李潤璞 金鑫

眼睛，尤其是視網(wǎng)膜，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)的延伸，與大腦共享解剖和發(fā)育特征，為神經(jīng)元疾病的研究提供了一個強大而獨特的“窗口”[1]。視網(wǎng)膜具有相對免疫赦免特性，并具有類似于大腦和脊髓中發(fā)現(xiàn)的特異性免疫反應(yīng)。此外，視網(wǎng)膜易于分離，使其成為開發(fā)創(chuàng)新療法的模型，將眼部疾病帶到基因和干細胞療法的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用前沿。本文回顧了基因組編輯技術(shù)在遺傳性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良(inherited retinal dystrophies,IRDs)治療策略的最新進展。

1 IRDs

IRDs是一組具有遺傳和臨床異質(zhì)性的退行性疾病，可導(dǎo)致漸進性視力損害[2-3]。在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率約為1/2000[4]。IRDs與250多個基因突變相關(guān)(http://www.sph.uth.tmc.edu/Retnet)，可導(dǎo)致光感受器細胞發(fā)育、功能和(或)存活異常以及視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)異常[5]，其遺傳方式有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳或X連鎖遺傳。另外，復(fù)雜的多因素異質(zhì)性疾病，如年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)也被認為是一種視網(wǎng)膜變性疾病。

IRDs可分為非綜合征型和綜合征型，根據(jù)疾病進展和受累的視網(wǎng)膜區(qū)域，非綜合征IRDs可進一步細分為各種亞型。首先，進展性病變的影響局限于中央視網(wǎng)膜(黃斑區(qū))，可導(dǎo)致中央視力喪失，稱為黃斑營養(yǎng)不良。最常見的是Stargardt病，其發(fā)病率為1/10 000，由ABCA4基因突變所致[6]。其次，進行性病變累及更廣泛的視網(wǎng)膜區(qū)域，可根據(jù)最初發(fā)生退行性改變的光感受器細胞類型進行分類。桿錐細胞營養(yǎng)不良疾病首先影響視桿細胞，始發(fā)癥狀表現(xiàn)為夜盲，隨后逐漸出現(xiàn)周邊視力喪失。其中，最常見的是視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP)，其發(fā)病率為1/4000，可由80多個基因突變致病[7]。當(dāng)黃斑和外周視網(wǎng)膜都受到影響，并且從出生開始視網(wǎng)膜迅速退化，稱為Leber先天性黑矇(Leber congenital amaurosis ，LCA)，發(fā)病率為1/50 000，分為18個亞型。此外，如果視網(wǎng)膜變化與脈絡(luò)膜退行性病變有關(guān)，則被稱為脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變。無脈絡(luò)膜 (choroideremia,CHM)在本組疾病中最常見，發(fā)病率為1/50 000。綜合征型IRDs除了眼以外，其他器官也會受影響，最常見者為Usher綜合征，發(fā)病率為1/20 000，其特征是RP和聽力損害[8]。

IRDs的單基因性質(zhì)以及視網(wǎng)膜的可及性和免疫赦免特性，使其更適合采用未來最具發(fā)展前景的基因治療，IRDs已經(jīng)成為基因治療的目標(biāo)疾病[9]。最近，通過常染色體顯性等位基因失活或隱性、X連鎖等位基因校正等針對致病基因進行干預(yù)，作為一種可能的治療策略已開始探索。由于IRDs具有不同遺傳背景、不同發(fā)病率、發(fā)病年齡，臨床過程多變，且受限于基因治療的高度特異性，目前臨床上還沒有標(biāo)準的治療方案。

2 IRDs的基因治療

基因擴增治療為體細胞提供了突變基因的正?？截?，適用于治療單倍體功能不全或突變導(dǎo)致功能喪失的疾病。最常見但并非唯一的方法是正?；蛴刹《据d體攜帶對體細胞進行轉(zhuǎn)染，從而進行穩(wěn)定表達，例如腺相關(guān)病毒(adeno-associated viral ，AAV)載體[10]。AAV載體因其低免疫原性和毒性、無致病性，攜帶基因長期表達，遺傳元件相對易于操縱，成為迄今為止最安全和最有效的將基因?qū)胍暰W(wǎng)膜的病毒載體[11]。通過視網(wǎng)膜下注射給藥，載體可進入光感受器細胞和RPE之間的視網(wǎng)膜下腔，對2種細胞進行轉(zhuǎn)染，其特異性取決于所使用的血清型[12]。其他方法如玻璃體腔內(nèi)給藥，侵襲性較小、術(shù)后并發(fā)癥較少，但視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)染的效率較低[13]。2001年RPE65基因突變LCA2犬模型的基因擴增治療，是IRDs基因擴增治療的一個重大里程碑。AAV2/2介導(dǎo)的RPE65治療后，LCA2犬的視力長期恢復(fù)[14]。在此研究之后，視網(wǎng)膜下注射AAV-RPE65的效果由多階段1/2臨床基因治療試驗評估，證明一些患者的視力得到改善，且無載體不良反應(yīng)。隨后在LCA2患者中進行的3期臨床試驗，治療載體雙眼給藥，與對照組相比，治療組的視力顯著提高，這成為第1例雙眼均成功治療的眼科臨床試驗[15]，其載體藥物voretigene neparvovec(Luxturna)已經(jīng)商業(yè)化。在AAV-RPE65試驗之后，X連鎖無脈癥的基因治療研究也已開展。使用同樣的方法，在Chmnull/WT小鼠中完成了臨床前研究[16-17]，其他AAV血清型如AAV2/5和AAV2/8對無脈癥也有效[18]。最近，使用AAV2/2載體進行治療MERTK基因?qū)е翿P的一期臨床試驗已開始[19]，其他AAV血清型載體治療基因突變導(dǎo)致的IRDs的各種臨床試驗也已在世界范圍內(nèi)陸續(xù)開展，但結(jié)果尚未見報道。

盡管AAV載體有許多優(yōu)點，但為了克服其克隆能力有限(<4.7 kb)[20]這一局限性，研究人員使用慢病毒馬傳染性貧血病毒(equine infectious anemia virus，EIAV)作為載體。EIAV可以整合到人類基因組中，但對人類無致病性。首先使用EIAV作為載體的是具有6.8 kb編碼序列的ABCA4基因。臨床前期研究顯示，Abca4-/-小鼠模型中，與對照組相比，治療組小鼠RPE中毒性A2E蓄積減少[21]。

盡管在LCA2試驗中，接受治療的患者視力改善有所不同，但長期隨訪研究顯示視網(wǎng)膜仍在繼續(xù)退化[22]，這可能是由于治療處于疾病晚期過程，此時變性過程不再停止[23]。視網(wǎng)膜變性的進展階段與基因擴增治療不相容，基因擴增治療成功的前提是非功能性靶細胞仍然存活。進展期的IRDs患者可能從細胞移植療法中得到更好的效果，該療法具有恢復(fù)視覺功能的潛力。

3 基因組編輯技術(shù)在IRDs治療中的應(yīng)用

基因組編輯最初是通過使用工程化大分子核酸酶和鋅指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFN)來觸發(fā)特異性靶向基因組序列。隨后，轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)的研究，以及最近簇集式規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)和crisp相關(guān)基因(Cas)系統(tǒng)的出現(xiàn)，導(dǎo)致了一場基因組編輯的科學(xué)革命。

3.1 ZFNs和TALENs無論使用哪種工具，有效的基因組編輯都著眼于在基因組中精確位點引入雙鏈斷裂(double strand breaks，DSB)，這也是迅速刺激細胞2條DNA修復(fù)的途徑之一[24]。為了誘導(dǎo)DSB、ZFNs和TALENs，需要通過蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合域引導(dǎo)到靶序列。因此，他們不得不為每個靶標(biāo)設(shè)計新的蛋白質(zhì)，這使得基因組編輯變得困難、費力且具有挑戰(zhàn)性[25]。ZFNs由可修飾的鋅指結(jié)構(gòu)域和由FokI核酸酶[26]組成的切割結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，鋅指結(jié)構(gòu)域被設(shè)計成結(jié)合靶向基因組中的特定序列。ZFNs應(yīng)用的主要局限性在于鋅指的設(shè)計，需要結(jié)合基因組中每3個堿基對的組合，這尚未實現(xiàn)。因此，許多位點不能作為這些工程化核酸酶來靶點。盡管面臨挑戰(zhàn)，ZFNs已作為治療概念應(yīng)用于視網(wǎng)膜疾病中。表達RHO基因 Pro23His突變的人胚胎視網(wǎng)膜祖細胞已經(jīng)成為ZFNs治療靶點，使用同源供體模板轉(zhuǎn)染ZFN，比單獨轉(zhuǎn)染ZFN時的同源重組效率增加[27]。類似地，研究人員在穩(wěn)定表達導(dǎo)致Usher綜合征1C型錯義突變Ush1c的HEK293細胞中實現(xiàn)了位點特異性基因校正[28]。這些研究首次證明了ZFNs用于治療視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良基因打靶的可行性。

TALEN是ZFN的替代品，它通過融合TAL效應(yīng)器DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與Fok I核酸酶切割結(jié)構(gòu)域進行設(shè)計，代表了從設(shè)計到實現(xiàn)更快、更經(jīng)濟的轉(zhuǎn)變。然而，TALENs更適用于較大的蛋白質(zhì)，并且含有導(dǎo)致TALEN失活的重復(fù)DNA序列[29]。此外類似于ZFNs，TALENs需要為每個DNA靶標(biāo)設(shè)計新的蛋白質(zhì)，這對于基因組編輯研究人員來說仍然具有非常大的挑戰(zhàn)性。TALENs技術(shù)也已應(yīng)用于視網(wǎng)膜疾病，用來糾正LCA8模型Crb1rd8小鼠中的突變。用針對Crb1rd8等位基因的mRNA編碼TALENs與單鏈寡核苷酸(ssODN)聯(lián)合處理小鼠卵母細胞，以糾正致病等位基因。經(jīng)治療，TALEN聯(lián)合ssODN修復(fù)了27%小鼠胚胎，提示眼部癥狀可以得到改善[30]。

3.2 CRISPR/CAS系統(tǒng)與ZFNs和TALENs相比，CRISPR/CAS系統(tǒng)代表了一種新穎而有效的基因組編輯方法。1987年，研究人員發(fā)現(xiàn)細菌基因組中IAP基因存在“不尋常的”3個區(qū)域，含有29個堿基重復(fù)序列，之間間隔32個非重復(fù)性核苷酸[31]。后來，在許多細菌和古細菌中發(fā)現(xiàn)了類似的重復(fù)序列[32]。2000年，這些在細菌基因組中觀察到的重復(fù)序列使用首字母縮寫CRISPR來進行統(tǒng)一。研究人員在編碼基因相鄰的位置發(fā)現(xiàn)的幾個重復(fù)序列群，稱為CRISPR相關(guān)基因或Cas基因[33]。2012年，CRISPR作為基因組編輯系統(tǒng)首次被提出。Jinek等[34]發(fā)現(xiàn)，兩RNA分子存在時，鏈霉菌鏈球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)(spCas9)能夠誘導(dǎo)DSB，CRISPR RNA(crRNA)和反式激活RNA(tracrRNA)結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物單一指導(dǎo)RNA(gRNA)，它可以同樣有效地結(jié)合到靶DNA。這個融合基因組5’端的20個核苷酸可設(shè)計成特定目標(biāo)序列，使特定基因組可以使用CRISPR技術(shù)進行編輯。gRNA和PAM序列的結(jié)合，引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶Cas9進行DNA靶向特異性切割[35]。CRISPR/Cas系統(tǒng)為大量生物和細胞提供了有效的基因修復(fù)[36]。

研究人員將gRNA的識別位點結(jié)合到spCas9質(zhì)粒中，限制了Cas9的表達時間，開發(fā)了一個CRISPR/Cas9自限系統(tǒng)，這種自我限制的Cas9方法降低了不希望發(fā)生的非靶點作用、潛在毒性和SpCas9特異性細胞免疫應(yīng)答的機會[37]。此外，具有不同PAM基序的Cas9核酸酶的使用和發(fā)展可擴大CRISPR/Cas技術(shù)在整個人類基因組中的應(yīng)用[38]。

3.3 CRISPR/Cas體內(nèi)基因組編輯基因組編輯存在2種不同的方法：一種是體內(nèi)方法，致病突變在視網(wǎng)膜中直接糾正；另一種是體外方法，在患者的細胞中糾正突變后進行細胞移植。CRISPR/Cas在動物模型中的基因組編輯研究對于研究和開發(fā)可能的治療技術(shù)至關(guān)重要，有望成為挽救患者殘余視力的方法之一[39]。研究人員面臨的最大挑戰(zhàn)是將CRISPR系統(tǒng)直接輸送到視網(wǎng)膜特定的組織或細胞中，如上所述，AAV載體是針對多種視網(wǎng)膜細胞包括光感受器細胞和RPE細胞在內(nèi)的最有效的基因傳遞方法[40]，但其有限的克隆能力限制了其作為CRISPR/Cas載體的應(yīng)用。Hung等[41]在小鼠視網(wǎng)膜上通過玻璃體內(nèi)注射AAV2/2載體介導(dǎo)CRISPR/Cas系統(tǒng)的傳遞，CRISPR/Cas系統(tǒng)設(shè)計成可以破壞Thy1-YFP轉(zhuǎn)基因小鼠模型中黃色熒光蛋白的表達，導(dǎo)致YFP表達降低84%，為CRISPR/Cas基因組編輯在活體視網(wǎng)膜中的應(yīng)用提供了證據(jù)。小鼠視網(wǎng)膜下注射AAV2/5 CRISPR/Cas9雙重系統(tǒng)敲除了野生型小鼠LCA10基因CEP290的內(nèi)含子25，該內(nèi)含子與包含LCA10最常見的致病突變的人類內(nèi)含子26同源[41]，為通過敲除內(nèi)含子變異進行治療的概念提供了證據(jù)。研究還集中于增加CRISPR/Cas系統(tǒng)目標(biāo)宿主序列庫，這取決于Cas9對PAM序列的識別。其中，識別NNGRRN PAM基序的金黃色鏈球菌Cas9具有雙重優(yōu)勢，因為其較小(3.1_kb與SpCas9的4.2_kb)，適用于AAV病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染[42]。

純化的Cas9核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)作為AAV的替代遞送途徑也已在視網(wǎng)膜中進行了研究。Cas9 RNP復(fù)合物在遞送后24h內(nèi)降解，減少了Cas9暴露的時間，潛在地減少了非靶點作用[43]。Cas9 RNP靶向VEGF在CNV小鼠模型中的視網(wǎng)膜下遞送顯著降低了VEGF表達，提供了該方法可用于AMD患者的體內(nèi)治療的初步證據(jù)，為AMD患者反復(fù)注射抗VEGF藥物的替代治療提供了可能性[44]。更重要的是，擴大了使用直接投遞純化Cas9蛋白治療視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良的可能性。Cas9 RNP在視網(wǎng)膜細胞中投遞是否與病毒載體介導(dǎo)的視網(wǎng)膜下注射遞送一樣有效，尚需進一步研究。

上述體內(nèi)研究主要是應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)非同源末端連接(non-homologous end joining,NHEJ)，導(dǎo)致缺失(insertion-deletion ，INDEL)和基因失活。由于光感受器細胞是有絲分裂后的細胞，在很大程度上缺乏同源定向修復(fù)(HDR)機制，因此如何在視網(wǎng)膜中實現(xiàn)有效和準確的基因組編輯仍然是一個有待解決的主要問題。Suzuki等[45]研發(fā)了一種新的策略——同源獨立靶向整合(HITI)，使非分裂細胞如光感受器細胞，靶向敲入NHEJ。在RP大鼠模型中視網(wǎng)膜下注射AAV2/8或2/9介導(dǎo)的HITI系統(tǒng)后，正確敲入后維持了視網(wǎng)膜外核層的厚度并改善了視覺功能。因此，這種方法依賴于NHEJ機制而非HDR，來整合所需的DNA序列，可針對有絲分裂后的神經(jīng)元，是非常有前景的解決方案。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)和HDR在臨床前動物模型中也進行了應(yīng)用。Wu等[46]利用這種技術(shù)來確定rd1小鼠模型中導(dǎo)致的RP表型的致病變異。rd1小鼠攜帶Pde6b基因兩個純合變異：第7外顯子中的無義突變(Y347X)和第1內(nèi)含子中的小鼠白血病病毒插入。在CRISPR介導(dǎo)的對無義變異體的糾正之后，治療小鼠的視網(wǎng)膜表型被恢復(fù)，表明Y347X突變具有致病性。類似地，通過使用CRISPR/Cas9技術(shù)生成Reep6的小鼠敲入模型，證實了REEP6中一個新的錯義突變是導(dǎo)致RP的致病突變[47]。

CRISPR技術(shù)之前最大的挑戰(zhàn)之一是常染色體顯性遺傳疾病的治療，因其突變等位基因的特定失活后需要恢復(fù)表型。CRISPR技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)改變了顯性疾病的治療前景，其中一種很有希望的治療方法是通過一種被稱為CRISPR干擾(CRISPRi)的策略來減少基因轉(zhuǎn)錄[48]。在這個策略中，Cas9缺乏核酸酶活性，稱為失活Cas9(dCas9)。當(dāng)dCas9與gRNA特異序列結(jié)合時，轉(zhuǎn)錄機制發(fā)生阻斷，阻止RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄基因，是對RNA干擾策略的改進。目前，這一策略已成功地在真核細胞和人類細胞中實現(xiàn)[49]，但尚未應(yīng)用于視網(wǎng)膜變性疾病，因其最小的非靶效應(yīng)，該策略具有巨大的潛力。利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除突變等位基因是另一種策略，且已在編碼視紫紅質(zhì)(rhodopsin ,RHO)的基因突變導(dǎo)致的顯性遺傳RP中得到應(yīng)用。Bakondi等[50]針對RHO S334突變RP小鼠模型中的一個等位基因特異性PAM序列，在視網(wǎng)膜下注射并電穿孔CRISPR后，挽救光感受器細胞表型，提高了53%的視力，為使用CRISPR/Cas系統(tǒng)來滅活人類常染色體顯性致病性等位基因提供了巨大的希望。

目前尚無CRISPR用于眼科疾病的臨床試驗。將來，EDITAS醫(yī)學(xué)將致力于將上述CEP290跳過內(nèi)含子26的方法引入LCA10患者治療中。

4 外基因校正與細胞治療在IRDs治療中的應(yīng)用

除了通過靶向功能失調(diào)的細胞來停止或至少減緩疾病的進展以外，另一個有前途的治療視網(wǎng)膜變性的方法是干細胞衍生的視網(wǎng)膜細胞移植。視網(wǎng)膜由神經(jīng)外胚層發(fā)育而來，像其他任何中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織一樣呈現(xiàn)低再生潛力。因此，由光感受器細胞退化或丟失引起的IRDs可因細胞治療受益，恢復(fù)功能性視網(wǎng)膜并逆轉(zhuǎn)眼部病變。

首次證明功能性光感受器替換的證據(jù)，是在將新分離的桿狀光感受器移植到視網(wǎng)膜下腔獲得的[51]，然而，由于其有絲分裂狀態(tài)，不能在體外增加移植細胞的數(shù)量。因此，如何在體外擴增光感受器細胞，是有效地移植到供體視網(wǎng)膜的關(guān)鍵。Lamba等[52]研究表明，人類胚胎干細胞(embryonal stem cells,ESCs)可以定向于視網(wǎng)膜細胞分化，成為視網(wǎng)膜前體。將這些ESCs衍生的光感受器前體細胞移植到LCA小鼠模型的視網(wǎng)膜下腔，可以使小鼠的對光反應(yīng)恢復(fù)[53]。ESCs因其高增殖、自我更新和分化潛能，成為體外研究人類疾病的理想工具，但ESCs的倫理困境嚴重阻礙了其全部潛力的開發(fā)。Takahashi等[54]通過重編程將成人成纖維細胞誘導(dǎo)成為多能干細胞(induced multipotential stem cells,iPSCs)，該過程涉及4個轉(zhuǎn)錄因子的表達，這些轉(zhuǎn)錄因子使體細胞恢復(fù)到多能狀態(tài)。這些細胞具有替換患者組織的潛力，并且可以作為人類疾病研究的大量細胞來源[55]。此外，iPSCs來源的細胞在細胞移植方面有2個主要優(yōu)點：避免了與使用胚胎或胎兒組織有關(guān)的倫理問題，并且提供了自體移植，從而避免了免疫排斥風(fēng)險的可能性。

胚胎干細胞和間充質(zhì)干細胞廣泛應(yīng)用于干細胞來源的感光細胞移植，研究者使用小鼠和人ESCs模擬3D培養(yǎng)中的光學(xué)形態(tài)發(fā)生，從而獲得大量適于移植階段的光感受器前體細胞，使該領(lǐng)域發(fā)生了革命性的變化[56]。繼續(xù)開發(fā)更優(yōu)化和標(biāo)準化的分化方案，將會使得人類ESCs和iPSCs對人類眼病的研究和治療產(chǎn)生巨大影響。為了糾正功能變異的外顯子、內(nèi)含子和功能域變異：MAK外顯子9中靶向插入Alu恢復(fù)了視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)；NHEJ糾正了CEP290導(dǎo)致的LCA10的隱性剪接變異；特異性靶向突變等位基因使RHO基因中的顯性Pro23His突變無效[57]；使用CRISPR/Cas9和HDR糾正了導(dǎo)致Usher綜合征2型的USH2A基因中最普遍的c.2299delG突變[58]。這些研究對個性化iPSCs治療視網(wǎng)膜疾病療法的可行性表達了支持。另一方面，在iPSCs中，CRISPR/Cas技術(shù)已經(jīng)用于熒光報告基因敲入Crx基因(光受體特異性轉(zhuǎn)錄因子基因)的末端密碼子，實時監(jiān)測光感受器分化[59]，展示了該技術(shù)在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的前景。

干細胞衍生的感光細胞移植可以恢復(fù)視桿和視錐細胞功能，近期研究表明，有絲分裂后供體和宿主光感受器細胞參與細胞物質(zhì)的轉(zhuǎn)移，如RNA和蛋白質(zhì)，包括視紫紅質(zhì)[60]，但這些移植細胞未整合到宿主未退化的視網(wǎng)膜。最近研究表明，細胞整合和細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移可以發(fā)生在宿主退化過程中，其對疾病的影響取決于宿主環(huán)境[61]，闡明這種細胞物質(zhì)轉(zhuǎn)移的潛在機制可導(dǎo)致一個新的治療途徑，即將功能性蛋白引入功能失調(diào)的感光細胞作為基因替換的替代品。它表明了遞送純化的蛋白質(zhì)Cas9，作用于活體光感受器細胞的基因組編輯的可能性。干細胞衍生的光感受器細胞的使用是理解人類視網(wǎng)膜發(fā)育和疾病建模的有力工具，開發(fā)細胞移植療法具有巨大潛力，hESC和hiPSC衍生的RPE細胞移植已經(jīng)開始進行臨床試驗。最初，hESC衍生的RPE作為游離細胞注射到AMD和Stargardt患者視網(wǎng)膜下腔中，這些細胞在宿主視網(wǎng)膜中隨著時間的推移持續(xù)安全存在，一定程度上挽救了患者視力[62]。最近，一個合成RPE基底膜，包括完全分化的hESC衍生的RPE單細胞涂層，被移植到AMD患者視網(wǎng)膜下，1 a隨訪顯示膜片穩(wěn)定持久，與視力提高和閱讀速度提高有關(guān)[63]。這些療效是否會隨著時間的推移而保護穩(wěn)定尚不確定。最近使用自體hiPSC衍生的RPE單層進行視網(wǎng)膜自體移植，1 a隨訪表明，移植是安全的，即使在沒有免疫抑制的情況下，也沒有引起免疫應(yīng)答[64]，這為將來基因組編輯視網(wǎng)膜細胞自體移植提供了希望?；蛐Ｕ龑τ诨蛲蛔冃迯?fù)后細胞的移植非常重要，需要嚴格的質(zhì)量控制。此外，在移植到患病的宿主視網(wǎng)膜之前，必須對由CRISPR/Cas可能觸發(fā)的非靶效應(yīng)進行詳細篩選。

5 未來的挑戰(zhàn)與展望

眼，特別是視網(wǎng)膜，已被證明是開發(fā)先驅(qū)療法的有力模型，該療法將應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的其他部分[65]。盡管目前研究成功地使用CRISPR/Cas系統(tǒng)對基因組進行了相對容易和精確的操作，但技術(shù)仍在進一步改進中。這些技術(shù)的改進重點在于開發(fā)更有效的傳遞方法，識別和理解非靶標(biāo)事件，以及提高突變校正的效率，所有這些問題都應(yīng)在該策略能夠安全地應(yīng)用于臨床之前得到解決。此外，與基因治療和細胞治療相關(guān)的倫理問題也越來越突出，如何在技術(shù)進步的同時保持倫理的進一步發(fā)展，避免在臨床應(yīng)用領(lǐng)域遭遇倫理困境，值得研究者警惕和關(guān)注。