miR-181a-5p調(diào)控IGF2BP2表達(dá)對(duì)胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)、遷移能力的影響及機(jī)制

萬(wàn)淑梅，彭萍，高妍

中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，廣州510010

子癇前期(PE)又稱(chēng)先兆子癇，是孕產(chǎn)婦和胎兒死亡的主要原因之一[1]。PE的病因目前尚未明確，但胎盤(pán)發(fā)育缺陷與之相關(guān)，而胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和入侵不足可導(dǎo)致胎盤(pán)發(fā)育異常和功能異常[2]。研究認(rèn)為，增加胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力是治療PE的新策略[3]。因此，研究調(diào)控胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力的關(guān)鍵因素至關(guān)重要。微小核糖核酸(miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和運(yùn)動(dòng)等正常生理活動(dòng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用[4]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA的異常表達(dá)譜在PE患者的臍帶血、血清、胎盤(pán)組織和間充質(zhì)干細(xì)胞中均有發(fā)現(xiàn)[5]。腫瘤進(jìn)展和胎盤(pán)發(fā)育過(guò)程有許多共同的特征，包括遷移和浸潤(rùn)。miR-181a-5p是腫瘤相關(guān)抑制因子，參與肝細(xì)胞肝癌、非小細(xì)胞肺癌和膠質(zhì)瘤等的增殖、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為[6～8]，其對(duì)胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力的影響引起我們的關(guān)注。miRNA的調(diào)控機(jī)制是通過(guò)其靶基因發(fā)揮作用[9]，胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA結(jié)合蛋白(IGF2BP2)是一種癌基因，而Wnt/β-catenin是經(jīng)典的信號(hào)通路。2017年1月～2019年1月，我們分析了miR-181a-5p對(duì)IGF2BP2的調(diào)控作用，觀察其對(duì)胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo浸潤(rùn)、遷移的影響及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 PrimeScriptTMRT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄、SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；miR-181a-5p、IGF2BP2、內(nèi)參U6和GAPDH引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成；HTR-8/SVneo細(xì)胞由加拿大皇后大學(xué)的Graham教授實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；miR-181a-5p mimic和過(guò)表達(dá)IGF2BP2質(zhì)粒購(gòu)自廣州瑞博公司；6孔板和Transwell購(gòu)于美國(guó)Coring公司。Wnt1、β-catenin抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 miR-181a-5p靶向調(diào)控IGF2BP2的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與驗(yàn)證 用TargetScan7.1軟件(http://www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)miR-181a-5p的靶基因，觀察miR-181a-5p與IGF2BP2的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)是否存在結(jié)合位點(diǎn)。以PCR將IGF2BP2野生型(wt)和突變型(mut)全長(zhǎng)3′-UTR片段進(jìn)行擴(kuò)增后，插入到pGLO載體中構(gòu)建pGLO-IGF2BP2-wt和pGLO-IGF2BP2-mut。將HTR-8/SVneo細(xì)胞以4×103/孔接種96孔板中，分為干預(yù)組和對(duì)照組，接種12 h后采用Lip2000分別同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-181a-5p(空白對(duì)照NC)與野生型或突變型IGF2BP2 mRNA 3′UTR熒光素酶報(bào)告基因pGLO載體；轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶報(bào)告基因活性。

1.3 胎盤(pán)組織中miR-181a-5p和IGF2BP2 mRNA檢測(cè) 采用qRT-PCR法。經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意后，收集在2015年10月～2016年12月入住我院婦產(chǎn)科行剖宮產(chǎn)分娩產(chǎn)婦的胎盤(pán)組織，其中PE患者和正常妊娠產(chǎn)婦各30例。受試者均簽署知情同意書(shū)，均為單胎妊娠，未患有全身性疾病。PE產(chǎn)婦年齡(31.12±2.02)歲，正常妊娠產(chǎn)婦年齡(30.12±3.24)歲，兩者基本資料具有可比性。將新鮮胎盤(pán)組織液氮冷凍后，加入TRIzol裂解液，提取組織總RNA。細(xì)胞系采用PBS洗滌3次后，加入TRIzol裂解液，提取細(xì)胞總RNA。設(shè)計(jì)合成引物：miR-181a-5p上游為5′-CCGCGAACATTCAACGCTGTCG -3′、下游為5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′，U6上游為5′- CAAATTCGTGAAGCGTTCCATAT-3′、下游為5′-GCTTCACGAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3′；IGF2BP2上游為5′-AGTGGAATTGCATGGGAAAATCA-3′、下游為5′-CAACGGCGGTTTCTGTGTC-3′，GAPDH上游為5′-ATGGAAATCCCATCACCATCTT-3′、下游為5′-CGCCCCACTTGATTTTGG-3′。PrimeScriptTMRT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄體系將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并將其作為模板，95 ℃預(yù)變性5 s，95 ℃變性5 s、65 ℃退火30 s共40個(gè)循環(huán)。使用7500 real-time PCR檢測(cè)各樣品的循環(huán)閾值(Ct)，計(jì)算方法為2-ΔΔCt。以U6為內(nèi)參計(jì)算miR-181a-5p相對(duì)表達(dá)量，GAPDH為內(nèi)參計(jì)算IGF2BP2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與分組轉(zhuǎn)染 采用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HTR-8/SVneo細(xì)胞，置于37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細(xì)胞融合度達(dá)90%以上時(shí)，按1∶3進(jìn)行傳代。選處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，以1.5×105/孔接種6孔板，分為NC組、miR-181a-5p過(guò)表達(dá)組和miR-181a-5p+IGF2BP2過(guò)表達(dá)組。接種12 h后用Lip2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列、miR-181a-5p mimic、miR-181a-5p mimic+IGF2BP2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒；置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h更換新鮮培養(yǎng)基。

1.5 細(xì)胞中IGF2BP2 mRNA檢測(cè) 取各組細(xì)胞，采用qRT-PCR法檢測(cè)IGF2BP2 mRNA，方法同1.3。

1.6 細(xì)胞浸潤(rùn)能力觀察 采用Boyden實(shí)驗(yàn)。將無(wú)血清培養(yǎng)基和BD基質(zhì)膠以10∶1的比例進(jìn)行稀釋?zhuān)?5 μL加入Transwell小室聚碳酸酯微孔膜上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中備用。收集各組細(xì)胞，以細(xì)胞1×106/孔、100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基接種于基質(zhì)膠上，下室加入500 μL含10% FBS的培養(yǎng)基。10 h后終止培養(yǎng)，以PBS將未穿過(guò)的上室細(xì)胞洗去；穿過(guò)的細(xì)胞經(jīng)甲醇固定，蘇木素染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.7 細(xì)胞遷移能力觀察 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。在Transwell小室中無(wú)需加基質(zhì)膠，將1×106個(gè)細(xì)胞直接接種于Transwell小室聚碳酸酯微孔膜上，細(xì)胞只需穿過(guò)膜上的微孔，其余步驟同Boyden實(shí)驗(yàn)。

1.8 細(xì)胞中Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。收集各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液完全裂解細(xì)胞；4 ℃下12 000 r/min離心20 min，將上清液移至新的EP管中，并檢測(cè)蛋白濃度；煮沸變性后，各組加入相同質(zhì)量的蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳；濕轉(zhuǎn)，5% BSA室溫封閉PVDF膜2 h；加入Wnt1和β-catenin一抗稀釋液4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光法曝光蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 miR-181a-5p靶向調(diào)控IGF2BP2的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與驗(yàn)證結(jié)果 TargetScan7.1軟件在線預(yù)測(cè)顯示，IGF2BP2啟動(dòng)子區(qū)存在miR-181a-5p的結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)表1。雙熒光素酶報(bào)道基因試驗(yàn)顯示，與對(duì)照組比較，干預(yù)組能降低野生型IGF2BP2 mRNA 3′UTR熒光素酶報(bào)告基因活性(P<0.05)，但對(duì)突變型IGF2BP2 mRNA 3′UTR熒光素酶報(bào)告基因活性無(wú)明顯影響(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表1 miR-181a-5p與IGF2BP2 mRNA 3′UTR結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

表2 miR-181a-5p對(duì)IGF2BP2 mRNA 3′UTR熒光素酶報(bào)告基因活性的影響

注：與對(duì)照組同型別比較，*P<0.05。

2.2 胎盤(pán)組織中miR-181a-5p、IGF2BP2 mRNA表達(dá)水平及二者的相關(guān)性 PE胎盤(pán)組織中miR-181a-5p、IGF2BP2 mRNA表達(dá)量分別為0.64±0.36、1.49±0.61，正常妊娠婦女胎盤(pán)組織中分別為0.85±0.34、1.02±0.28，兩者miR-181a-5p、IGF2BP2 mRNA比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。Pearson分析結(jié)果顯示，在PE胎盤(pán)組織中miR-181a-5p與IGF2BP2 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.601,P<0.05)。

2.3 各組胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞中GF2BP2 mRNA表達(dá)比較 與NC組(1.00±0.10)比較，miR-181a-5p 過(guò)表達(dá)組(0.18±0.07)和miR-181a-5p +IGF2BP2過(guò)表達(dá)組(0.38±0.02)細(xì)胞中IGF2BP2 mRNA表達(dá)均降低(P均<0.05)；與miR-181a-5過(guò)表達(dá)組比較，miR-181a-5p +IGF2BP2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中IGF2BP2 mRNA表達(dá)增加(P<0.05)。

2.4 各組胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)、遷移能力比較 與NC組比較，miR-181a-5p 過(guò)表達(dá)組和miR-181a-5p+IGF2BP2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞浸潤(rùn)、遷移的穿膜細(xì)胞數(shù)減少(P均<0.05)；與miR-181a-5過(guò)表達(dá)組比較，miR-181a-5p +IGF2BP2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞浸潤(rùn)、遷移的穿膜細(xì)胞數(shù)增多(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)、遷移能力比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與miR-181a-5p 過(guò)表達(dá)組比較，#P<0.05。

2.5 各組胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路水平比較 與NC組比較，miR-181a-5p 過(guò)表達(dá)組和miR-181a-5p+IGF2BP2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中Wnt1和β-catenin蛋白表達(dá)降低(P均<0.05)；與miR-181a-5p過(guò)表達(dá)組比較，miR-181a-5p+IGF2BP2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中Wnt1和β-catenin蛋白表達(dá)增加(P均<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路水平比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與miR-181a-5p 過(guò)表達(dá)組比較，#P<0.05。

3 討論

正常的胎盤(pán)功能是影響妊娠的重要因素，維持胎盤(pán)功能最重要的是胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞。滋養(yǎng)層細(xì)胞處于胚胎和母體血管系統(tǒng)之間的界面，在正常妊娠中，滋養(yǎng)層細(xì)胞通過(guò)蛻膜和子宮肌層的遷移，浸潤(rùn)至內(nèi)皮和中膜的母體螺旋動(dòng)脈，即間質(zhì)和血管浸潤(rùn)；遷移和浸潤(rùn)是滋養(yǎng)細(xì)胞分化的主要途徑，而滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)不足或過(guò)度浸潤(rùn)均可能導(dǎo)致子宮胎盤(pán)灌注壓降低和胎盤(pán)缺血/缺氧。缺血誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激同時(shí)引起胎盤(pán)的損傷和壞死以及胎盤(pán)因子釋放，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙和全身性炎癥，促使PE的發(fā)生，威脅孕婦和胎兒的生命健康[10]。PE主要特征為高血壓和蛋白尿，并發(fā)肝、腎、腦和凝血系統(tǒng)等全身問(wèn)題，妊娠20周后孕婦發(fā)生比例>30%[11]。因此，研究PE的發(fā)病機(jī)制、干預(yù)胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)能力對(duì)維持正常妊娠具有重要意義。

miRNA屬于一類(lèi)小的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，miRNA廣泛表達(dá)于各類(lèi)組織中[4]。胎盤(pán)發(fā)育中的許多細(xì)胞過(guò)程，包括滋養(yǎng)層分化、遷移、浸潤(rùn)、增殖、凋亡、血管發(fā)生/血管生成和細(xì)胞代謝等均受到miRNA的調(diào)控[12]。miRNA表達(dá)異?？梢鸢ㄌケP(pán)發(fā)育異常等多種疾病的發(fā)生[13]。胎盤(pán)組織中越來(lái)越多異常表達(dá)的miRNA被發(fā)現(xiàn)，miR-181a-5p是與血液系統(tǒng)中血管內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞發(fā)生及分化相關(guān)的miRNA[14]。然而，miR-181a-5p也是與腫瘤惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)的miRNA之一，其在肝細(xì)胞肝癌、非小細(xì)胞肺癌和膠質(zhì)瘤等腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，并抑制腫瘤增殖和侵襲[6～8]。Huang等[15]報(bào)道，miR-181a-5p在PE胎盤(pán)組織中表達(dá)上調(diào)，并能引發(fā)抗細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞侵襲。胎盤(pán)發(fā)育和腫瘤進(jìn)展有許多共同的特征，miR-181a-5p在腫瘤疾病和胚胎發(fā)育障礙中發(fā)揮的作用是一致的，具體的作用機(jī)制未明確。miRNA通過(guò)結(jié)合靶mRNA的3′-UTR中的互補(bǔ)位點(diǎn)，導(dǎo)致mRNA翻譯抑制或者降解，抑制靶基因的表達(dá)發(fā)揮功能[9]。TargetScan7.1軟件在線預(yù)測(cè)顯示，IGF2BP2 3′-UTR存在miR-181a-5p的結(jié)合位點(diǎn)，可能是miR-181a-5p的靶基因。進(jìn)一步采用雙熒光素酶報(bào)道基因試驗(yàn)和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，IGF2BP2是miR-181a-5p的直接靶基因。

IGF2BP2在胰腺癌、結(jié)直腸癌和急性髓細(xì)胞白血病等腫瘤組織中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并與患者的預(yù)后不良相關(guān)，被認(rèn)為是促癌基因[16～18]。但I(xiàn)GF2BP2和PE與胎盤(pán)發(fā)育等相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道，因此我們推測(cè)miR-181a-5p可能靶向負(fù)調(diào)控IGF2BP2抑制胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力。首先，我們?cè)诮M織水平檢測(cè)miR-181a-5p和IGF2BP2 mRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與正常妊娠胎盤(pán)組織相比，PE胎盤(pán)組織中miR-181a-5p表達(dá)下降，IGF2BP2 mRNA表達(dá)增加，且兩者在PE胎盤(pán)組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-181a-5p可能靶向IGF2BP2的表達(dá)導(dǎo)致胎盤(pán)發(fā)育障礙。在細(xì)胞水平生物功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-181a-5p抑制胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo的浸潤(rùn)和遷移能力，而增加IGF2BP2表達(dá)可減弱miR-181a-5p對(duì)胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)和遷移能力的抑制作用，表明miR-181a-5p是通過(guò)靶向調(diào)控IGF2BP2基因發(fā)揮抑制胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)和遷移的能力。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是與腫瘤惡性進(jìn)展密切相關(guān)的重要調(diào)控途徑之一[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在PE患者胎盤(pán)中被抑制，導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和增殖能力降低，從而促進(jìn)了PE的發(fā)生發(fā)展[20]。在本研究中，我們檢測(cè)了Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白Wnt1和β-catenin的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p可抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，而IGF2BP2基因可以減弱miR-185a -5p對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制作用。

綜上所述，在PE胚胎組織中miR-181a-5p表達(dá)下降，IGF2BP2基因表達(dá)增加。miR-181a-5p靶向負(fù)調(diào)控IGF2BP2基因可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性降低胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞的浸潤(rùn)和遷移能力，miR-181a-5p可能是干預(yù)PE進(jìn)展的潛在靶點(diǎn)。