彭宏威，張姍姍，周宗寧，陳 文，許紫琳，陳 杭，鄒 聰，李 剛，胡 瑩，錢開宇

生物樣本尤其是組織樣本在研究各類疾病中起著重要作用，隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，組織樣本的重要性更加凸顯。為此，生物樣本庫的建設(shè)獲得空前重視，組織樣本低溫凍存技術(shù)成為研究熱點(diǎn)[1]。離體后的組織經(jīng)過凍存后，其組織細(xì)胞能否依然保持良好的活性及功能，這對疾病的基礎(chǔ)、臨床和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究均具有重要的意義[2]。目前，組織的凍存主要有程序化法和玻璃化法2種方法。程序化法凍存存在耗時(shí)長、產(chǎn)生胞內(nèi)冰晶和依賴儀器設(shè)備等明顯的缺點(diǎn)；玻璃化法可以有效地避免冰晶的形成且操作簡單，同時(shí)具有更佳的凍存效果，成為近年來凍存研究的熱點(diǎn)[3]。

玻璃化法凍存是Rall和Fahy[4]在1985年首次使用的，他們采用混合多元保護(hù)劑的玻璃化溶液成功凍存了小鼠胚胎，此后這種方法被廣泛應(yīng)用到多種生物樣本的凍存中[5]。由于組織由多種細(xì)胞構(gòu)成，影響其玻璃化法凍存效果的因素更多，目前尚未形成統(tǒng)一規(guī)范的方法。作者對玻璃化法凍存原理、致細(xì)胞損傷機(jī)制、玻璃化法凍存效果的影響因素及其評價(jià)指標(biāo)等進(jìn)行綜述，以期為玻璃化法凍存組織樣本的標(biāo)準(zhǔn)化及后續(xù)研究提供參考。

1 玻璃化法凍存原理

玻璃化法凍存是組織在凍存過程中細(xì)胞內(nèi)外的溶液直接變成介于液態(tài)和固態(tài)之間的“玻璃態(tài)”而得名的，它是利用高濃度滲透性的凍存液先置換出細(xì)胞內(nèi)的自由水，再以極高的降溫速率讓組織迅速通過相變溫度區(qū)，使胞內(nèi)冰晶不能形成，從而避免了細(xì)胞損傷[6]。凍存液玻璃化的形成是本方法的關(guān)鍵，合適的降溫速率和溶液濃度有助于細(xì)胞內(nèi)溶液玻璃化的形成。由于溶液濃度越低，其形成玻璃化所需要的降溫速率越高，但越高的降溫速率越難實(shí)現(xiàn)，這就需要通過提高凍存液濃度來降低實(shí)現(xiàn)玻璃化所需要的降溫速率。然而，過高的溶液濃度對細(xì)胞具有一定的毒性作用，因此，溶液濃度不宜太高，與降溫速率相匹配即可[7]。據(jù)報(bào)道，凍存液濃度在40%～60%(w/w)時(shí)，較慢的降溫速率便可使溶液實(shí)現(xiàn)玻璃化[8]。

2 玻璃化法凍存致細(xì)胞損傷機(jī)制

組織樣本在冷凍降溫過程中引起細(xì)胞損傷的原因有很多，目前國內(nèi)外研究者公認(rèn)的原因?yàn)椤鞍麅?nèi)冰晶”和“溶質(zhì)損傷”[9]。胞內(nèi)冰晶是指快速降溫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)水分未來得及滲透到細(xì)胞外就形成了冰晶，胞內(nèi)冰晶會損傷細(xì)胞器，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞[10]，從而引起細(xì)胞的致命損傷；溶質(zhì)損傷是指慢速降溫時(shí)，細(xì)胞外的溶液先形成冰晶，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)外形成溶液滲透壓差，細(xì)胞內(nèi)水分外滲到細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度升高，細(xì)胞器及細(xì)胞內(nèi)容物長時(shí)間處于高滲溶液中而引起的細(xì)胞損傷[11]。

3 玻璃化法凍存影響組織凍存的因素

玻璃化法凍存的組織前處理、低溫冷凍和復(fù)溫等基本步驟中均存在影響凍存效果的因素，眾多研究者對組織塊大小、凍存液的選擇、凍存載體選用和復(fù)溫方式等主要因素(表1)進(jìn)行了研究。

3.1 組織塊大小 為了提高凍存液的滲透效率，凍存前，組織需切分成適當(dāng)形狀及大小。鑒于凍存的組織復(fù)溫后往往用做移植或培養(yǎng)，所以凍存的組織塊越大，細(xì)胞數(shù)量越多，功能也越全，凍存意義就越大。但組織塊越大，其內(nèi)外滲透程度越不均衡，凍存時(shí)容易造成局部組織損傷壞死。目前極少有組織塊大小對組織玻璃化凍存效果比較的研究報(bào)道，多數(shù)研究者將組織塊切成橫截面積為1 mm2或長度為1 mm的形態(tài)[12-14]。

3.2 凍存液 合適的凍存液在凍存組織時(shí)可增加細(xì)胞粘性，調(diào)控細(xì)胞滲透壓，同時(shí)改變水分子的空間排列，在適宜的降溫速率下可避免溶質(zhì)損傷及冰晶損傷[15]。根據(jù)滲透性的不同，凍存液可分為滲透性凍存液和非滲透性凍存液2類。滲透性凍存液能穿透細(xì)胞膜，可以結(jié)合溶液中的水分子而弱化冰晶的形成；非滲透性凍存液不能穿透細(xì)胞膜，但可提高細(xì)胞外滲透壓，使細(xì)胞內(nèi)水分子滲出細(xì)胞外而降低胞內(nèi)冰晶的形成。由于滲透性凍存液對細(xì)胞有毒性，非滲透性凍存液會導(dǎo)致細(xì)胞失水而皺縮，故2者的濃度、用量均不能太高，玻璃化法中常聯(lián)合使用這2類凍存液。

表1 影響組織凍存效果的因素

注：E為EG，乙二醇；D為DMSO，二甲基亞砜；F為FBS，胎牛血清；PG為沒食子酸丙酯；Y為培養(yǎng)液；Z為蔗糖；ZS為蔗糖溶液

3.3 凍存載體 組織凍存時(shí)，玻璃化法凍存通常會采用一定手段來使組織獲取最佳的傳熱速率，采用凍存載體來改善組織降溫速率最為常見。王燕蓉等[16]分別采用罐口法和超速法2種方式的液氮蒸汽預(yù)冷用塑料麥管裝載好的組織，再將其投入液氮中。有文獻(xiàn)表明，載桿[17]、細(xì)胞網(wǎng)篩[18-19]和金屬網(wǎng)篩[20]等不同類型的凍存載體在組織降溫速率方面發(fā)揮著重要作用，其中金屬固相表面載體[21]的效果更優(yōu)。

3.4 復(fù)溫方式 復(fù)溫是組織凍存時(shí)物理狀態(tài)變化的逆過程，隨著溫度逐漸接近冰點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)也會有產(chǎn)生冰晶的趨勢[15]。為了避免復(fù)溫時(shí)胞內(nèi)冰晶損傷細(xì)胞，目前常采用提高升溫速率來使組織快速通過危險(xiǎn)溫度區(qū)域。組織細(xì)胞復(fù)溫后有毒性的滲透性凍存液會殘留，因此，復(fù)溫液多數(shù)為低濃度凍存液或不含凍存液的培養(yǎng)液，且復(fù)溫后要用不同濃度梯度的蔗糖溶液對組織進(jìn)行多次漂洗[17-18,20]。

4 玻璃化法組織凍存效果的評價(jià)指標(biāo)

玻璃化法凍存組織的效果可通過組織學(xué)形態(tài)、細(xì)胞凋亡、移植、細(xì)胞或組織培養(yǎng)等內(nèi)容進(jìn)行評價(jià)。組織學(xué)形態(tài)是評價(jià)組織凍存效果最基本的指標(biāo)之一，經(jīng)固定、切片及染色等過程處理后的新鮮及凍融組織，在顯微鏡或電鏡下觀察并對比其細(xì)胞比例和結(jié)構(gòu)變化，例如用顯微鏡觀察凍存前后卵泡分布比例及其結(jié)構(gòu)變化，用透射電鏡觀察線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，可評估低溫冷凍對卵巢組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的影響[22]。細(xì)胞凋亡是檢測組織凍融后細(xì)胞存活率的重要指標(biāo)，在評價(jià)組織凍存效果中也應(yīng)用廣泛。

除了形態(tài)及存活方面的變化，凍存組織的某些生物學(xué)功能也可能會發(fā)生變化。為了進(jìn)一步評估凍融后組織的功能，培養(yǎng)(表2)和移植(表3)是使用最多的評估方法。通過細(xì)胞或組織的體外培養(yǎng)，可檢測其在凍融后的生長發(fā)育能力；通過移植可評估凍融后的組織是否仍具有正常生物功能。以卵巢組織的凍存為例，可直接培養(yǎng)卵巢組織塊[21,25]，然后測定其組織學(xué)形態(tài)或培養(yǎng)液中雌二醇等激素含量來評估凍存的效果，也可通過機(jī)械分離或酶解分離出單個卵泡或卵子后[23,27]，在培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間后再測定培養(yǎng)液中的雌激素含量、細(xì)胞的活力及數(shù)目等指標(biāo)來評估凍存的效果。卵巢組織的移植可分為異種移植[28]、自體原位移植[31]和自體異位移植[32]，常通過評估移植后的組織學(xué)形態(tài)、卵泡數(shù)量及活力、雌激素含量，同時(shí)結(jié)合觀察移植物的外觀及其生長情況來評估凍存效果。

表2 組織復(fù)溫后培養(yǎng)評估凍存效果

注：E為EG，乙二醇；D為DMSO，二甲基亞砜；F為FBS，胎牛血清；BSA為牛血清白蛋白；PROH為1,2-丙二醇；Y為培養(yǎng)液；Z為蔗糖；K為抗菌物質(zhì)；ZS為蔗糖溶液

表3 組織復(fù)溫后移植評估凍存效果

注：E為EG，乙二醇；D為DMSO，二甲基亞砜；F為FBS，胎牛血清；BSA為牛血清白蛋白；PROH為1,2-丙二醇；PVP為聚乙烯吡咯烷酮；DPBS為磷酸鹽緩沖液；Y為培養(yǎng)液；Z為蔗糖；ZS為蔗糖溶液

5 存在問題及展望

玻璃化法凍存操作簡單、費(fèi)用低廉且效果良好，用于組織樣本的低溫凍存具有明顯的優(yōu)勢，但目前仍有許多問題有待解決。玻璃化法凍存缺乏統(tǒng)一的凍存方案。由于影響組織凍存效果的因素眾多，不同研究者各自的出發(fā)點(diǎn)不同，因此形成了多種不同的組織玻璃化凍存方案[13-14,17-18]。不僅凍存組織塊大小的選取上[17-20]沒有絕對統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，不同方案的凍存液配方[23-27]、凍存載體[17-20]及復(fù)溫方式[29-34]等關(guān)鍵因素更是差別巨大。玻璃化法凍存細(xì)胞損傷機(jī)制尚有不明之處。胞內(nèi)冰晶與溶質(zhì)損傷雖解釋了細(xì)胞損傷的基本原因，但凍存液對細(xì)胞的毒性，凍存對細(xì)胞膜、細(xì)胞器及遺傳物質(zhì)等造成的損傷機(jī)制，胞內(nèi)冰晶產(chǎn)生的原因等問題均沒有理想的解釋。

如何提高組織凍存的效果是評估玻璃化法的最終目標(biāo)。最佳的凍存方法應(yīng)對凍存液配方、凍存載體及復(fù)溫等關(guān)鍵因素進(jìn)行綜合考慮，盡可能降低細(xì)胞損傷。凍存液的組合配方雖然較多，但沒有指導(dǎo)性的方案，仍需要繼續(xù)探索。近年來，有學(xué)者嘗試新型材料的凍存載體用于組織凍存階段的降溫過程[15]，尤其是固相表面載體，取得了較好的效果，隨著新材料的發(fā)掘及技術(shù)的進(jìn)步，也可能存在某種相對最佳的材質(zhì)，能夠使組織獲得適宜的降溫速率。

此外，組織凍存的研究目前主要集中在卵巢組織領(lǐng)域，且多數(shù)是為臨床服務(wù)的。實(shí)際上，組織樣本低溫凍存的意義遠(yuǎn)不只是在臨床上應(yīng)用，在醫(yī)學(xué)研究中也同樣非常重要。因此，各類正常、癌及癌旁組織樣本的低溫凍存研究還需要更多研究者來不斷探索。隨著低溫冷凍技術(shù)的不斷發(fā)展，凍存液配方的改進(jìn)，玻璃化法凍存組織樣本的方案必將會逐步規(guī)范，并在各類樣本低溫凍存領(lǐng)域中愈加廣泛的應(yīng)用。