程序性死亡配體1的轉(zhuǎn)運(yùn)與穩(wěn)定性

鄒媚，林佳，王清水

福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117

機(jī)體在正常情況下，免疫系統(tǒng)會(huì)通過相關(guān)共抑制和共刺激受體及其配體（被稱為免疫檢查點(diǎn)）來保護(hù)宿主免受自身免疫、過敏和傳染病的侵襲[1-2]。臨床數(shù)據(jù)表明，腫瘤利用許多類似途徑作為重要的開關(guān)來逃避抗腫瘤免疫反應(yīng)，并最終發(fā)展、傳播和轉(zhuǎn)移[1,3]。在生理免疫穩(wěn)態(tài)中細(xì)胞程序性死亡受體1（programmed death receptor-1，PD-1）和程序性死亡配體1（programmed death ligand-1，PD-L1）軸在免疫通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]，PDL1在黑色素瘤、卵巢癌、肺癌和腎癌細(xì)胞中的高表達(dá)是癌細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的重要途徑[5]。腫瘤發(fā)生過程中PD-1的主要配體為PD-L1，一旦腫瘤細(xì)胞膜表面編程蛋白PD-L1高于正常組織細(xì)胞，與被激活的T細(xì)胞膜受體PD-1識(shí)別結(jié)合，傳達(dá)抑制免疫信號(hào)后，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少、T細(xì)胞活性削弱、免疫因子與免疫細(xì)胞生成及活性下調(diào)等免疫應(yīng)答，從而幫助腫瘤實(shí)現(xiàn)免疫逃逸[6]。

PD-L1蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控研究進(jìn)展表明，蛋白激酶D（PKD）通過誘導(dǎo)脂酰肌醇4激酶（PI4K）和磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶（PIP5K）的磷酸化來調(diào)節(jié)PD-L1的轉(zhuǎn)運(yùn)[7-9]，順鉑通過誘導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）磷酸化介導(dǎo)膜表面蛋白PDL1的上調(diào)[10]，依賴核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路的CD40誘導(dǎo)PD-L1向細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運(yùn)[11]；人類趨化因子CMTM6能與PD-L1結(jié)合并能維持其在細(xì)胞表面的穩(wěn)定表達(dá)[12]；亨廷頓相互作用蛋白1相關(guān)蛋白（HIP1R）靶向PD-L1溶酶體降解，從而調(diào)控T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤殺傷作用[13]；二甲雙胍導(dǎo)致PDL1翻譯后修飾異常，進(jìn)而阻斷其從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)[14]；PD-L1的2種不同剪接形式?jīng)Q定了后期在膜或胞質(zhì)區(qū)的定位[15]，并且能以可溶性和外泌體的形式游離于胞外[16-17]。這些因子都可能成為潛在的腫瘤免疫治療手段。在此，我們簡要綜述PD-L1的轉(zhuǎn)運(yùn)及維持穩(wěn)定性的相關(guān)因素。

1 PD-1與PD-L1

PD-1擁有288個(gè)氨基酸殘基，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，作為凋亡相關(guān)分子在凋亡的免疫細(xì)胞系中被發(fā)現(xiàn)，主要表達(dá)于抗原性記憶T細(xì)胞，少量表達(dá)于B細(xì)胞、活化自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和單核細(xì)胞[18]。PD-1由胞外區(qū)免疫球蛋白超家族結(jié)構(gòu)域及胞質(zhì)區(qū)免疫受體酪氨酸開關(guān)基序（ITSM）和免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）組成，并含有ITSM和ITIM的磷酸化位點(diǎn)[1,19]。PD-L1擁有290個(gè)氨基酸殘基，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，且對T細(xì)胞有抑制作用，1999年由陳列平等發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)高于正常組織細(xì)胞[20-21]。成熟的PD-L1包含跨膜結(jié)構(gòu)域、Ig-C和Ig-V樣的胞外結(jié)構(gòu)域，以及在不同物種中高度保守且不含信號(hào)肽的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)該蛋白以外泌體的形式大量存在于腫瘤細(xì)胞外，遠(yuǎn)高于正常組織細(xì)胞，并能夠遠(yuǎn)程影響機(jī)體的免疫狀態(tài)[24-25]，表明腫瘤細(xì)胞中PD-L1這一項(xiàng)免疫檢查點(diǎn)是腫瘤實(shí)現(xiàn)免疫逃逸的主要路線。

當(dāng)腫瘤細(xì)胞膜蛋白中PD-L1與T淋巴細(xì)胞中PD-1的胞外結(jié)構(gòu)域相互識(shí)別時(shí)，T細(xì)胞募集與酪氨酸蛋白激酶Src同源的磷酸酶SHP-1和SHP-2，誘導(dǎo)PD-1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中的ITIM和ITSM進(jìn)行磷酸化，進(jìn)一步抑制T細(xì)胞受體（TCR）下游信號(hào)通路的傳導(dǎo)，使T淋巴細(xì)胞功能發(fā)生障礙、耗竭、凋亡和免疫中和[4,26]，生成高度浸潤的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）及細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CD8+）抑制效應(yīng)免疫反應(yīng)，并讓機(jī)體處于腫瘤細(xì)胞殺傷抵抗現(xiàn)狀[14,23,27]。

2 PD-L1的轉(zhuǎn)運(yùn)

2.1 蛋白的分選和轉(zhuǎn)運(yùn)

傳統(tǒng)意義上細(xì)胞核編碼的蛋白質(zhì)分選有2條轉(zhuǎn)運(yùn)途徑：共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)和后翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)[28]。共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)途徑是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在游離核糖體合成延伸幾十個(gè)氨基酸之后，前端信號(hào)肽與其結(jié)合的信號(hào)識(shí)別顆粒（SRP）共同引導(dǎo)新生肽邊合成邊轉(zhuǎn)至糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而后通過轉(zhuǎn)運(yùn)膜泡將肽鏈轉(zhuǎn)移到高爾基體中進(jìn)行加工、包裝，形成成熟的蛋白質(zhì)后分選到溶酶體、細(xì)胞膜或以可溶性蛋白的形式分泌到胞外。后翻譯途徑是蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中游離的核糖體上完成多肽的合成和修飾，直接轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器，成為細(xì)胞質(zhì)中骨架蛋白或可溶性駐留蛋白[29-30]。PD-L1屬于共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)的過程。

2.2 調(diào)控PD-L1運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵因素

由于PD-L1高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞膜表面，并利用PD-1/PD-L1軸的免疫檢查點(diǎn)負(fù)向調(diào)控機(jī)體免疫作用[31]，因此了解影響其轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)因素是必要的。Poly（I∶C）是一種可增強(qiáng)免疫治療的合成型dsRNA模擬物，Varthanan等發(fā)現(xiàn)，用Poly（I∶C）預(yù)處理樹突狀細(xì)胞（DCs）后重組 CD40（rCD40L）導(dǎo)致膜表面PD-L1水平增加而胞內(nèi)無明顯差異，與此同時(shí)rCD40L誘導(dǎo)的PD-L1轉(zhuǎn)運(yùn)可被NF-κB信號(hào)通路抑制劑南蛇藤醇（celastrol）抑制[11]，表明Poly（I∶C）處理DCs后，rCD40L誘導(dǎo)膜表面PD-L1的轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于NF-κB。有趣的是，在用蒽環(huán)類藥物阿霉素處理乳腺癌細(xì)胞時(shí)，檢測到膜表面PDL1蛋白水平明顯下調(diào)而細(xì)胞核中PD-L1上調(diào)。此過程伴隨磷酸化AKT蛋白（p-AKT）的易位，即細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中p-AKT下降，細(xì)胞核中p-AKT上升[32]，表明PD-L1重新分布到細(xì)胞核中的過程與p-AKT轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核有關(guān)。PI3K/AKT通路的抑制作用可消除阿霉素介導(dǎo)的PD-L1的核上調(diào)，表明PI3K/AKT通路參與了PD-L1的核上調(diào)[32-33]。

腫瘤的微環(huán)境中，炎癥細(xì)胞分泌的γ干擾素（IFN-γ）是主要刺激腫瘤PD-L1表達(dá)的一種細(xì)胞因子。用IFN-γ處理人口腔鱗狀細(xì)胞癌會(huì)上調(diào)PKD2及膜表面PD-L1的表達(dá)，并存在時(shí)間和劑量依賴性[34]。當(dāng)PKD的化學(xué)抑制劑抑制或采用shRNA/siRNA干擾PKD2，IFN-γ誘導(dǎo)表達(dá)效果明顯下降[34]。已有研究表明PKD介導(dǎo)PI4K和PIP5K的磷酸化并加強(qiáng)蛋白之間膜質(zhì)運(yùn)輸，且PI4K與PIP5K也參與調(diào)解蛋白進(jìn)入特定的膜位置[7-9]，說明依賴IFN-γ的PD-L1轉(zhuǎn)運(yùn)中PKD軸信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)作用。另外，PKD阻滯劑的加入能削弱紫杉醇誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞TC-1表面PD-L1的表達(dá)[35]，這與PKD參與IFN-γ誘導(dǎo)的PD-L1轉(zhuǎn)運(yùn)相似。此外，二甲雙胍作為Ⅱ型糖尿病口服藥物能激活A(yù)MP依賴的蛋白激酶（AMPK），直接導(dǎo)致PD-L1 S195的磷酸化，誘導(dǎo)PD-L1異常糖基化并導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白（ERAD）降解，進(jìn)而阻斷PD-L1從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的正常轉(zhuǎn)運(yùn)[14]。

依托泊苷、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、順鉑和尼美舒利等多種試劑都可調(diào)控腫瘤細(xì)胞膜表面PD-L1的表達(dá)[35-38]。據(jù)報(bào)道，順鉑通過調(diào)節(jié)ERK1/2的磷酸化來上調(diào)肝癌細(xì)胞株H22膜表面PD-L1的表達(dá)，且在其他腫瘤細(xì)胞如HNSCC和宮頸癌中發(fā)現(xiàn)順鉑亦能上調(diào)膜表面PD-L1的表達(dá)[10]。5-Fu處理結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116可能調(diào)節(jié)PD-L1蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致膜和胞內(nèi)的PD-L1表達(dá)差異[36]。相反地，尼美舒利處理乳腺癌細(xì)胞后，下調(diào)了膜表面的PD-L1蛋白表達(dá)[37]。這些試劑對腫瘤微環(huán)境中PD-L1蛋白具體轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)通路的作用有待進(jìn)一步探究。

PD-L1不同的剪接體會(huì)影響其在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和分布。在外周血單核細(xì)胞（PBMC）中發(fā)現(xiàn)一個(gè)PD-L1新型mRNA剪接變體，主要定位于細(xì)胞內(nèi)，傳統(tǒng)的同工型PD-L1成熟后主要表達(dá)于血漿表面，2種剪接變體有明確的定位模式[15]。證明了PD-L1蛋白結(jié)構(gòu)中Ig-V結(jié)構(gòu)域?qū)τ诎邢蚣?xì)胞表面的轉(zhuǎn)運(yùn)至關(guān)重要。

2.3 PD-L1的亞細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)

對于腫瘤細(xì)胞而言，治療難點(diǎn)在于PD-L1可以源源不斷地從細(xì)胞中產(chǎn)生，最近研究表明，大量PD-L1以外泌體和可溶性蛋白形式存在[16-17]。外泌體在多種腫瘤細(xì)胞胞外具有豐富的生物活性，提示外泌體可能成為半侵襲性生物標(biāo)志。在前列腺癌模型中，外泌體PD-L1具有抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)系統(tǒng)的作用，其阻滯促進(jìn)引流淋巴結(jié)T細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)全身抗腫瘤免疫和記憶[25]。值得注意的是，胞外囊泡可以攜帶活性PD-L1分泌到胞外，協(xié)助腫瘤的免疫逃逸，免受PD-L1抑制劑的追殺。Zhou等在黑色素瘤模型中鑒定出4個(gè)缺少跨膜結(jié)構(gòu)域的可溶分泌型PD-L1剪接體，可溶性PD-L1中大部分能夠抑制免疫T細(xì)胞的活性，在藥物刺激誘導(dǎo)下能夠促進(jìn)表達(dá)[39]。在結(jié)合單抗PD-L1耐藥治療試驗(yàn)中檢測到PD-L1的2個(gè)剪接變體v229/v242能夠競爭性結(jié)合抗體并有效中和抗體活性[24]。這些結(jié)果有力地說明了腫瘤聰明地躲開了很多治療方法。蛋白水平的定量分析只提供了復(fù)雜的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控中的一個(gè)契點(diǎn)，尋找新型有效阻斷PD-L1蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)試劑仍然具有重大意義。

3 PD-L1的穩(wěn)定性

研究表明，除了蛋白的糖基化和泛素化修飾外，PD-L1結(jié)合蛋白也會(huì)影響PD-L1的穩(wěn)定性[40]。最近被鑒定為PD-L1正調(diào)控因子的CMTM6是一種Ⅲ型跨膜蛋白，通過輔助性伴侶蛋白STUB1阻止PD-L1的多聚泛素化，與PD-L1共定位以競爭性回收至內(nèi)體，防止溶酶體導(dǎo)致PD-L1降解，提高PD-L1在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性[41]。CMTM4具有與CMTM6相似的功能[12]。Sigmal是另一種能與PDL1結(jié)合的蛋白，它是某種特定配體調(diào)控的完整支架蛋白，用以維持細(xì)胞蛋白與脂質(zhì)的穩(wěn)定，故其小分子抑制劑能夠通過選擇性自噬誘導(dǎo)PD-L1降解抑制乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞[42]。

PD-L1蛋白降解的具體調(diào)控機(jī)制仍不清楚，而后發(fā)現(xiàn)的HIP1R揭示了PD-L1溶酶體降解途徑的相關(guān)機(jī)制。HIP1R是參與囊泡運(yùn)輸?shù)腇-肌動(dòng)蛋白和網(wǎng)格蛋白的結(jié)合蛋白，在多種腫瘤細(xì)胞中敲低HIP1R均表現(xiàn)為上調(diào)PD-L1表達(dá)。其作為PD-L1溶酶體降解的負(fù)性調(diào)控分子，依賴于HIP1R中的PD-L1結(jié)合序列和分選序列，能通過與AP復(fù)合物結(jié)合將PD-L1運(yùn)輸?shù)饺苊阁w表面，內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體（ESCRT）相關(guān)蛋白ALIX作用后將PD-L1運(yùn)輸至多囊體和溶酶體中進(jìn)行降解。經(jīng)驗(yàn)證，融合了結(jié)合序列和分選序列的多肽PD-LYLSO可以有效介導(dǎo)靶標(biāo)蛋白PD-L1的降解[13]。蛋白酶體抑制劑MG132[43]和溶酶體抑制劑氯喹[44]都可增加PD-L1蛋白的表達(dá)，說明PD-L1的降解途徑包括蛋白酶體降解和溶酶體降解。迄今仍不清楚在不同的癌癥中哪種途徑占優(yōu)勢。

4 結(jié)語

癌癥細(xì)胞中PD-L1的轉(zhuǎn)運(yùn)通路還未明晰，但我們知道它不僅存在于腫瘤細(xì)胞表面，還存在于高爾基體、循環(huán)內(nèi)體和微囊泡中，胞內(nèi)也不斷地為胞外PD-L1進(jìn)行補(bǔ)充，都能行使正常的促癌生物功能。這或許是造成目前抗體藥物對不同癌癥療效受限甚至耐藥的原因。如果能確定PD-L1活性變構(gòu)并挑選與PD-L1相互作用的蛋白質(zhì)，如CMTM4/6、Sigmal和HIP1R等表征后進(jìn)行充分的蛋白分析，可開發(fā)合理的阻斷肽或化合物設(shè)計(jì)，與PD-L1/PD-1單抗藥物雙結(jié)合共同治療癌癥，不失為一種新的治療手段。目前發(fā)現(xiàn)有效而具體地靶向癌細(xì)胞的PD-L1仍然是一個(gè)棘手的問題。