhì)TH、 DAT mRNA 表達(dá)的影響（n＝8）

3.3 各組大鼠前額葉皮質(zhì)TH、DAT 蛋白表達(dá) 灌胃28 d后，與正常組1、2 比較，模型組TH 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），DAT 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組比較，擇思達(dá)組及復(fù)方安神定志靈低劑量組TH 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），擇思達(dá)組及復(fù)方安神定志靈中劑量組DAT 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3～5。

圖3 復(fù)方安神定志靈對大鼠前額葉皮質(zhì)TH、DAT 蛋白表達(dá)的影響（n＝8）

圖4 復(fù)方安神定志靈對SHR 大鼠前額葉TH 陽性細(xì)胞表達(dá)的影響（×400）

圖5 安神定志靈對SHR 大鼠前額葉DAT 陽性細(xì)胞表達(dá)的影響（×400）

4 討論

隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、對兒童教育要求的提高，ADHD越來越受到家庭、學(xué)校和社會的重視，推進(jìn)了本病的研究。ADHD 病因病理尚未明確的現(xiàn)狀和其動物模型問題互為因果，是國內(nèi)外學(xué)者廣泛面對的難題，阻礙了本病的研究進(jìn)展。SHR 大鼠是迄今國內(nèi)外圍繞ADHD 基礎(chǔ)研究認(rèn)可度最高的動物模型［12］，SHR 大鼠由WKY 大鼠培育而來，在5周齡前無高血壓的混雜效應(yīng)，而具有ADHD 的主要行為學(xué)表現(xiàn)。因ADHD 是根據(jù)癥狀診斷的疾病，SHR 行為學(xué)表現(xiàn)與本病臨床表現(xiàn)的高相似度提示SHR 可作為良好的ADHD動物模型。SHR 大鼠擁有多動、沖動、注意力不集中的典型ADHD 臨床表現(xiàn)（表面效度）；在ADHD 易感基因、腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)、大腦容量等方面與已被證明的ADHD 理論相符，與ADHD 患兒相似，SHR 大鼠也顯示出性別差異，且用于治療ADHD 的一線藥物哌甲酯、托莫西汀對SHR 大鼠有效（結(jié)構(gòu)效度）；SHR 大鼠能夠預(yù)測臨床上尚未闡明的行為、遺傳和神經(jīng)化學(xué)等相關(guān)因素（預(yù)測效度）。SHR 大鼠源自WKY 大鼠，二者有相同的遺傳背景，因此WKY 鼠用作SHR 的正常對照［13-14］。但近年來有研究發(fā)現(xiàn)WKY 大鼠在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中活動速度慢，靜止時(shí)間長，表現(xiàn)出抑郁樣特征［15］，作為正常對照的嚴(yán)謹(jǐn)性還值得商榷。因此本研究中設(shè)WKY 組、SD 組分別為正常組1、正常組2，SHR 為模型組，探討WKY、SD、SHR 大鼠DA 合成、清除相關(guān)因子表達(dá)的差異及藥物對上述過程的作用。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA 在前額葉皮質(zhì)的功能發(fā)揮中具有重要意義，其水平異常可見于多種精神神經(jīng)疾病。DA 代謝的遺傳失衡在ADHD 發(fā)生中的作用已被包括多巴胺活性藥物的有效應(yīng)用及功能性腦成像等研究所證實(shí)，“DA 缺陷理論”是目前ADHD 研究領(lǐng)域幾乎公認(rèn)的ADHD 發(fā)生假說，也是國內(nèi)精神神經(jīng)疾病的研究熱點(diǎn)［16-18］。DA 在腦內(nèi)生成首先需要TH 催化酪氨酸生成，多巴再被多巴脫羧酶催化，脫去羧基形成DA。TH 在此過程中，是參與反應(yīng)的起始酶及限速酶，因此TH 在生物體內(nèi)表達(dá)的異常會直接影響到兒茶酚胺類遞質(zhì)的合成［19］。TH 在一些中樞和周圍神經(jīng)元群以及腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞限制性表達(dá)。據(jù)人類基因組變異數(shù)據(jù)庫記錄顯示有41 種疾病由TH 基因點(diǎn)突變引起［20］。DA主要通過再攝取的方式進(jìn)行清除，所釋放的DA 中的75%會通過DAT 再攝取，DAT 是位于多巴胺神經(jīng)元突觸前膜特異性的跨膜蛋白，屬于Na＋／Cl－離子依賴型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族，可使DA 在突觸擴(kuò)散之前迅速滅活。DAT 與TH、多巴胺D2 受體共定位，表明DAT 是特異性地表達(dá)在多巴胺能神經(jīng)元中。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，DAT 的作用是攝取細(xì)胞外的DA至細(xì)胞內(nèi)［21］。近年來研究者發(fā)現(xiàn)，DAT 重?cái)z取的反應(yīng)速率與胞外DA 濃度不相匹配，可能的解釋是DAT 的構(gòu)象在向胞內(nèi)開口的時(shí)候，DA 可以通過DAT 釋放到胞外［22］。

近年來中醫(yī)藥對ADHD 的研究逐漸深入［23］，心肝火旺證是ADHD 實(shí)證最常見的證型［24］，安神定志靈是韓新民教授治療兒童多動癥心肝火旺證的經(jīng)驗(yàn)方，臨床應(yīng)用30 余年，其對ADHD 心肝火旺證取得了穩(wěn)定療效［3］。此方中黃芩清心平肝；醋柴胡、郁金、決明子行氣解郁，清肝平肝，并能使熱從大腸而下；天竺黃清熱豁痰，涼心定驚；炙遠(yuǎn)志化痰寧心，安神益智；鉤藤平肝清熱平肝，熄風(fēng)定驚；石菖蒲豁痰開竅，兼能醒神益智。諸藥合用使心火得清，肝陽得平，痰濕得除，神得安志得定，陰陽得平。在本次實(shí)驗(yàn)中，增加了SD 大鼠這一正常對照組，使原本飽受爭議的SHR 大鼠和WKY 大鼠的對比增加了可靠性。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在DA 合成及清除相關(guān)因子TH 和DAT 的表達(dá)上，WKY 大鼠與SD 大鼠相比未見明顯差異，而SHR 大鼠TH與DAT 蛋白及mRNA 表達(dá)與WKY 大鼠及SD 大鼠相比均有顯著差異，說明SHR 大鼠與WKY 大鼠這一經(jīng)典模型-正常對照在此方面基本符合要求。但未進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評價(jià)大鼠的自主活動及注意力等，ADHD 的模型動物及對照動物選擇仍需要更深層次的研究。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)安神定志靈可能通過升高前額葉TH 蛋白及mRNA 表達(dá)及降低DAT 蛋白及mRNA 表達(dá)，以促進(jìn)DA 合成及抑制DA 清除而提高DA水平來達(dá)到治療ADHD 的目的。且發(fā)揮作用的劑量組與擇思達(dá)組比較未見顯著差異（P＞0.05）。但安神定志靈低劑量組對TH 表達(dá)的調(diào)控較優(yōu)，而安神定志靈中劑量組對DAT 表達(dá)的調(diào)控較優(yōu)。提示安神定志靈的療效發(fā)揮未呈劑量依賴，其原因還需進(jìn)一步探索。免疫熒光結(jié)果顯示，TH、DAT 陽性細(xì)胞在前額葉皮質(zhì)顯著表達(dá)，該區(qū)域在調(diào)控運(yùn)動、空間時(shí)間記憶、注意力等功能上作用突出［8］。除前額葉外，紋狀體、海馬、杏仁核等區(qū)域也與ADHD 的發(fā)生相關(guān)，下一步需進(jìn)行更加深入的研究。DA 系統(tǒng)十分復(fù)雜，除合成和清除外，其釋放機(jī)制也十分復(fù)雜，涉及DA 突觸囊泡循環(huán)等過程。這些問題，課題組將在下一步進(jìn)行探索。