吉 潔 馬志君 曹振東 邵雪齋 申興斌 王曉芬

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，承德 067000)

宮頸癌是發(fā)展中國家最常見的癌癥類型之一，是世界第四位最常發(fā)生的婦科癌癥[1]。宮頸癌的治療是手術(shù)、化療和放療[2]。但由于癌癥具有增殖，侵襲和遷移的強大能力，晚期宮頸癌患者的預后仍然較差，其5年生存率約為16.5%[3]。因此，靶向抑制增殖、侵襲和遷移的有效抗癌劑對宮頸癌患者具有高度科學和臨床價值。白茅苷也稱歐前胡素，是提取自中藥白芷、獨活和當歸中的有效成分，具有散風除濕、通竅止痛、消腫排膿、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤的功效[4]。已有研究表明歐前胡素通過靶向于Mcl-1增強多柔比星對宮頸癌細胞的殺傷活性[5]，但白茅苷對宮頸癌治療的具體機制仍尚不清楚。本文旨在研究白茅苷對宮頸癌細胞增殖，凋亡和線粒體膜電位的影響。

1 材料與方法

1.1材料 白茅苷(I6659)購自美國Sigma-Aldrich，化學式：C16H14O4，分子量：270.28，純度≥98；Dulbecco′s modified Eagle′s medium培養(yǎng)基(12100-046)、胎牛血清(10082-147)、胰蛋白酶(25200-056)、青-鏈霉素(15140-122)購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒(C0037)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0012S)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(C1062S)購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；Anti Ki67(ab15580)、PCNA(ab18197)、Bax(ab53154)、Bcl-2(ab196495)、AKT(ab18787)購自美國Abcam公司，宮頸癌SiHa細胞株來源于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，并放置在37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基每2～3 d更換一次，當需要收集細胞時，用0.25%胰蛋白酶消化。試驗用細胞為對數(shù)生長期細胞。

1.2.2CCK-8法檢測細胞活力 將宮頸癌SiHa細胞接種于96孔板(100 μl/孔)孵育24 h后,用不同劑量(0、1、2.5、5、10、25、50、100、200、300、400、500 μmol/L)處理細胞，每孔加入10 μl CCK-8溶液孵育4 h，在450 nm處用酶標儀測定OD值。

1.2.3細胞分組 采用無顯著毒性的25、50、100 μmol/L 進行后續(xù)實驗，將細胞隨機分為四組：對照組(0 μmol/L)、低劑量組(25 μmol/L)、中劑量組(500 μmol/L)、高劑量組(100 μmol/L)。

1.2.4克隆形成法檢測細胞增殖 在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細胞至大約30%匯合度，繼續(xù)培養(yǎng)4 d，吹散為單個細胞，用6孔板培養(yǎng)，約500個細胞每孔，培養(yǎng)14 d，棄掉培養(yǎng)基，用乙醇固定30 min，接著用0.5%結(jié)晶紫染色，用去離子水漂洗晾干，進行拍照觀察。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集懸浮細胞到10 ml的離心管中，每樣本細胞數(shù)為3×106ml-1，500～1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，用孵育緩沖液洗滌1次，500～1 000 r/min離心5 min，用100 μl的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育10～15 min，500～1 000 r/min離心5 min沉淀細胞孵育緩沖液洗1次，加入熒光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20 min，避光，不時振動，流式細胞儀分析：流式細胞儀激發(fā)光波長用488 nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于560 nm的濾器檢測PI。

1.2.6RT-PCR 用Trizol法從宮頸癌SiHa細胞中提取總RNA,用Nanodrop 分光廣度計測定吸光度(A260/A280)，按照試劑盒說明書進行cDNC的合成和PCR的擴增，反應(yīng)條件為:94℃預變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s，擴增35個循環(huán);72℃延長10 min;存儲在4℃條件下。反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離。

1.2.7線粒體膜電位 將各組細胞接種于6孔板后PBS清洗3次，孵育24 h，加入JC-1(5 μg/ml)室溫避光反應(yīng)30 min。用流式分選儀檢測，記錄紅色和綠色熒光強度。

1.2.8Western blot 首先將各組待測細胞用PBS將清洗3次，再加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行總蛋白提取，BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量；提取等量的蛋白質(zhì)樣品(20 mg)，100℃變性5 min。然后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%的BSA室溫封閉1～2 h后加入相應(yīng)的一抗，4℃過夜孵育，次日，清洗后再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，清洗。最后加入發(fā)光液后，于凝膠成像儀進行曝光拍照，并用Image J軟件統(tǒng)計灰度值計算相對表達量。GAPDH作為上樣量參照，至少重復3個獨立的實驗。

1.2.9免疫熒光檢測 將細胞接種于細胞爬片上，用PBS浸洗3次，每次3 min；用多聚甲醛固定15 min，用PBS浸洗3次，每次3 min。0.5%Triton X-100室溫通透20 min，PBS浸洗3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min，吸掉封閉液，加入一抗，孵育過夜，PBS浸洗，避光加入熒光二抗，孵育1 h，PBS浸洗，滴加DAPI避光孵育5 min，用含熒光淬滅劑的封片液封片，于熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

2 結(jié)果

2.1白茅苷抑制宮頸癌SiHa細胞活力 采用CCK-8檢測宮頸癌SiHa細胞活力，結(jié)果如圖1所示。與0 μmol/L劑量相比較，200、300、400和500 μmol/L 劑量細胞存活率顯著降低(P<0.05)。

2.2白茅苷抑制宮頸癌SiHa細胞增殖 采用克隆形成法檢測各組細胞增殖情況如圖2所示。與Imperatorin 0 μmol/L組相比較，Imperatorin 50、100 μmol/L 組細胞增殖率顯著降低(P<0.05)。

2.3白茅苷促進宮頸癌SiHa細胞凋亡 采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡結(jié)果如圖3所示。與Imperatorin 0 μmol/L組相比較，Imperatorin 50、100 μmol/L 組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

圖1 白茅苷對細胞活力的影響

圖2 白茅苷對細胞增殖的影響

圖3 白茅苷對細胞凋亡的影響

圖4 白茅苷對線粒體膜電位的影響

表1 白茅苷對Ki67、PCNA、Bcl-2/Bax mRNA水平的影響

Tab.1 Effects of Imperatorin on mRNA levels of Ki67,PCNA and Bcl-2/Bax

GroupsKi67 mRNA(2-ΔΔCt)PCNA mRNA(2-ΔΔCt)Bcl-2/Bax Imperatorin 0 μmol/L113.36±0.54Imperatorin 25 μmol/L0.95±0.120.98±0.072.09±0.321)Imperatorin 50 μmol/L0.64±0.541)0.53±0.061)0.82±0.081)Imperatorin 100 μmol/L0.17±0.611)0.22±0.041)0.15±0.041)

Note:Compared with Imperatorin 0 μmol/L，1)P<0.05.

2.4白茅苷降低Ki67、PCNA、Bcl-2/Bax mRNA水平 采用RT-PCR檢測各組細胞Ki67、PCNA、Bcl-2/Bax mRNA水平，結(jié)果如表1所示。與Imperatorin 0 μmol/L組相比較，Imperatorin 50、100 μmol/L組Ki67、PCNA、Bcl-2/Bax mRNA水平顯著降低(P<0.05)。

圖5 白茅苷對AKT磷酸化的影響

2.5白茅苷降低宮頸癌SiHa細胞線粒體膜電位 采用流式分選檢測細胞線粒體膜電位的變化結(jié)果如圖4所示。Imperatorin 50、100 μmol/L組較Imperat-orin 0 μmol/L組細胞線粒體膜電位明顯降低。

2.6白茅苷抑制AKT磷酸化 采用Western blot檢測p-AKT/AKT比值結(jié)果如圖5A所示，與Imperatorin 0 μmol/L組相比較，Imperatorin 25、 50、100 μmol/L組p-AKT/AKT比值顯著降低(P<0.05)；采用免疫熒光檢測AKT的細胞定位情況結(jié)果如圖5B所示，與Imperatorin 0 μmol/L組相比較，Imperatorin 25、 50、100 μmol/L組熒光表達顯著降低(P<0.05)。

3 討論

宮頸癌是婦科腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，嚴重威脅女性健康[6]。由于宮頸癌目前的一線化療藥物，如多柔比星、順鉑在經(jīng)過重復用藥啊，腫瘤細胞往往會產(chǎn)生耐藥性[7]。因此，針對宮頸癌發(fā)病機制，需要探尋新型有效的抗宮頸癌藥物。白茅苷是從白芷根中提取的香豆素類天然活性物質(zhì)，據(jù)報道白茅苷對多種腫瘤具有抑制作用[8]。

宮頸癌難以治療的原因之一是由于癌細胞的無限增殖。增殖細胞核抗原(PCNA)、Ki-67是與細胞增殖相關(guān)的核抗原,是近年來廣泛應(yīng)用的細胞增生標記物，PCNA是DNA聚合酶的一種輔蛋白,其與細胞增殖加快密切相關(guān)[9]。Ki-67為增殖細胞核相關(guān)抗原，是反映細胞增殖狀態(tài)的理想標記物[10]。本文研究發(fā)現(xiàn)，白茅苷具有抑制宮頸癌SiHa細胞增殖，降低PCNA、Ki-67 mRNA水平的作用。說明白茅苷通過抑制細胞增殖對宮頸癌具有治療作用。

凋亡即細胞的程序性死亡，是在組織發(fā)育和體內(nèi)平衡中起關(guān)鍵作用的基本生理過程，細胞凋亡通過消除舊的、不必要的和患病的細胞在體內(nèi)發(fā)育和維持中起關(guān)鍵作用[11]。細胞凋亡主要有外源性凋亡途徑、內(nèi)源性凋亡途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑[12]，內(nèi)在凋亡途徑中的關(guān)鍵事件是線粒體外膜的透化，其響應(yīng)于各種刺激而發(fā)生，并且受若干細胞質(zhì)蛋白調(diào)節(jié)，包括Bcl-2家族成員[13]?？辜毎蛲龀蓡TBcl-2，可防止細胞凋亡，而促凋亡成員Bax位于線粒體外膜或細胞質(zhì)，并在應(yīng)激下寡聚化，促進線粒體釋放因子，從而引發(fā)細胞凋亡[14]。誘導細胞凋亡的藥劑可能是宮頸癌治療的理想藥物，Sikander等[15]研究發(fā)現(xiàn)葫蘆素D通過促進宮頸癌細胞凋亡對宮頸癌具有治療作用。Tsai等[16]研究發(fā)現(xiàn)甘草查爾酮A通過促進宮頸癌SiHa細胞凋亡治療宮頸癌。本文研究發(fā)現(xiàn)白茅苷具有促進宮頸癌SiHa細胞凋亡，降低Bcl-2/Bax比值的作用，提示白茅苷對宮頸癌具有治療作用。

線粒體是一種存在于大多數(shù)細胞中有兩層膜包被的細胞器，是細胞中制造能量的結(jié)構(gòu)。線粒體通透性孔的轉(zhuǎn)換對細胞的凋亡有著至關(guān)重要的作用,一旦線粒體通透性孔打開,小分子和離子就會流進線粒體,導致線粒體膜電位的改變[17]。線粒體膜內(nèi)外的電勢差降低，可引起線粒體一系列的生化反應(yīng)，如誘導細胞色素C釋放，活化caspase蛋白酶家族，線粒體膜通透性改變，凋亡誘導因子AIF釋放等，引起細胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，導致細胞凋亡。馬依努爾等[18]研究發(fā)現(xiàn)異甘草素通過降低線粒體膜電位抑制宮頸癌SiHa細胞增殖。劉志剛等[19]研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA通過降低線粒體膜電位抑制SiHa細胞增殖并誘導其凋亡。本文研究發(fā)現(xiàn)白茅苷具有降低宮頸癌SiHa線粒體膜電位的作用，提示白茅苷抑制細胞增殖，促進細胞凋亡可能是通過降低線粒體膜電位實現(xiàn)的。

Akt及其信號通路是基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)領(lǐng)域中最熱門的激酶和激酶通路之一[20]。PI3K/AKT信號通路在細胞增殖與凋亡的異常調(diào)節(jié)途徑中發(fā)揮重要作用,AKT在該通路中起核心作用,活化的AKT通過作用下游效應(yīng)分子,使細胞存活、增殖、抑制凋亡,與腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[21]。本文研究發(fā)現(xiàn)，白茅苷具有降低宮頸癌細胞SiHa細胞p-AKT/AKT比值、AKT熒光表達的作用，說明白茅苷通過抑制AKT的活化調(diào)節(jié)宮頸癌細胞SiHa的增殖、凋亡和線粒體膜電位。

綜上所述，本文揭示了白茅苷對宮頸癌細胞SiHa的影響：抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，降低Ki67、PCNA、Bcl-2/Bax mRNA水平，降低線粒體膜電位，降低p-AKT/AKT比值、AKT熒光表達。為白茅苷臨床應(yīng)用治療宮頸癌提供了實驗依據(jù)。