副干酪乳桿菌VL8胞外多糖對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7免疫激活作用研究

李琪，杜佳峰，高潔，劉曉宇，王向紅，桑亞新

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001）

巨噬細(xì)胞是一類由單核細(xì)胞分化而來(lái)、具有防衛(wèi)作用的免疫細(xì)胞[1]。巨噬細(xì)胞以不同形式廣泛分布于機(jī)體不同組織中，其不但參與機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)和非特異性免疫反應(yīng)，而且是兩種免疫反應(yīng)聯(lián)系的“橋梁細(xì)胞”[2]。巨噬細(xì)胞膜上的非特異性受體－外源性凝集素B 為糖蛋白，通過(guò)其終端的-OH 基與多糖-H基結(jié)合，啟動(dòng)了細(xì)胞內(nèi)環(huán)化酶系統(tǒng)，致使細(xì)胞內(nèi)酶的分泌及活性增加，細(xì)胞代謝提高，從而奠定了巨噬細(xì)胞活化的基礎(chǔ)[3]。活化的巨噬細(xì)胞具有定向運(yùn)動(dòng)和吞噬功能，能夠吞噬外來(lái)異物或直接殺死病原體和腫瘤細(xì)胞，還能分泌多種活性物質(zhì)（如活性氧（reactive oxygen species，ROS）、NO 和細(xì)胞因子等）來(lái)參與機(jī)體的免疫應(yīng)答等，同時(shí)還能夠傳遞抗原[4-5]。這些均與細(xì)胞內(nèi)酶的活性有關(guān)。

天然多糖主要來(lái)源于細(xì)菌、真菌、藻類和高等植物等組織中，具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和多種生物活性，如免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤，抗炎癥，抗病毒即抗氧化等，是一種有效的生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑[6-7]。越來(lái)越多的藥理和臨床研究表明，多糖作為藥物，其細(xì)胞毒性較小，并且可激活巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)。近年來(lái)微生物來(lái)源的胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）逐漸取代了傳統(tǒng)的植物多糖而越來(lái)越受到人們重視。微生物多糖由于其生產(chǎn)周期短，不受季節(jié)、氣溫等條件限制，具有較強(qiáng)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力和廣闊的發(fā)展前景[8]。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，乳酸菌EPS 具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性，既能激活非特異性免疫中的巨噬細(xì)胞和NK 細(xì)胞等免疫細(xì)胞，提高機(jī)體免疫分子的分泌能力；又能作用于特異性免疫系統(tǒng)，激活T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生淋巴因子，刺激B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體等。但是，由于乳酸菌胞外多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和來(lái)源的廣泛性，在機(jī)理上是如何發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用依然不清楚。由于乳酸菌EPS 具有菌株特異性，不同菌株產(chǎn)生的EPS 差異性很大，不同的EPS 具有各自特定的功能，因此在對(duì)新分離的乳酸菌EPS 的功能篩選時(shí)，對(duì)其進(jìn)行免疫活性的研究是很有必要的[9-10]。

Viili 是一種源自于芬蘭的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，有研究表明Viili 黏稠性是由其中乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖所致[11]。Viili 中的這種胞外多糖具有降低血液膽固醇含量、抗腫瘤及促進(jìn)益生菌與腸粘膜的吸附等重要的生理活性[12]。多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的基本作用就是刺激巨噬細(xì)胞，使其活力增強(qiáng)，提高胞內(nèi)酶活力，并釋放多種活性物質(zhì)。本試驗(yàn)以副干酪乳桿菌VL8 胞外多糖（VL8-EPS） 為研究對(duì)象，研究其對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7 胞內(nèi)酶（SOD、iNOS）及活性氧（H2O2、O2-）的影響，初步探討VL8-EPS 對(duì)巨噬細(xì)胞的激活機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細(xì)胞株：國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái)，小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7，此細(xì)胞株源自BALB/c 小鼠由Abelson 鼠科白血病病毒誘導(dǎo)的腫瘤。

VL8-EPS 實(shí)驗(yàn)室制備；DMEM 培養(yǎng)基、迪夫快速染色液（Diff-Quik Stain）試劑盒、超氧陰離子（oxygen free radical，OFR）含量檢測(cè)試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫（H2O2）測(cè)試盒、一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，NOS）試劑盒：南京建成生物工程研究所；細(xì)胞蛋白抽提與BCA 蛋白定量試劑盒：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004 電子天平：上海舜宇有限公司；CO2培養(yǎng)箱CB160：Binder 公司；1500-823 型酶標(biāo)儀：Thermo Sci entific 公司；SW-CJ-1FD 型超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YS100 顯微鏡：Nikon 儀器公司；Feb-80 電動(dòng)離心機(jī)：天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；K5600型超微量分光光度計(jì)：北京凱奧科技發(fā)展有限公司（KAIAO）。

1.3 方法

1.3.1 RAW264.7 細(xì)胞活化與培養(yǎng)

將細(xì)胞凍存管從液氮罐中取出，迅速在37 ℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行解凍。然后于超凈臺(tái)無(wú)菌操作，將細(xì)胞及凍存液轉(zhuǎn)移到含有5 mL 高糖DMEM 培養(yǎng)液的離心管中，1 000 r/min 離心 3 min～5 min，輕輕棄掉上清，保留離心管底的細(xì)胞，再用含有10 % 胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，最后，將細(xì)胞懸液置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。

1.3.2 VL8-EPS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞形態(tài)的影響

將 RAW264.7 細(xì)胞按 5×105個(gè)/mL 接種在 12 孔板中，試驗(yàn)分為空白對(duì)照組（不加VL8-EPS 和LPS），VL8-EPS 處理組（終濃度分別為 50、200、400、800 μg/mL），脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）陽(yáng)性對(duì)照組（終濃度為 10 μg/mL），于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中 24 h 后棄上清，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3 次。用500 μL Diff-Quik 固定劑固定細(xì)胞20 s，之后用 500 μL Diff-QuikⅠ染色 5 s～10 s，然后用 500 μL Diff-QuikⅡ染色10 s～20 s。最后，用PBS 洗滌后，趁濕在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.3 VL8-EPS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞iNOS 酶活力的影響

將 RAW264.7 細(xì)胞按 5×105個(gè)/mL，加入 6 孔板中，每孔2 mL。試驗(yàn)分為空白對(duì)照組（不加VL8-EPS和 LPS），VL8-EPS 處理組 （終濃度分別為 50、100、200、400、800 μg/mL），LPS 陽(yáng)性對(duì)照組 （終濃度為10 μg/mL），于 37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中 24 h 后棄上清，PBS 洗滌 3 次，每孔加 200 μL RIPA 裂解液，于冰上孵育20 min，使細(xì)胞充分裂解。離心取上清，蛋白質(zhì)定量（bicinchoninic acid，BCA）法測(cè)定蛋白濃度后，根據(jù)一氧化氮合酶測(cè)定試劑盒說(shuō)明書測(cè)定iNOS 酶活力。

1.3.4 VL8-EPS 對(duì) RAW264.7 細(xì)胞 SOD 酶活力的影響

將 RAW264.7 細(xì)胞按 5×105個(gè)/mL，加入 6 孔板中，每孔2 mL。試驗(yàn)分為空白對(duì)照組（不加VL8-EPS和 LPS），VL8-EPS 處理組 （終濃度分別為 50、100、200、400、800 μg/mL），LPS 陽(yáng)性對(duì)照組 （終濃度為10 μg/mL），于 37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中 24 h 后棄上清，PBS 洗滌 3 次，每孔加 200 μL RIPA 裂解液，于冰上孵育20 min，使細(xì)胞充分裂解。離心取上清，BCA 法測(cè)定蛋白濃度后，根據(jù)超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒說(shuō)明書測(cè)定SOD 酶活力。

1.3.5 VL8-EPS 對(duì) RAW264.7 細(xì)胞分泌 O2-的影響

將 RAW264.7 細(xì)胞按 5×105個(gè)/mL，加入 96 孔板中，每孔100 μL。試驗(yàn)分為空白對(duì)照組（不加VL8-EPS和 LPS），VL8-EPS 處理組 （終濃度分別為 50、100、200、400、800 μg/mL），LPS 陽(yáng)性對(duì)照組 （終濃度為10 μg/mL），每組設(shè)置 6 個(gè)重復(fù)，于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中24 h 后，取細(xì)胞培養(yǎng)液，按照超氧陰離子含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書添加試劑，混勻，8 000 r/min，25 ℃，離心 5 min，小心吸去上層水相 200 μL，530 nm 處測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算O2-的含量。

1.3.6 VL8-EPS 對(duì) RAW264.7 細(xì)胞分泌 H2O2的影響

將 RAW264.7 細(xì)胞按 5×105個(gè)/mL，加入 24 孔板中，每孔1mL。試驗(yàn)分為空白對(duì)照組（不加VL8-EPS 和LPS），VL8-EPS 處理組（終濃度分別為 50、100、200、400、800 μg/mL），LPS 陽(yáng)性對(duì)照組（終濃度為 10 μg/mL），每組設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)，于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中 24 h 后，取上清液，按照過(guò)氧化氫測(cè)試盒說(shuō)明書測(cè)定H2O2的含量。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均由SPSS 17.0 進(jìn)行分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示。各組求平均值后，兩兩對(duì)比，進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 VL8-EPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的影響

使用Diff-Quik 染色試劑盒觀察細(xì)胞的形態(tài)，結(jié)果如圖1 所示。

圖 1 VL8-EPS 對(duì) RAW264.7 細(xì)胞形態(tài)的影響（200×）Fig.1 Effect of VL8-EPS on RAW264.7 cells morphologic（200×）

從圖1 中可以看出，在空白對(duì)照組中，未激活的RAW264.7 細(xì)胞大多呈圓形。與空白對(duì)照組相比，VL8-EPS 處理的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)變化，開始出現(xiàn)不規(guī)則多邊形。與陽(yáng)性對(duì)照LPS 組相似，一些細(xì)胞延伸顯示典型活躍狀態(tài)的偽足，濃度較高，巨噬細(xì)胞顯得更長(zhǎng)，更多角形。結(jié)果表明VL8-EPS 具有與LPS 相似的功能，能夠改變巨噬細(xì)胞形態(tài)，激活細(xì)胞。但變形比例明顯小于LPS 組。

2.2 VL8-EPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞iNOS酶活力的影響

VL8-EPS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞iNOS 酶活力的影響如圖2 所示。

圖2 VL8-EPS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞iNOS 酶活力的影響Fig.2 Effect of VL8-EPS on the activity of iNOS in RAW264.7 cell

由圖2 可知，不同濃度的VL8-EPS 均能夠提高RAW264.7 細(xì)胞iNOS 酶活力，其活力顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），并且隨著 VL8-EPS 濃度的增大，iNOS酶活力提高，具有一定的量效關(guān)系。在800 μg/mL 時(shí)，其酶活力達(dá)到25.80 U/mgprot，較空白對(duì)照組提高了104.64%，且顯著高于陽(yáng)性對(duì)照 LPS 組（P＜0.01）。結(jié)果表明，VL8-EPS 在 50 μg/mL～800 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，能夠激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞iNOS 酶活力增加。

2.3 VL8-EPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞SOD酶活力的影響

VL8-EPS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞SOD 酶活力的影響如圖3 所示。

圖3 VL8-EPS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞SOD 酶活力的影響Fig.3 Effect of VL8-EPS on the activity of SOD in RAW264.7 cell

由圖3 可知，與空白對(duì)照組相比，不同濃度的VL8-EPS 均能提高RAW264.7 細(xì)胞SOD 酶活力，其中濃度達(dá)到 200 μg/mL 后達(dá)到極顯著差異（P＜0.01），且SOD 酶活力隨著VL8-EPS 濃度的增加而增加，呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。其結(jié)果與LPS 組類似，并在濃度為800 μg/mL 時(shí)，SOD 酶活力達(dá)到 7.44 U/mgprot，較空白對(duì)照組提高了10.30 %，且高于LPS 組。結(jié)果說(shuō)明VL8-EPS 在 50 μg/mL～800 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，可以激活巨噬細(xì)胞，提高SOD 酶活力。

2.4 VL8-EPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌O2-的影響

VL8-EPS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞分泌O2-的影響如圖4 所示。

如圖4 所示，與空白對(duì)照組相比，除50 μg/mL 濃度外，其余各組濃度的VL8-EPS 均極顯著提高了巨噬細(xì)胞分泌 O2-水平（P＜0.01），并隨著濃度的增大，O2-分泌量增加，呈一定的量效關(guān)系。在800 μg/mL 時(shí)，O2-含量最高，較空白對(duì)照組提高了666.87%，但其分泌量遠(yuǎn)低于陽(yáng)性對(duì)照LPS 組。結(jié)果表明，VL8-EPS 能夠激活巨噬細(xì)胞，在 50 μg/mL～800 μg/mL 濃度范圍內(nèi)能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌O2-。

圖4 VL8-EPS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞分泌O2-的影響Fig.4 Effect of VL8-EPS on O2-secretion in RAW264.7 cell

2.5 VL8-EPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌H2O2的影響

VL8-EPS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞分泌H2O2的影響如圖5 所示。

圖5 VL8-EPS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞分泌H2O2 的影響Fig.5 Effect of VL8-EPS on H2O2 secretion in RAW264.7 cell

由圖5 可知，與空白對(duì)照組相比，不同濃度的VL8-EPS 均能顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放H2O2（P＜0.05，P＜0.01），隨著多糖濃度的增加，H2O2釋放量增加，具有一定的量效關(guān)系。其中，在最大多糖濃度時(shí)，其分泌量達(dá)到了16.00 mmol/L，較空白對(duì)照組提高了81.78%，并且高于陽(yáng)性對(duì)照LPS 組。結(jié)果表明，VL8-EPS 在50 μg/mL～800 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌H2O2活性氧，起到殺滅病原微生物的作用。

3 討論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)中的重要成分之一，作為免疫效應(yīng)細(xì)胞起作用，廣泛參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。人體內(nèi)抗微生物和寄生蟲感染的主要效應(yīng)細(xì)胞是巨噬細(xì)胞[13-14]。不少研究表明活化后的巨噬細(xì)胞在吞噬異物的過(guò)程中會(huì)釋放大量釋放多種免疫活性物質(zhì)，如溶菌酶，髓過(guò)氧化物酶，乳鐵蛋白，防御素，活性氧物質(zhì)，活性氮物質(zhì)等，以其清除異物[15-16]。

研究表明，當(dāng)巨噬細(xì)胞受到外界物質(zhì)的刺激后，形態(tài)會(huì)發(fā)生改變，增加細(xì)胞表面積，提高吞噬能力[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，添加VL8-EPS 的RAW264.7 細(xì)胞經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的共培養(yǎng)，其細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。表現(xiàn)為圓形、橢圓、菱形、梭形或者不規(guī)則形，還可見較長(zhǎng)的偽足。沒(méi)添加藥物不被激活的細(xì)胞一般呈圓形、橢圓形，很少見有突起。表明VL8-EPS 能夠活化巨噬細(xì)胞，促進(jìn)其形態(tài)變化。同時(shí)，激活的巨噬細(xì)胞能明顯提高巨噬細(xì)胞胞內(nèi)酶的活性。NO 是活化巨噬細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞和病原微生物的一個(gè)重要效應(yīng)分子，激活的巨噬細(xì)胞表達(dá)NO 合成酶（NOS），利用L-精氨酸合成NO[19]。作為NO 合成中的關(guān)鍵酶，NOS 調(diào)節(jié)和影響生物活性。目前，有 3 種 NOS 亞型稱為神經(jīng)元 NOS（nNOS），內(nèi)皮NOS（eNOS）和誘導(dǎo)型 NOS（iNOS）。nNOS 和 eNOS 在細(xì)胞的生理狀態(tài)中表達(dá)，其是Ca2+依賴性的。然而，iNOS 主要存在于巨噬細(xì)胞中，并且被認(rèn)為在被非Ca2+依賴性的細(xì)胞因子刺激后不表達(dá)。SOD 作為體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的主要成分，體內(nèi)高水平的氧自由基主要來(lái)源于免疫和炎癥過(guò)程。SOD 是機(jī)體代謝的關(guān)鍵酶，它能催化體內(nèi)分子氧活化的第一個(gè)中間產(chǎn)物超氧陰離子自由基（O2-·）的歧化反應(yīng)而形成氧分子和過(guò)氧化氫。這些生成物對(duì)細(xì)胞仍會(huì)造成損害，可被過(guò)氧化氫酶及硒谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等酶進(jìn)一步無(wú)毒化[20]。生成的O2-和H2O2等活性氧成分是殺滅入侵病原微生物的主要成分[21]。陳偉珠[22]研究發(fā)現(xiàn)豬茯苓多糖能夠提高巨噬細(xì)胞iNOS 活性。程安瑋[23]發(fā)現(xiàn)甘草多糖可以激活巨噬細(xì)胞，提高SOD，iNOS 酶活力，促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放O2-。徐智敏[24]發(fā)現(xiàn)L.casei 胞外多糖能夠提高巨噬細(xì)胞O2-和H2O2水平。本試驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VL8-EPS 促進(jìn)巨噬細(xì)胞形態(tài)改變，提高了iNOS、SOD 的活性，同時(shí)促進(jìn)釋放O2-和H2O2活性氧，激活了巨噬細(xì)胞。結(jié)果說(shuō)明VL8-EPS 作為一種食品級(jí)來(lái)源的活性多糖，對(duì)巨噬細(xì)胞無(wú)明顯毒副作用，并且能夠激活巨噬細(xì)胞分泌活性物質(zhì)，提高免疫調(diào)節(jié)能力，是理想的天然免疫佐劑。本研究結(jié)果與程安瑋[23]，徐智敏[24]等的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

VL8-EPS 能夠激活RAW264.7 細(xì)胞，促使細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，提高巨噬細(xì)胞胞內(nèi)酶iNOS 及SOD 酶活力，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞分泌O2-和H2O2活性氧。由此表明，VL8-EPS 可能是通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)酶活力及分泌活性氧來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，提示VL8-EPS 可以作為一種潛在免疫調(diào)節(jié)劑激活巨噬細(xì)胞，發(fā)揮免疫增強(qiáng)功能。關(guān)于VL8-EPS 對(duì)巨噬細(xì)胞免疫功能的影響機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。