董蘊(yùn)，王強(qiáng)，仇港，楊成聰，羅晶晶，馬磊，郭壯，趙慧君，*

（1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北襄陽441053；2.棗陽市食品藥品監(jiān)督管理局，湖北襄陽441021）

紅曲，又稱紅米、紅米曲，能夠治療高血壓，并且能夠調(diào)節(jié)人體血脂[1-2]。紅曲黃酒是將糯米作為原料，將紅曲作為糖化發(fā)酵劑釀造而成的[3]，并且黃酒的酒精度比較低，口味清爽適口，富含極高的營養(yǎng)價值，同時黃酒還具有抗氧化抗衰老、降血壓降膽固醇和調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝的功能，因此適當(dāng)?shù)娘嬘糜欣谌梭w的健康[4-5]。乳酸菌是指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱[6]，它是一種存在與人體內(nèi)的益生菌。而且乳酸菌能夠控制人體內(nèi)毒素水平，保護(hù)肝臟并增強(qiáng)肝臟的解毒、排毒功能[7-8]；具有免疫調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)人體免疫力和抵抗力[9-10]；能夠使腸道菌群的構(gòu)成發(fā)生有益變化，改善人體胃腸道功能，恢復(fù)人體腸道內(nèi)菌群平衡，形成抗菌生物屏障，維護(hù)人體健康[11-12]；且具有抗腫瘤、預(yù)防癌癥的作用[13]。

本試驗(yàn)主要研究乳酸菌對紅曲黃酒的總酸、可溶性固形物、有機(jī)酸含量和滋味品質(zhì)的影響。即在紅曲黃酒樣品中添加不同的乳酸菌，發(fā)酵完成后采用酸堿直接滴定法、折光儀法、高效液相—示差折光法和電子舌技術(shù)并結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，研究紅曲黃酒樣品的理化性質(zhì)、有機(jī)酸和各滋味指標(biāo)的變化規(guī)律，分析添加乳酸菌對紅曲黃酒的整體品質(zhì)。本研究的目的是研究米酒來源乳酸菌對紅曲黃酒的品質(zhì)影響，探討其在紅曲黃酒中應(yīng)用的可行性，以其為后續(xù)紅曲黃酒產(chǎn)品的開發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

米酒：湖北米婆婆生物科技有限公司；紅曲：麗水力克生物科技有限公司；糯米：襄陽市鑫源超市。

內(nèi)部溶液、參比溶液、陰離子溶液、陽離子溶液：日本Insent 公司；乙腈（色譜純）、磷酸二氫鉀（分析純）、磷酸（分析純）、硫酸銅（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、次甲基（分析純）、葡萄糖（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、氯化鈉（分析純）、碳酸鈣（分析純）：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MRS 培養(yǎng)基、Luria-Bertani 培養(yǎng)基、石蕊牛乳培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；AxyPrep PCR 清潔試劑盒：康寧生命科學(xué)有限公司；dNTP Mix、2×PCR mix、pMD 18-T 載體、rTaq：寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司（takara 中國）；溶菌酶、蛋白酶K：上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20ADXR 高效液相色譜儀：日本島津公司；SA 402B 電子舌：日本 Insent 公司；Abbemat 350 全自動折光儀：奧地利安東帕中國有限公司；vetiri 梯度基因擴(kuò)增儀：美國AB 公司；BX53 全功能生物顯微鏡：美國奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 米酒樣品的采集

從湖北省孝感市采集4 份米酒樣品，裝入采樣箱中快速的帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品處理。

1.3.2 米酒中乳酸菌的分離鑒定

將米酒樣品各吸取1 mL 上清后加入石蕊牛乳培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)箱中富集24 h，取富集液0.5 mL 于0.85%的生理鹽水中進(jìn)行倍比稀釋，取稀釋10-5倍和10-6倍的溶液在含有碳酸鈣的MRS 固體培養(yǎng)基上涂布，并在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，挑取有透明圈的單菌落純化3 次后用30%的甘油將菌落凍存于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用十六烷基三甲基溴化銨（cetrimonium bromide，CTAB） 法提取菌株的 DNA 后用引物 27F 和1495R 擴(kuò)增菌株的16S rDNA，擴(kuò)增體系為：10x 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）緩沖液2.5μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，27F 0.5 μL ，1495R 0.5 μL，rTaq 0.5 μL，DNA 模板 2 μL，ddH2O 補(bǔ)充至 25 μL；擴(kuò)增條件為：94 ℃，4 min；94 ℃，45 s；55 ℃，45 s；72 ℃，1 min 30 s；72 ℃，10 min；30 個循環(huán)。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物后清潔試劑盒進(jìn)行清潔；隨后將PCR 清潔產(chǎn)物進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化和驗(yàn)證，將陽性克隆送往測序公司進(jìn)行測序。將測序所得結(jié)果進(jìn)行同源性分析后，應(yīng)用Mega7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 紅曲黃酒的制作

糯米經(jīng)浸米、蒸煮、晾曬后添加80 g 紅曲，295 mL漿水和390 mL 純凈水，同時將在米酒中分離出的9 株乳酸菌分別加入釀造罐中，對照組不添加乳酸菌。黃酒放入28 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d 后置于18 ℃中后發(fā)酵14 d。將發(fā)酵好的紅曲黃酒從培養(yǎng)箱中取出后，取300 g 樣品于離心機(jī) 4 ℃ 3 000 r/min 離心 10 min 取上清備用。

1.3.4 紅曲黃酒中可溶性固形物與總酸的影響測定

1）可溶性固形物：將紅曲黃酒滴5 滴于全自動折光儀的鏡面，測定紅曲黃酒的可溶性固形物，取3 個平行的平均值為最后測量值。

2）總酸：根據(jù)國標(biāo) GB/T 13662-2018《黃酒》測總酸的步驟，即將10 mL 樣品置于150 mL 燒杯中，并加無二氧化碳的水50 mL，置于磁力攪拌器上，攪拌時用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液滴定，直至pH8.20 為終點(diǎn)。分別記錄數(shù)據(jù)，同時做空白試驗(yàn)。

1.3.5 紅曲黃酒滋味品質(zhì)的測定

按照王玉榮[14]的方法，將紅曲黃酒用電子舌來測定酸味、咸味、苦味、澀味和鮮味5 個基本味及苦味、澀味、鮮味的3 個回味。將在陰離子或陽離子中洗滌后的傳感器在參比溶液中浸泡30 s，得到參比溶液電勢Vr；再置于待測樣品中浸泡30 s，得到樣品溶液電勢Vs，則可通過不同傳感器Vs-Vr的電勢差值評價鮮味、苦味、澀味、咸味和酸味的基本值；洗滌3 s 后與參比溶液中浸泡 30 s，得到電勢 Vr’，通過 Vr’-Vr的電勢差檢測苦味、澀味和鮮味的回味。每個樣品重復(fù)測4 次，選后3 次的測量數(shù)據(jù)作為本研究分析的原始數(shù)據(jù)。

1.3.6 紅曲黃酒有機(jī)酸的測定

根據(jù)郭瑛[15]的方法測定紅曲黃酒中有機(jī)酸的含量。其中標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：稱取琥珀酸1.5 g（加熱）、酒石酸 0.75 g、蘋果酸 0.3 g、乳酸 1.5 g、草酸 0.15 g，然后用超純水溶解并定容至50 mL，配置成混合標(biāo)準(zhǔn)母液。分別吸取 0.1、0.2、0.5、1.0、1.4 mL 的母液并用超純水定容至 10 mL 再加 200 μL 的磷酸混樣做標(biāo)曲，經(jīng) 0.22 μL濾頭過濾后使用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定。將紅曲黃酒樣品各取 2 mL 加 200 μL 磷酸定容到 10 mL，再用 0.22 μL 濾膜過濾后置于2 mL 進(jìn)樣品中使用HPLC 分析。

測定條件為檢測器：紫外吸收檢測器；流動相：采用0.01 mol/L KH2PO4（pH2.9）；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；壓力：22.0 MPa；進(jìn)樣體積：20 μL；分離柱型號：C18 Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6×250 mm）5 μm；檢測波長：214 nm。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

本研究使用主成分分析（principal component anal ysis，PCA）對紅曲黃酒滋味品質(zhì)整體結(jié)構(gòu)的差異進(jìn)行分析；并使用SAS9.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用Origin2017軟件繪圖，同時使用Mega7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 米酒曲中乳酸菌的分離鑒定

從4 個米酒曲樣品中共分離出了9 株疑似乳酸菌菌株，所有菌株的過氧化氫試驗(yàn)均為陰性，革蘭氏染色均為陽性，且形態(tài)均為球狀。在菌株分離的基礎(chǔ)上，本研究對疑似乳酸菌菌株進(jìn)行了基因組DNA 提取，并進(jìn)一步對其16S rDNA 進(jìn)行了PCR 擴(kuò)增，將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，如圖1所示。

圖1 乳酸菌16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of PCR amplified product of lactic acid bacteria 16S rDNA

由圖1 可知，9 個泳道均在1 500 bp 左右的位置出現(xiàn)了一條明亮的條帶，同時所有泳道并未出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，因而所有菌株的16S rDNA 片段PCR 擴(kuò)增較為成功，將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行清潔、連接和建克隆后，送往測序公司進(jìn)行測序，將反饋后的序列結(jié)果進(jìn)行Blast 分析，得到表1 所示結(jié)果。

由表1 可知，9 株乳酸菌菌株與其對應(yīng)的模式菌株的序列同源性均達(dá)在99%以上，菌株IMAU50214、IMAU50215、IMAU50216 和 IMAU50218 被 鑒 定 為Weissella cibaria（食竇魏斯氏菌），IMAU50381 和I MAU50382 被鑒定為Weissella confusa（融合魏斯菌），IMAU50387、IMAU50399 和 IMAU50400 被鑒定為戊糖片球菌。同時，將菌株在同源性分析的基礎(chǔ)上，使用Mega7.0 構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2 所示。

表1 乳酸菌16S rDNA 序列分析結(jié)果Table 1 Results of 16S rDNA sequence analysis of lactic acid bacteria

圖2 基于米酒中乳酸菌16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on lactic acid bacteria 16S rDNA sequence in rice wine

由圖2 可知，菌株 IMAU50214、IMAU50215、IMAU50216 和 IMAU50218 與 Weissella cibaria LMG 17699T（AJ295989）形成了第一個類群，鑒定為食竇魏斯氏菌；菌株 IMAU50387、IMAU50400 和 IMAU50399 與Pediococcus pentosaceus DSM20336T（AJ305321）形成了第二個類群，鑒定為戊糖片球菌；菌株IMAU50381和 IMAU50382 與 WeissellaconfusaJCM1093（AB023241）形成了第三個類群，鑒定為融合魏氏菌。同時結(jié)合表1發(fā)現(xiàn)因此該鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性較高。

2.2 不同乳酸菌菌株制備紅曲黃酒總酸與可溶性固形物的分析

紅曲黃酒的可溶性固形物主要是黃酒中的糖類物質(zhì)，根據(jù)紅曲黃酒所測得可溶性固形物和總酸的指標(biāo)進(jìn)行評價，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 紅曲黃酒總酸和可溶性固形物箱型圖Fig.3 Box diagram of total acid and soluble solids in monascus yellow rice wine

由圖3 可知，較對照組，添加乳酸菌發(fā)酵的紅曲黃酒的可溶性固形物和總酸有著顯著的差異。添加乳酸菌發(fā)酵的紅曲黃酒的可溶性固形物的含量顯著高于對照組，總酸的含量低于對照組。并且，添加乳酸菌發(fā)酵的紅曲黃酒的可溶性固形物含量變化幅度不大，而總酸含量變化幅度較大。

2.3 乳酸菌對紅曲黃酒有機(jī)酸的影響

本研究使用HPLC 對混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行分析，分析結(jié)果如圖4 所示。

由圖4 分析可知，較對照組而言，添加乳酸菌W.confuse IMAU50381 和 W.confuse IMAU50382 發(fā)酵的紅曲黃酒中，蘋果酸經(jīng)過“二次發(fā)酵”全部轉(zhuǎn)化為乳酸，且菌株IMAU50381 和IMAU50382 均為（融合魏氏菌）； 添 加 乳 酸 菌 IMAU50387、IMAU50399 和 IMAU50400 發(fā)酵的紅曲黃酒中蘋果酸的含量增加，同時添加菌株IMAU50387 和IMAU50399 發(fā)酵的紅曲黃酒乙酸降低，且這3 株菌均為Pediococcus pentosaceus（戊糖片球菌）。而添加乳酸菌的IMAU50215 發(fā)酵的紅曲黃酒中，琥珀酸的含量顯著增加，同時乙酸的含量減少。在添加IMAU50214 發(fā)酵的紅曲黃酒中檸檬酸含量減少同時蘋果酸含量為零，且樣品總體有機(jī)酸含量較對照組而言減少。

2.4 乳酸菌對紅曲黃酒滋味的影響

本研究進(jìn)一步對發(fā)酵紅曲黃酒的各滋味進(jìn)行相對強(qiáng)度分析，可得到結(jié)果如圖5 所示。

圖5 紅曲黃酒各滋味指標(biāo)相對強(qiáng)度箱型圖Fig.5 The relative strength of different flavor indexes of red koji rice wine box

經(jīng)圖5 分析可知，與對照相比，添加乳酸菌發(fā)酵的紅曲黃酒在酸味、苦味、后味B（苦味的回味）和鮮味4個滋味指標(biāo)上顯著降低；但添加乳酸菌發(fā)酵的紅曲黃酒在咸味上上升；同時，紅曲黃酒對澀味、后味A（澀味的回味）和豐度（鮮味的回味）影響不顯著。

2.5 乳酸菌對紅曲黃酒品質(zhì)整體結(jié)構(gòu)的差異性分析

主成分分析（principal component anaiysis，PCA）也稱主分量分析，是識別算法中最基本的多元統(tǒng)計(jì)方法，同時能夠利用降維的思想，將多指標(biāo)轉(zhuǎn)變?yōu)樯贁?shù)綜合指標(biāo)[16]。本研究在使用電子舌分析添加乳酸菌發(fā)酵的紅曲黃酒滋味品質(zhì)的基礎(chǔ)上，使用PCA 對紅曲黃酒的品質(zhì)進(jìn)行了分析。經(jīng)PCA 分析發(fā)現(xiàn)，信息主要集中在前3 個主成分，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為90.44%，其中第一主成分和第二主成分的貢獻(xiàn)率分別為31.88%和28.44%。同時基于主成分分析的添加乳酸菌發(fā)酵的紅曲黃酒因子載荷圖與因子得分圖分別如圖6 和圖7 所示。

圖6 基于紅曲黃酒品質(zhì)主成分分析的因子載荷圖Fig.6 Factor loading diagram based on principal component analysis of red koji rice wine quality

由圖6 可知，第一主成分主要由鮮味、豐度（鮮味的回味）和苦味3 個指標(biāo)構(gòu)成，第二主成分主要由澀味、咸味和后味A（澀味的回味）3 個指標(biāo)構(gòu)成。且澀味和苦味分布在第一象限，后味A（澀味的回味）分布在第二象限，咸味分布在第三象限，鮮味和豐度（鮮味的回味）分布在第四象限。

圖7 基于紅曲黃酒品質(zhì)主成分分析的因子得分圖Fig.7 Factor score diagram based on principal component analysis of monascus rice wine quality

由圖7 可知，不添加乳酸菌發(fā)酵的紅曲黃酒即對照組的空間排布整體在第四象限，添加乳酸菌菌株IMAU50381 和IMAU50382 發(fā)酵的紅曲黃酒分布在第一象限，因此其澀味和苦味的滋味指標(biāo)較高，且這兩株菌均為Weissella confuse；添加乳酸菌菌株I MAU50214、IMAU50215 和 IMAU50216 發(fā)酵的紅曲黃酒分布在第四象限，因此其鮮味和豐度（鮮味的回味） 的滋味指標(biāo)較高，且這3 株菌均為Weissella cibaria；添加乳酸菌菌株 IMAU50387、IMAU50400 和IMAU50399 發(fā)酵的紅曲黃酒分布在第三和第四象限，因此其咸味的滋味指標(biāo)較高，且這3 株菌均為Pediococcus pentosaceus。因此可以發(fā)現(xiàn)同種乳酸菌發(fā)酵的紅曲黃酒呈現(xiàn)出了明顯的聚類趨勢，且不同種類的乳酸菌發(fā)酵的紅曲黃酒的各滋味品質(zhì)各不相同，但是相同種類的乳酸菌發(fā)酵紅曲黃酒樣品的品質(zhì)有相似的影響。

3 結(jié)論

本研究從米酒樣品中分離出了9 株乳酸菌，其中菌株 IMAU50214、IMAU50215、IMAU50216 和 IMAU50218鑒定為 Weissella cibaria；菌株 IMAU50387、IMAU50400和IMAU50399 鑒定為Pediococcus pentosaceus；菌株IMAU50381 和 IMAU50382 鑒定為 Weissella confuse。隨后用這9 株乳酸菌發(fā)酵紅曲黃酒，并將紅曲黃酒進(jìn)行分析，結(jié)果表明：添加乳酸菌發(fā)酵的紅曲黃酒的可溶性固形物的含量顯著高于對照組，總酸的含量低于對照組，并經(jīng)PCA 分析可知相同種類的乳酸菌發(fā)酵紅曲黃酒的品質(zhì)有相似的影響。