陳素娥，劉亮亮，趙龍山，朱琳，*

（1.山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，山西晉中030619；2.沈陽藥科大學(xué)，遼寧沈陽110016）

葡萄的營養(yǎng)價(jià)值較高且在全世界范圍內(nèi)的種植面積和產(chǎn)量均位居前列，其果實(shí)中含有人體不可或缺的維生素、礦物質(zhì)、核黃素、硫胺素等[1]，具有生津消食、緩解疲勞、補(bǔ)血益氣、延年益壽的功效[2-3]。隨著人們對葡萄營養(yǎng)價(jià)值認(rèn)識(shí)的逐漸增多和對葡萄需求的日漸增大，葡萄中的農(nóng)藥殘留量也逐步被人們重視。文獻(xiàn)中報(bào)道的葡萄上的殘留農(nóng)藥主要有甲霜靈、多菌靈、吡蟲啉等[4]。這些農(nóng)藥在葡萄上的殘留時(shí)間較長且具有一定的毒性。人體食用葡萄后，葡萄上的殘留農(nóng)藥也同時(shí)被攝入人體內(nèi)，對人體造成一定的損害，因此有必要對葡萄上的農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測。

樣品前處理對于其含量測定至關(guān)重要。好的前處理方法操作簡便，試驗(yàn)試劑易獲取，且處理后的樣品溶液雜質(zhì)較少，對待測峰的影響小[5]。目前，農(nóng)藥殘留的前處理通常采用液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）、固相萃?。╯olid-phase extraction，SPE）和基質(zhì)固相分散萃?。╩atrix solid phase dispersion extraction，MSPDE）等，但這些方法存在有機(jī)試劑用量大，容易乳化，價(jià)格昂貴，提取效率低以及操作復(fù)雜，重現(xiàn)性較差等問題[6-8]。就提取方式而言，目前對果蔬中農(nóng)藥殘留的提取方法一般有浸泡法、超聲提取法、微波提取法、超臨界流體萃取等。其中超聲提取具有提取所需時(shí)間短，提取效率高的優(yōu)點(diǎn)[9-10]。

低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DESs） 由 Leicester 大學(xué)的Abbott 等首次提出，通常是由氫鍵受體（如季銨鹽等有機(jī)鹽）和氫鍵供體（如醇、羧酸、酰胺等）通過氫鍵橋聯(lián)作用連接而成的穩(wěn)定溶劑[11-13]。由于其綠色環(huán)保，環(huán)境友好，制備簡單的特點(diǎn)，DESs 在分析研究中得到了迅速發(fā)展[14-17]，如植物中的生物活性成分的提取[18-19]，重金屬的生物樣品的提取[20]等。而目前尚無太多應(yīng)用低共熔溶劑進(jìn)行果蔬中農(nóng)藥殘留提取的研究。本試驗(yàn)選擇葡萄皮作為樣品，低共熔溶劑作為提取劑，液液萃取作為提取方法，結(jié)合高效液相色譜法，對葡萄皮中的農(nóng)藥進(jìn)行了提取、測定和優(yōu)化。

1 儀器和試劑

1.1 儀器

Agilent LC 1100 液相色譜儀：美國Agilent 公司；AL104 電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ5200 超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；LC-400 低速離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；JP200-24 干式氮吹儀：上海旌派儀器有限公司；ACO-003 電磁式空氣泵：森森集團(tuán)股份有限公司；GM-0.33A 隔膜空氣泵：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LyoQuest-55 冷凍干燥機(jī)：西班牙泰事達(dá)。

1.2 試劑

GBW（E）082341 多菌靈、CW：LC-321 吡蟲啉：壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；甲霜靈：山東濰坊潤豐化工股份有限公司；甲醇、乙腈（色譜級(jí)）、鹽酸（分析級(jí)）：山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司；磷酸（分析級(jí)）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；二氯甲烷、石油醚、乙二醇（分析級(jí)）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；氫氧化鈉、分析級(jí)丙三醇、苯酚（分析級(jí)）：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；氯化膽堿（分析級(jí)，ChCl）：北京百靈威科技有限公司；葡萄糖（分析級(jí)）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；乳酸（分析級(jí)）：天津市博迪化工股份有限公司。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Venusil MP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測波長：280 nm 和210 nm，進(jìn)樣量：20 μL，流動(dòng)相：甲醇（A）-0.05% 磷酸水溶液（B），梯度洗脫條件：0～5 min，10～60（A），5 min～18 min，60～86（A）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密量取對照品溶液多菌靈（100 μg/mL）、吡蟲啉（100 μg/mL）一定體積，配制成 10 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密稱取甲霜靈對照品0.01 g 置于50 mL 容量瓶中，配制成200 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液均置于-20 ℃環(huán)境下密封保存。

2.3 加熱法制備低共熔溶劑

將氫受體和氫供體按照一定的摩爾比準(zhǔn)確稱量后，在一定溫度下（如表1）攪拌加熱約2 h～4 h，直至形成穩(wěn)定、均一、透亮的溶液，然后冷卻至（20±5）℃即得。具體條件見表1。

表1 加熱法制備低共熔溶劑Table 1 Preparation of eutectic solvent by heating

2.4 樣品溶液的制備

將從沈陽站附近中興超市中興店購買的葡萄剝皮，將葡萄皮攪碎后置于圓底燒瓶中，置于冷凍干燥機(jī)中凍干后（20±5）℃保存，用天平準(zhǔn)確稱量葡萄皮粉末約 0.1 g，加入 2 mL 提取劑（ChCl-丙三醇=1 ∶4/mol ∶mol），加入多菌靈、吡蟲啉、甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各100 μL，超聲提取30 min 后，在4 000 r/min 條件下離心5 min，取1 mL 上清液置于離心管中，加入1 mL 石油醚除雜，4 000 r/min 條件下離心5 min，取提取液層，用2 mL 二氯甲烷分2 次萃取提取液，合并二氯甲烷層，氮吹至干，0.5 mL 甲醇定容，過 0.45 μm 濾膜待測。

2.5 低共熔溶劑體系的選擇

按2.4 項(xiàng)下制備方法制備空白和加標(biāo)兩組樣品溶液，分別考察 ChCl-苯酚（1 ∶4/mol ∶mol）、ChCl-乳酸（1 ∶2/mol ∶mol）、ChCl-葡萄糖（1 ∶1/mol ∶mol）、ChCl-丙三醇（1 ∶4/mol ∶mol）提取劑對色譜峰形和相應(yīng)的影響。

2.6 中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化

前期研究發(fā)現(xiàn)，對多菌靈、吡蟲啉、甲霜靈的提取檢測影響比較顯著的3 個(gè)因素是：超聲時(shí)間（A）、提取劑的用量（B）和 pH 值（C），對這 3 個(gè)因素進(jìn)行 CCD 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，選用2.5 中對色譜峰形和響應(yīng)均較好的低共熔溶劑作為提取劑，進(jìn)行優(yōu)化。A、B、C 是獨(dú)立變量，3 個(gè)農(nóng)藥的總峰面積作為響應(yīng)變量，共19 個(gè)試驗(yàn)組別，設(shè)計(jì)如表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化組別Table 2 Experiment DES sign of response surface methodology

2.7 模型驗(yàn)證

按響應(yīng)面分析得到優(yōu)選提取工藝，平行3 次試驗(yàn)。按照2.4 項(xiàng)下樣品溶液制備方法制備樣品溶液，再按照2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算3 個(gè)農(nóng)藥成分的總峰面積。

2.8 最優(yōu)條件下溶劑體系的選擇

選擇不同的溶劑作為提取劑，如表3 所示，按2.4項(xiàng)下制備方法制備樣品溶液，在響應(yīng)面優(yōu)化下的最佳條件進(jìn)行試驗(yàn)，按照2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算3 個(gè)農(nóng)藥成分的總峰面積。

表3 最優(yōu)條件下溶劑體系的選擇Table 3 Selection of solvent system under optimal conditions

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜條件的優(yōu)化

檢測波長的選擇：通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，多菌靈和吡蟲啉在280 nm 處有較大吸收，而甲霜靈在210 nm左右有最大吸收，多菌靈和吡蟲啉雖在210 nm 處也有吸收，但由于210 nm 處末端吸收較多，雜質(zhì)峰較多，故選擇雙波長檢測。

流動(dòng)相的選擇：將標(biāo)準(zhǔn)溶液在流動(dòng)相為甲醇-水和乙腈-水的條件下分別進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)同樣的方法下選用乙腈-水時(shí)，多菌靈和吡蟲啉的峰間隔很小，達(dá)不到分離度的要求，經(jīng)過梯度的調(diào)整仍無法分離，故選擇甲醇-0.05%磷酸水溶液作為流動(dòng)相，在此條件下3 種農(nóng)藥達(dá)到很好的基線分離，且峰形較好，分離度達(dá)到1.5 以上。

梯度的選擇：在上述梯度條件下多菌靈在約7.1 min 處出峰，吡蟲啉在約8.9 min 處出峰，甲霜靈在約13.5 min 處出峰。經(jīng)過嘗試將吡蟲啉至甲霜靈處時(shí)間縮短或者將甲霜靈出峰時(shí)間后的時(shí)間截去，會(huì)出現(xiàn)甲霜靈分裂成幾個(gè)峰的現(xiàn)象，故仍選擇上述梯度條件進(jìn)行測定。

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證

本文的方法學(xué)驗(yàn)證主要由線性、回收率組成。

3.2.1 線性范圍

取制備好的多菌靈、吡蟲啉儲(chǔ)備液，分別配制成0.1、0.5、1、2、5、10 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液；取制備好的甲霜靈儲(chǔ)備液，配制成 0.5、1、5、10、20、50 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。每種農(nóng)藥的每個(gè)濃度配制3 份溶液進(jìn)行測定，取峰面積的平均值，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以峰面積的平均值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，分別做出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，如表4 所示。3 種農(nóng)藥在考察范圍內(nèi)濃度與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)回歸數(shù)據(jù)Table 4 The linear range of pestici DESs

3.2.2 回收率測定

精密稱取待測物，隨機(jī)分為3 組，每組分別精密加入低、中、高濃度的對照品溶液，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜方法測定多菌靈、吡蟲啉和甲霜靈3 種農(nóng)藥成分的含量，計(jì)算加樣回收率。不同提取劑提取后的加樣回收率結(jié)果如表5 所示。

表5 回收率測定結(jié)果Table 5 The recovery of pestici DESs

由表5 可知，各物質(zhì)的加樣回收率在60%～112%之間，當(dāng)溶劑為 ChCl-甘油（1∶4/mol∶mol）和 ChCl-乙二醇（1∶2/mol∶mol）等比例混合時(shí)，3 種農(nóng)藥成分的回收率最高。

3.3 低共熔溶劑體系的選擇

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在 ChCl-苯酚（1∶4/mol∶mol）、ChCl-乳酸（1∶2/mol∶mol）、ChCl-葡萄糖（1∶1/mol∶mol）、ChCl-丙三醇（1∶4/mol∶mol）低共熔溶劑提取葡萄皮樣品的色譜圖中，ChCl 和醇類物質(zhì)組成的低共熔溶劑提取的峰的峰形和響應(yīng)度均較好，故選擇ChCl-丙三醇（1∶4/mol∶mol）作為提取劑進(jìn)行條件優(yōu)化。

3.4 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

前期研究表明多菌靈、吡蟲啉、甲霜靈的提取檢測影響比較顯著的3 個(gè)因素是：超聲時(shí)間、提取劑的用量和pH 值，對這3 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果如表6。

表6 方差統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Table 6 The results of variance analysis

由表 6 可知，模型高度顯著（F=7.77，P ＜ 0.05），失擬項(xiàng)很?。‵=4.73），可以看出這是有效的模型建立，因此試驗(yàn)方法可靠，可以用該模型對葡萄皮的提取率進(jìn)行預(yù)測。

為了更直觀的觀察各因素間的相互作用，以3 種農(nóng)藥總峰面積和評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行設(shè)計(jì)，利用Design-Expert 軟件對結(jié)果做出響應(yīng)曲面圖，結(jié)果見圖1。

圖1 葡萄皮中3 種農(nóng)藥總峰面積和評價(jià)指標(biāo)的響應(yīng)面分析圖Fig.1 Response surface plots of the model for total peak area of carbendazim，imidacloprid and metalaxyl in grape skin samples

從圖1 可知，最優(yōu)的提取條件為超聲時(shí)間30 min、DESs 用量為 2 mL、pH=5。

3.5 模型驗(yàn)證結(jié)果

為驗(yàn)證模型，在最優(yōu)條件下進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，3 次試驗(yàn)的總峰面積結(jié)果為：2 325.4、2 706、2 730.8。這與預(yù)測范圍2 211.53 至4 367.75 相符合，這說明了該模型的建立是合理的。預(yù)測結(jié)果與實(shí)際值的比較如圖2，殘差法線圖如圖3。

3.6 最優(yōu)條件下低共熔溶劑體系的選擇

圖2 預(yù)測值和實(shí)際值的比較Fig.2 Comparison of predicted and actual values

圖3 殘差法線圖Fig.3 Normal plot of residuals

通過考察 ChCl-丙三醇（1∶4/mol∶mol）、ChCl-乙二醇（1∶2/mol∶mol）、ChCl-1，4 丁二醇（1∶4/mol∶mol）、ChCl-丙二醇（1∶3/mol∶mol）、ChCl-丙三醇（1∶4/mol∶mol）+ChCl-乙二醇 （1∶2/mol∶mol）、ChCl-丙三醇 （1∶4/mol∶mol）+ChCl-1，4 丁二醇（1∶4/mol∶mol）、甲醇、乙腈 8 種低共熔溶劑體系發(fā)現(xiàn)，在相同條件下，ChCl-乙二醇（1∶2/mol∶mol）和 ChCl-丙三醇（1∶4/mol∶mol）等體積混合時(shí)對多菌靈、吡蟲啉、甲霜靈3 種農(nóng)藥的提取效率最高（回收率結(jié)果見表5），且分離度和峰形均較好。典型色譜圖如圖4。

4 結(jié)論

本研究首次建立了超聲輔助低共熔溶劑結(jié)合液液萃取技術(shù)提取葡萄皮中甲霜靈、吡蟲啉、多菌靈3 種農(nóng)藥的方法。該方法簡單，生產(chǎn)成本低、提取速度快、效率高，且綠色環(huán)保，為果蔬及其他農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留的提取提供了新方法。同時(shí)DESs 作為一種新型綠色萃取溶劑，具有合成工藝簡單、生物降解性好、毒性小、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，有望成為更多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。