楊 彤 王建瑞* 彭煒航

（1.魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺(tái)264025；2.山東博華高效生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，山東 濱州256500）

珊瑚狀猴頭[Hericium coralloides(Scop.)Pers.]，隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、傘菌綱（Agariomycetes）、紅菇目（Russulales）、猴頭菌科（Hericiaceae）、猴頭菌屬（Hericium），又名松花蘑（長(zhǎng)白山區(qū)）、玉髯[1]，與猴頭菌[Herieium erinaeeus(Bun.:Fr)Pers.][2]為同屬類群。該種分布于我國(guó)東北三省、陜西、四川、云南、新疆、西藏等地[3]，是長(zhǎng)白山自然保護(hù)區(qū)特有的珍稀食藥用真菌，由于分布較少，已被相關(guān)研究列為“三級(jí)保護(hù)種”[4]。每年初夏至初秋，生長(zhǎng)于白樺、槭樹(shù)等多種闊葉樹(shù)樹(shù)干或腐木上。

猴頭菌屬類群是我國(guó)著名的食藥用真菌資源，近年來(lái)，被大量用于新藥產(chǎn)品開(kāi)發(fā)上，其菌絲體多糖具有抗腫瘤、提高免疫力、抗凝血、降血脂等功效[5,6]。該屬中的猴頭菌含有能顯著提高人體免疫力、抗腫瘤的猴頭菌多糖[7,8]；珊瑚狀猴頭菌多糖具有顯著的抗氧化作用，對(duì)大鼠肝臟的代謝有調(diào)節(jié)作用[9]。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)猴頭菌屬的液體發(fā)酵工藝的研究比較多。例如劉曉鵬等[10]通過(guò)對(duì)影響猴頭菌生長(zhǎng)的主要營(yíng)養(yǎng)因子進(jìn)行研究得出液體培養(yǎng)猴頭菌的最佳營(yíng)養(yǎng)條件組合，并利用中心復(fù)合設(shè)計(jì)法與響應(yīng)面分析，優(yōu)化了猴頭菌液體培養(yǎng)的發(fā)酵工藝條件。

據(jù)報(bào)道，產(chǎn)自長(zhǎng)白山的珊瑚狀猴頭菌營(yíng)養(yǎng)豐富，含有18種氨基酸，其中有人體所必需的氨基酸8種。珊瑚狀猴頭還具有利五臟，滋補(bǔ)，助消化功能，用于主治神經(jīng)衰弱、胃潰瘍等疾病，是一種優(yōu)良的藥用真菌。但是，由于珊瑚狀猴頭分布稀少，研究和開(kāi)發(fā)利用的相關(guān)報(bào)道不多。2010年，范宇光和圖力古爾[11]首次報(bào)道產(chǎn)自長(zhǎng)白山自然保護(hù)區(qū)的珊瑚狀猴頭馴化栽培成功，并簡(jiǎn)要介紹了人工栽培技術(shù)，而未見(jiàn)其生物學(xué)特性及培養(yǎng)條件優(yōu)化的相關(guān)研究報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本試驗(yàn)供試菌株采摘自吉林長(zhǎng)白山，分離純化后得到純菌種，經(jīng)過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)提取DNA，并擴(kuò)增ITS 序列，其結(jié)果經(jīng)在GenBank 上比對(duì)，確定該菌株為珊瑚狀猴頭，編號(hào)：090801。

1.2 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g、維生素B120 mg、瓊脂20 g，水1 000 mL。

碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g、蛋白胨2 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g、維生素B120 mg、瓊脂20 g，水1 000 mL。氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g、維生素B120 mg、瓊脂20 g，水1 000 mL。

正交試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g、維生素B120 mg、瓊脂20 g，水1 000 mL。

1.3 試驗(yàn)方法

（1）碳源試驗(yàn)。珊瑚狀猴頭菌接種在PDA 培養(yǎng)基的平板上，22℃培養(yǎng)，待其長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)用直徑1 cm的打孔器取一菌絲塊，接種于PDA 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央。在碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別加入葡萄糖20 g，蔗糖20 g，麥芽糖20 g，可溶性淀粉20 g，乳糖20 g。分別在以上5種碳源培養(yǎng)基平板上接種、培養(yǎng)。每隔48小時(shí)用劃線法測(cè)量菌落直徑，連續(xù)測(cè)量14天，觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)。每個(gè)處理重復(fù)5次。

（2）氮源試驗(yàn)。在氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別加入酵母浸膏2 g，蛋白胨2 g，硫酸銨2 g，尿素2 g，亞硝酸鈉2 g。分別在以上5種氮源培養(yǎng)基平板上接種。接種、培養(yǎng)和測(cè)量方法同碳源試驗(yàn)。每個(gè)處理重復(fù)5次。

（3）pH試驗(yàn)。用10%NaOH 溶液和10%HCl溶液將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至3、3.5、4、5、6 等5個(gè)梯度。接種、培養(yǎng)和測(cè)量方法同碳源試驗(yàn)。每個(gè)處理重復(fù)5次。

（4）溫度試驗(yàn)。分別置于15℃、20℃、22℃、24℃、28℃、30℃的恒溫生物培養(yǎng)箱和15℃/20℃、20℃/25℃的變溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中變溫為15℃與20℃，以及20℃與25℃各12 h 循環(huán)培養(yǎng)，測(cè)量方法同碳源試驗(yàn)。每個(gè)處理重復(fù)5次。

（5）正交試驗(yàn)。對(duì)以上4個(gè)因素碳源、氮源、溫度、pH各選出4個(gè)水平，進(jìn)行4 因素4 水平的正交試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源與珊瑚狀猴頭菌絲生長(zhǎng)的關(guān)系

珊瑚狀猴頭菌絲在幾種不同碳源培養(yǎng)基中均能夠正常生長(zhǎng)，生長(zhǎng)長(zhǎng)度隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖1。其中，以在葡萄糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，以下依次是蔗糖、麥芽糖、乳糖，在可溶性淀粉中生長(zhǎng)最慢。

圖1 不同碳源培養(yǎng)基珊瑚狀猴頭的菌落半徑

選取第11天不同碳源上的菌絲長(zhǎng)度，進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表1。通過(guò)差異顯著性分析得出，葡萄糖和麥芽糖處理組之間無(wú)顯著差異，而葡萄糖和其他處理組差異均呈極顯著；麥芽糖和蔗糖兩個(gè)處理組之間沒(méi)有顯著差異，蔗糖和乳糖兩個(gè)處理組之間也沒(méi)有顯著差異；可溶性淀粉和乳糖、蔗糖之間無(wú)極顯著差異，但與其他處理組呈極顯著差異。從生長(zhǎng)勢(shì)上看，在葡萄糖培養(yǎng)基中菌絲潔白、濃密，長(zhǎng)勢(shì)較好；其次為蔗糖、麥芽糖培養(yǎng)基，菌絲潔白、較密；乳糖和可溶性淀粉培養(yǎng)基上，菌絲稀薄。綜合菌絲的生長(zhǎng)長(zhǎng)度和生長(zhǎng)勢(shì)，葡萄糖是珊瑚狀猴頭菌絲生長(zhǎng)的適宜碳源。

表1 不同碳源培養(yǎng)基的珊瑚狀猴頭菌絲生長(zhǎng)情況

2.2 不同氮源與珊瑚狀猴頭菌絲生長(zhǎng)的關(guān)系

圖2 不同氮源培養(yǎng)基珊瑚狀猴頭的菌落半徑

珊瑚狀猴頭菌絲在幾種不同的氮源培養(yǎng)基中均能夠生長(zhǎng)，生長(zhǎng)長(zhǎng)度隨時(shí)間而變化（圖2）。其中，以在硫酸銨、酵母浸膏和蛋白胨3種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，在硫酸銨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，菌絲潔白，濃密；其次為酵母浸膏和蛋白胨培養(yǎng)基。亞硝酸鈉和尿素兩個(gè)處理菌絲生長(zhǎng)差、長(zhǎng)度短。選取第11天不同氮源的菌絲長(zhǎng)度進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表2。通過(guò)差異顯著性分析得出，硫酸銨、酵母浸膏和蛋白胨3個(gè)處理組之間的菌絲生長(zhǎng)速度無(wú)顯著差異，而這3 組與亞硝酸鈉和尿素兩個(gè)處理組之間呈極顯著差異。從生長(zhǎng)勢(shì)看，硫酸銨處理組菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好，其次為酵母浸膏和蛋白胨處理組，而亞硝酸鈉和尿素兩個(gè)處理組的菌絲長(zhǎng)勢(shì)最差，菌絲較弱、稀薄。綜合菌絲的生長(zhǎng)長(zhǎng)度和生長(zhǎng)勢(shì)，硫酸銨是珊瑚狀猴頭菌絲生長(zhǎng)的適宜氮源，酵母浸膏和蛋白胨也較為合適。

表2 不同氮源培養(yǎng)基的珊瑚狀猴頭菌絲生長(zhǎng)情況

2.3 pH與珊瑚狀猴頭菌絲生長(zhǎng)的關(guān)系

珊瑚狀猴頭菌絲在幾種不同pH條件培養(yǎng)基上均能夠生長(zhǎng)，生長(zhǎng)長(zhǎng)度隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖3。剛開(kāi)始萌發(fā)時(shí)，幾個(gè)處理組的菌絲生長(zhǎng)速度差別不大，約經(jīng)10天，pH最低的處理組菌絲生長(zhǎng)速度明顯低于其他幾組，而pH為3.5和4的兩個(gè)處理組，菌絲生長(zhǎng)速度明顯快于其他各組。

選取第11天不同pH處理組的菌絲，測(cè)量其長(zhǎng)度，并進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3：pH為3.5和4的兩個(gè)處理組之間無(wú)顯著差異。pH為5和6的兩個(gè)處理組與pH為4的處理組之間也無(wú)顯著差異，但與pH為3.5的處理組有極顯著差異。從菌絲長(zhǎng)勢(shì)看，pH為3.5的處理組表現(xiàn)較好，其次是pH為4、5和6 處理組，而pH為3的處理組表現(xiàn)較差。綜合菌絲的長(zhǎng)速和長(zhǎng)勢(shì)，珊瑚狀猴頭菌絲生長(zhǎng)的適宜pH為3.5。

圖3 不同pH培養(yǎng)基珊瑚狀猴頭的菌落半徑

表3 不同pH培養(yǎng)基的珊瑚狀猴頭菌絲生長(zhǎng)情況

2.4 溫度與珊瑚狀猴頭菌絲生長(zhǎng)的關(guān)系

珊瑚狀猴頭菌絲在幾種不同溫度條件下均能夠生長(zhǎng)，生長(zhǎng)長(zhǎng)度隨時(shí)間變化結(jié)果見(jiàn)圖4。溫度為20℃、22℃和24℃3個(gè)處理組的菌絲生長(zhǎng)較快。尤以22℃處理組生長(zhǎng)最好、最快。

選取第11天各處理組菌絲，測(cè)量其長(zhǎng)度并進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4。溫度為22℃的處理組與20℃的處理組之間無(wú)顯著差異，與24℃處理組之間存在顯著性差異，但未達(dá)到極顯著水平。溫度低于20℃、高于24℃，以及兩個(gè)變溫處理組的菌絲生長(zhǎng)速度明顯下降，且長(zhǎng)勢(shì)差。綜合菌絲的生長(zhǎng)長(zhǎng)度和生長(zhǎng)勢(shì)，珊瑚狀猴頭菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為20～22℃。

圖4 不同溫度條件下珊瑚狀猴頭的菌落半徑

表4 不同溫度培養(yǎng)珊瑚狀猴頭菌的菌絲生長(zhǎng)情況

2.5 珊瑚狀猴頭菌絲生長(zhǎng)條件優(yōu)化

從以上單因素實(shí)驗(yàn)中分別挑選適宜的4個(gè)水平進(jìn)行4 因素4 水平正交試驗(yàn)。通過(guò)對(duì)菌絲長(zhǎng)速的方差分析可知，4種因素的顯著性差異大小順序?yàn)椋簻囟龋緋H＞氮源＞碳源（表5）。菌絲生長(zhǎng)最好的是第3 組，即碳源、氮源分別是葡萄糖和蛋白胨、pH為4、溫度22℃。根據(jù)各處理組中各因素同一水平之和的計(jì)算結(jié)果，結(jié)合菌絲長(zhǎng)勢(shì)，得出珊瑚狀猴頭菌菌絲培養(yǎng)的最佳條件為：碳源、氮源分別是葡萄糖和酵母浸膏，pH為4，溫度為20℃。

表5 最佳培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

在單因素實(shí)驗(yàn)中，葡萄糖和硫酸銨分別是理想的可利用碳源和氮源，菌絲體生長(zhǎng)的最佳pH是3.5，最佳溫度條件是22℃。其中，在溫度的單因素實(shí)驗(yàn)當(dāng)中我們采用了15℃/20℃及20℃/25℃兩組變溫來(lái)培養(yǎng)菌絲體，發(fā)現(xiàn)20℃/25℃是培養(yǎng)菌絲體的較適宜溫度范圍。在此溫度范圍內(nèi)再設(shè)置20℃、22℃、24℃3個(gè)溫度梯度發(fā)現(xiàn)，22℃是菌絲體最佳生長(zhǎng)溫度。說(shuō)明該菌株的生物學(xué)特性與其生長(zhǎng)地環(huán)境有較大關(guān)系。該菌主產(chǎn)于我國(guó)東北地區(qū)，屬低溫型菌類，本試驗(yàn)結(jié)果也顯示該菌菌絲在較低溫下生長(zhǎng)較好，而對(duì)于變溫和恒溫的要求不大。

通過(guò)4 因素4 水平的正交試驗(yàn)分析得知：4種因素對(duì)珊瑚狀猴頭菌的影響程度從大到小依次為：溫度＞pH＞氮源＞碳源。而葡萄糖、酵母浸膏、pH為4、溫度20℃是菌絲體最佳綜合生長(zhǎng)條件。

綜合本試驗(yàn)單因素和正交試驗(yàn)分析比較認(rèn)為，珊瑚狀猴頭的菌絲培養(yǎng)條件為：碳源為葡萄糖，氮源可選擇酵母浸膏和蛋白胨，pH以3.5～4 較好。但使用固體培養(yǎng)基時(shí)，可將pH調(diào)至3.5～6 之間，20～22℃是菌絲體生長(zhǎng)最適溫度。