高薇，張?zhí)m威，2，*

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150000；2.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266000）

西藏開菲爾粒是我國西藏地區(qū)珍貴的天然發(fā)酵劑，它具有在牛奶中增殖的能力，使用其發(fā)酵制作的乳飲料稱作西藏開菲爾發(fā)酵乳[1-2]。研究表明，西藏開菲爾發(fā)酵乳是一種具有潛力的功能性乳制品，西藏開菲爾粒及其發(fā)酵乳中的微生物具有多種保健功能[3-5]。

風(fēng)味是決定發(fā)酵乳制品消費(fèi)者接受度的重要屬性，產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的能力是評價(jià)發(fā)酵劑應(yīng)用于發(fā)酵乳制品生產(chǎn)的基本參數(shù)[6-7]。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）是目前應(yīng)用最廣泛的風(fēng)味分析技術(shù)，其在揮發(fā)性化合物的分離和鑒定方面具有優(yōu)異性能[8]，該技術(shù)已成功應(yīng)用于多種發(fā)酵乳制品中揮發(fā)性化合物的檢測[9-11]。香氣活力值（odor activity value，OAV）是指成分在體系中的絕對濃度與其感覺閾值的比值，通過比較各成分的OAV 差異，可以評價(jià)其對食品風(fēng)味貢獻(xiàn)度的差異。OAV>1 的化合物被認(rèn)為是食品中的香氣貢獻(xiàn)成分，該值的大小與其香氣貢獻(xiàn)成正比[12-13]。

開菲爾粒中細(xì)菌和酵母菌的共同作用使得開菲爾發(fā)酵乳具有獨(dú)特的酸醇混合風(fēng)味[7]。目前，關(guān)于西藏開菲爾發(fā)酵乳揮發(fā)性風(fēng)味特性研究報(bào)道較少。本研究采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對兩種不同地理來源西藏開菲爾粒的發(fā)酵乳中揮發(fā)性成分構(gòu)成進(jìn)行分析，比較了兩種西藏開菲爾粒的產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)能力差異，并首次結(jié)合香氣活力值計(jì)算確定了兩種西藏開菲爾發(fā)酵乳中的香氣貢獻(xiàn)成分，本研究意義在于為西藏開菲爾產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

西藏開菲爾粒A 和B 分別采集自西藏地區(qū)兩個(gè)地理位置不同的縣；巴氏殺菌全脂牛乳：完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司；C7-C30 正構(gòu)烷烴（色譜純）、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取頭：美國Supelco 公司；7890A-5975C 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 西藏開菲爾發(fā)酵乳的制備

取低溫保存的西藏開菲爾粒接種于巴氏殺菌全脂牛乳中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)活化3 次。之后，分別接種活化好的每種西藏開菲爾粒50 g 于1 L的巴氏殺菌全脂牛乳中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待發(fā)酵乳pH 值降至4.5 時(shí)取出用于后續(xù)分析。

1.2.2 揮發(fā)性化合物的提取

使用頂空固相微萃取的方法提取發(fā)酵乳中的揮發(fā)性化合物。取8 g 發(fā)酵乳于15 mL 頂空瓶中，加入2 g氯化鈉，置于60 ℃孵育20 min，之后插入固相微萃取頭，在60 ℃萃取30 min。萃取完成后拔出萃取頭，將其插入氣相色譜進(jìn)樣口在250 ℃解吸5 min，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。以1，2-二氯苯為內(nèi)標(biāo)物。

1.2.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

色譜柱：DB-WAX 毛細(xì)管柱（30 m × 0.32 mm ×0.25 μm）。

升溫程序：40 ℃，保持 3 min，以 4 ℃/min 的速度升溫至180 ℃，保持0 min，再以10 ℃/min 的速度升溫至200 ℃，保持20 min。載氣為氦氣，流速為1.1 mL/min。

質(zhì)譜條件：EI 離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度 230 ℃，四級桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍30 m/z～500 m/z。

1.3 定性定量分析

化合物的定性鑒定通過與NIST08 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖檢索比對并利用C7-C30 正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間計(jì)算各化合物的Kovats 保留指數(shù)RI 值兩種方法結(jié)合確定。化合物的定量分析采用內(nèi)標(biāo)法。RI 值根據(jù)如下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：t'（i）為樣本中待分析化合物的保留時(shí)間；n和n＋1 分別為待分析化合物留出前、后相鄰的正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)；t'（n）和t'（n＋1）分別為碳數(shù)為n 和n＋1的正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間。

1.4 香氣活力值計(jì)算

香氣活力值（OAV）的計(jì)算公式如下[14]：

式中：ρ 為樣本中化合物的質(zhì)量濃度，mg/kg；T 為該化合物在水中的氣味閾值，mg/kg。

2 結(jié)果與分析

兩種發(fā)酵乳中共鑒定出揮發(fā)性化合物30 種，包括醇類（5 種）、酯類（7 種）、酸類（12 種）、酮類（5 種）和芳香族類（1 種），結(jié)果見表1。發(fā)酵乳A 中檢測到揮發(fā)性化合物26 種，B 中檢測到揮發(fā)性化合物28 種，B 中的揮發(fā)性化合物總量高于A。

圖1 為西藏開菲爾發(fā)酵乳中揮發(fā)性成分總離子流圖，圖中色譜峰分布均勻且分離效果好。圖2 為西藏開菲爾發(fā)酵乳中揮發(fā)性化合物分類餅狀圖，圖中兩種發(fā)酵乳中各類揮發(fā)性化合物比例不同，酸類和醇類在兩者中都占優(yōu)勢，兩類的相對豐度總和在各發(fā)酵乳中都達(dá)80%以上。

2.1 醇類化合物

本研究中，醇類在兩種西藏開菲爾發(fā)酵乳中比例和含量均較高，A 中相對豐度達(dá)51.34%（15.39 mg/kg），B 中相對豐度達(dá)45.27%（15.31 mg/kg），兩種發(fā)酵乳中醇類總量差異不大，表明兩種西藏開菲爾粒的產(chǎn)醇能力相當(dāng)。

表1 西藏開菲爾發(fā)酵乳中揮發(fā)性化合物GC-MS 及OAV 分析結(jié)果Table 1 Results of GC-MS and OAV analyses for volatile compounds in Tibetan kefir miks

圖1 西藏開菲爾發(fā)酵乳中揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatiles in Tibetan kefir miks

圖2 西藏開菲爾發(fā)酵乳中揮發(fā)性化合物分類餅狀圖Fig.2 Pie chart of classified volatile compounds in Tibetan kefir milks

由表1 可知，檢出的5 種醇類化合物中4 種為兩種發(fā)酵乳共有。乙醇的比例和含量在兩種發(fā)酵乳中均為醇類中最高。兩種發(fā)酵乳的醇類中OAV>1 的香氣貢獻(xiàn)成分都為乙醇、異戊醇和苯乙醇，其中苯乙醇OAV>10，在兩種發(fā)酵乳中都是重要香氣貢獻(xiàn)成分。乙醇是酵母菌無氧代謝和具有乙醇脫氫酶活性的異型發(fā)酵乳酸菌的主要代謝產(chǎn)物[16]，它是使得開菲爾被稱為“乳中香檳”的原因之一[17]。異戊醇和苯乙醇是兩種高級醇，異戊醇具有“鮮奶酪”、“醇”和“果香”的風(fēng)味[18-19]，苯乙醇具有清甜的“玫瑰花香”[20]，兩者在酸乳制品中很少檢出，由于本研究使用的發(fā)酵劑西藏開菲爾粒中不僅包含乳酸菌等細(xì)菌，還包含酵母菌，它們共同作用產(chǎn)生的這兩種醇可能賦予開菲爾發(fā)酵乳以酸乳不具備的特色風(fēng)味。

2.2 酯類化合物

酯類化合物源于發(fā)酵乳中酸類和醇類的酯化作用，在發(fā)酵乳制品中通常濃度和比例不高，但閾值較低，且普遍具有果香味，使得其成為發(fā)酵乳制品中重要的風(fēng)味物質(zhì)之一[21-22]。本研究中，兩種西藏開菲爾發(fā)酵乳中酯類的比例和含量不高，A 中相對豐度為4.65%（1.39 mg/kg），B 中相對豐度為 4.82 %（1.63 mg/kg），B中酯類總量高于A，表明西藏開菲爾粒B 的產(chǎn)酯能力強(qiáng)于粒A。由表1 可知，檢出的7 種酯類化合物中4 種為兩種發(fā)酵乳共有。乙酸苯乙酯在發(fā)酵乳A 中特有，乙酸異戊酯和己酸乙酯在B 中特有。乙酯類是兩種發(fā)酵乳中的主要酯類，乙酸乙酯在兩種發(fā)酵乳中的比例和含量均為酯類中最高。文獻(xiàn)查詢到的6 種酯類化合物的閾值都很低，對于兩種發(fā)酵乳，酯類化合物的總OAV 值遠(yuǎn)高于其他4 類化合物，表明酯類是兩種發(fā)酵乳中最重要的香氣貢獻(xiàn)化合物。發(fā)酵乳A 中OAV>1的酯類香氣貢獻(xiàn)成分有4 種，其中OAV>10 的重要香氣貢獻(xiàn)成分為乙酸乙酯和辛酸乙酯；發(fā)酵乳B 中OAV>1 的酯類香氣貢獻(xiàn)成分有5 種，其中OAV>10 的重要香氣貢獻(xiàn)成分為乙酸異戊酯、己酸乙酯和辛酸乙酯。在兩種發(fā)酵乳的所有酯類中，辛酸乙酯的OAV 均遠(yuǎn)大于其他酯類，是最重要的香氣貢獻(xiàn)成分，同時(shí)，發(fā)酵乳B 中辛酸乙酯的OAV 遠(yuǎn)大于A，表明它在B 中的香氣貢獻(xiàn)遠(yuǎn)大于A。辛酸乙酯具有令人愉快的“花果”香味[20]，結(jié)合其OAV 分析和香氣特征，推測發(fā)酵乳B 的“花果”香味較 A 更為濃郁。

2.3 酸類化合物

酸乳制品中酸類化合物主要由脂肪分解作用和細(xì)菌（主要為乳酸菌）發(fā)酵作用產(chǎn)生[21]。本研究中，兩種西藏開菲爾發(fā)酵乳中的酸類比例和含量均較高，A 中相對豐度達(dá) 43.21 %（12.95 mg/kg），B 中相對豐度達(dá)47.67%（16.12 mg/kg），B 中酸類總量高于 A，表明西藏開菲爾粒B 的產(chǎn)酸能力強(qiáng)于粒A。兩種發(fā)酵乳中檢出的酸類種類相同，中短鏈脂肪酸為主要酸類，辛酸在兩種發(fā)酵乳中的比例和含量均為酸類中最高。文獻(xiàn)查詢到了8 種酸類化合物的閾值，兩種發(fā)酵乳的酸類中OAV>1 的香氣貢獻(xiàn)成分都為己酸、辛酸、癸酸和十二酸，發(fā)酵乳A 中OAV>10 的重要香氣貢獻(xiàn)成分為己酸，發(fā)酵乳B 中OAV>10 的重要香氣貢獻(xiàn)成分為己酸和辛酸。己酸具有“干酪樣”氣味，辛酸具有微弱的“水果酸味”，癸酸具有“油酸敗味”，十二酸具有“月桂油”氣味[20]。雖然酸類在兩種發(fā)酵乳中含量很高，但它們的閾值較高，兩種發(fā)酵乳中酸類的總OAV 遠(yuǎn)低于酯類，表明酸類對兩種發(fā)酵乳整體風(fēng)味構(gòu)成的作用是輔助性的，主要賦予其“干酪樣”和“酸”的風(fēng)味特性。

2.4 酮類化合物

酮類化合物源于不飽和脂肪酸的氧化、熱降解、氨基酸降解作用以及微生物代謝[23]。本研究中，兩種西藏開菲爾發(fā)酵乳中酮類的比例和含量均較低，其在A中相對豐度僅為0.80%（0.24 mg/kg），在B 中相對豐度為1.45%（0.49 mg/kg），B 中酮類總量高于A，表明西藏開菲爾粒B 的產(chǎn)酮能力強(qiáng)于粒A。由表1 可知，檢出的5 種酮類化合物中4 種為兩種發(fā)酵乳共有，乙偶姻在兩種發(fā)酵乳中的比例和含量均為酮類中最高。本研究檢測到的5 種酮類化合物的閾值較低，但因其含量也較低，兩種發(fā)酵乳中的酮類OAV 都小于10，且總OAV 都低于酯類、醇類和酸類，表明其香氣貢獻(xiàn)低于酯類、醇類和酸類。發(fā)酵乳A 中OAV>1 的酮類香氣貢獻(xiàn)成分有3 種，B 中OAV>1 的酮類香氣貢獻(xiàn)成分有4種。乙偶姻、2-壬酮和2-十一烷酮是兩種發(fā)酵乳共有的酮類香氣貢獻(xiàn)成分。乙偶姻具有典型的“奶油”香味，2-壬酮具有“果香”、“甜香”及“乳酪”香味，2-十一烷酮具有“果香”和“酮香”香味[20]。發(fā)酵乳B 中酮類的總OAV 高于A，結(jié)合其香氣特征，推測它們賦予B 的“果香”和“奶油”香味較A 更為強(qiáng)烈。

2.5 芳香族類化合物

本研究中僅在西藏開菲爾發(fā)酵乳B 中檢測到了1種芳香族類化合物苯乙烯，它在B 中的比例和含量都很低，相對豐度僅為0.80%（0.27 mg/kg）。苯乙烯的OAV 大于10，是發(fā)酵乳B 中的重要香氣貢獻(xiàn)成分，具有“芳香”、“香脂香”及接近“花香”的氣味[20]。

3 結(jié)論

采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)與香氣活力值的計(jì)算確定了兩種不同地理來源西藏開菲爾粒的發(fā)酵乳中揮發(fā)性成分構(gòu)成及香氣貢獻(xiàn)成分。結(jié)果共鑒定出揮發(fā)性化合物30 種，酸類和醇類在兩種發(fā)酵乳中占優(yōu)勢。兩種西藏開菲爾粒的產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)能力存在差異，西藏開菲爾發(fā)酵乳B 中鑒定出的揮發(fā)性化合物種類和總含量均高于A，且B 中除醇類總量略低于A 外，酯類、酸類、酮類和芳香族類總量均高于A。OAV 分析表明酯類是兩種發(fā)酵乳中最重要的香氣貢獻(xiàn)化合物，辛酸乙酯是兩種發(fā)酵乳中香氣貢獻(xiàn)最高的風(fēng)味物質(zhì)。不同類別化合物對兩種發(fā)酵乳的總香氣貢獻(xiàn)存在差異，醇類對發(fā)酵乳A 的總香氣貢獻(xiàn)高于B，酯類、酸類和酮類對發(fā)酵乳B 的總香氣貢獻(xiàn)高于A。