王艷君 石 芳 蘭向東 龐國明 何 立 何紅濤 計彥新 張文明 安向平

(河北中醫(yī)學院附屬醫(yī)院針灸科，河北 石家莊 050011)

晝夜節(jié)律是一種接近24 h(19～28 h)的生物周期[1]，能夠使機體功能適應日常環(huán)境變化。人體的心血管、內(nèi)分泌等系統(tǒng)均存在晝夜節(jié)律變化，若晝夜節(jié)律紊亂則會導致這些系統(tǒng)功能障礙，增加罹患心腦血管疾病、肥胖、糖尿病等慢性疾病的風險[2-3]。以血壓晝夜節(jié)律為例，人體血壓24 h的波動節(jié)律即為血壓晝夜節(jié)律，呈現(xiàn)“雙峰一谷”的“長柄杓”形曲線，具有益于適應機體活動、保護靶器官等功能，而紊亂的血壓晝夜節(jié)律是獨立于血壓水平的重要致病因素，對靶器官損害更為嚴重[4]。因此尋求調(diào)節(jié)血壓晝夜節(jié)律方法尤為重要。研究表明，針刺能夠治療非杓型高血壓，可以起到降壓和調(diào)節(jié)律的雙重效應[5]。目前針刺的降壓療效確切，但其調(diào)節(jié)血壓晝夜節(jié)律的作用機制尚不明確。同時有研究表明,新陳代謝和晝夜節(jié)律緊密相關(guān)，晝夜節(jié)律在調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)方面起關(guān)鍵作用，而脂質(zhì)則是涉及系統(tǒng)能量代謝和體內(nèi)平衡的主要介質(zhì)[6]。故本研究基于“調(diào)氣血，和陰陽”探析逆針灸對大學生非杓型血壓晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)作用，探究針刺是否可以逆轉(zhuǎn)紊亂的晝夜節(jié)律及可能機制，旨在為今后臨床針刺調(diào)節(jié)血壓節(jié)律提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本課題組前期以216名血壓正常的健康大學生作為觀察對象，進行24 h動態(tài)血壓監(jiān)測和體質(zhì)問卷調(diào)查，結(jié)果顯示47名大學生有高血壓家族史，其中30例學生的血壓晝夜節(jié)律為非杓型，17例為杓型，表明高血壓家族史與血壓晝夜節(jié)律之間存在相關(guān)性，具有高血壓家族史的健康大學生血壓晝夜節(jié)律為非杓型的可能性較大。本研究選取前期研究中具有高血壓家族史的非杓型健康大學生30例作為研究對象，其中男7例，女23例;年齡20～28歲,平均(23.6±1.4)歲；體質(zhì)量47.5～76 kg,平均(57.89±7.84)kg;身高155～184 cm,平均(165.34±12.17)cm。研究流程中針刺治療、數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析分別由專人負責。

1.2 納入、排除、中止試驗及脫落標準

1.2.1 納入標準 ①在校學生，18歲≤年齡≤30歲；②有高血壓家族史；③血壓在正常范圍內(nèi)；④血壓晝夜節(jié)律為非杓型；⑤患者自愿接受本治療，簽署知情同意書；⑥本研究方案獲得河北中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，批準編號為20150918-1。

1.2.2 排除標準 ①原發(fā)性高血壓或繼發(fā)性高血壓患者；②合并有心、腦、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴重原發(fā)疾病，精神病患者,呼吸睡眠暫停綜合征；③正在參加其他可能影響本研究結(jié)果評價的受試者。

1.2.3 中止試驗及脫落標準 ①患者依存性較低，未按療程進行治療，或研究期間自行退出者；②服用影響血壓及其節(jié)律的藥物，而干擾結(jié)果者；③受試者出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥或危急情況，不適宜繼續(xù)治療者。

1.3 治療方法 全部受試者均予針刺治療。取穴：曲池(雙)、足三里(雙)。定位：曲池，在肘橫紋外側(cè)端，屈肘時，當尺澤與肱骨外上髁連線的中點處；足三里，在小腿前外側(cè)，當犢鼻穴下3寸，距脛骨前嵴外一橫指(中指)，平脛骨粗隆下緣處。操作方法：患者取仰臥位，醫(yī)生以押手輕觸、揉按針刺局部皮膚，揣摩深淺，確定針刺的腧穴，針刺部位皮膚常規(guī)以碘伏消毒后，選用0.30 mm×40 mm華佗牌一次性無菌針灸針，以左手輕觸固定所針刺的腧穴，右手持針快速刺入皮下。直刺1寸，每穴行小幅度的提插捻轉(zhuǎn)，行平補平瀉手法，使局部有熱脹感，留針20 min，期間每10 min行針1次，共行針2次。受試者于每日上午7:00～9:00接受治療，每周連續(xù)治療5 d，休息2 d，共治療2周。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 記錄動態(tài)血壓 ①統(tǒng)一采用ri-cardio型24 h動態(tài)血壓監(jiān)測儀(德國里斯特公司)進行24 h動態(tài)血壓監(jiān)測，白天(6：00～21：59)每間隔30 min測量血壓1次，夜間(22：00～次日5：59)每間隔1 h測量血壓1次。記錄期間患者日?；顒硬皇芟拗疲瑖诨颊咴诒O(jiān)測儀自動測血壓時右臂保持靜止，監(jiān)測期間避免劇烈運動。血壓監(jiān)測包括24 h平均收縮壓、24 h平均舒張壓、白天平均收縮壓、白天平均舒張壓、夜間平均收縮壓、夜間平均舒張壓。治療前1周內(nèi)和治療后1周內(nèi)受試者分別測量1次。②血壓晝夜節(jié)律：根據(jù)動態(tài)血壓監(jiān)測結(jié)果，計算夜間平均血壓下降率=(日間血壓均值-夜間血壓均值)/日間血壓均值×100%。夜間平均血壓下降率10%～20%為杓型，<10%為非杓型，<0為反杓型，>20%為超杓型。當夜間平均血壓下降率在收縮壓與舒張壓上表現(xiàn)不一致時，以收縮壓為準。

1.4.2 血漿脂質(zhì)提取 所有受試者在治療前后均抽取空腹肘靜脈血4 mL，采集后血液在室溫下凝結(jié)30 min，后以3 000 r/min離心15 min。后取血清上清液并保存在-80 ℃環(huán)境中備用。將100 μL血漿與900 μL異丙醇混合，渦旋10 s以上，超聲10 min，混合物在-20 ℃下冷凍1 h，然后以10 000 r/min離心10 min。收集上層800 μL液體并轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，以進行注射，并通過高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF/MS)法進行分析。

1.4.3 UPLC-Q-TOF/MS分析 質(zhì)量控制(QC)樣品通過匯集所有血清樣品的等分試樣來制備，所述血清樣品代表待分析的血清樣品。采集期間，每5個樣品注射1次空白樣品(異丙醇∶水=90∶10)和質(zhì)控樣品。使用ACQUITY UPLC一級UPLC系統(tǒng)(英國曼徹斯特沃特世公司)與Xevo G2-S Q-TOF電噴霧電離四重飛行時間質(zhì)譜儀(英國曼徹斯特沃特世公司)耦合，進行UPLC-Q-TOF/MS分析。沃特世ACQUITY UPLC CSH色譜柱[粒度，1.7 μm；50 mm(長)×2.1 mm(內(nèi)徑)]用于液相色譜分離，柱溫保持在55 ℃。流速為0.4 mL/min，進樣量為2 μL。流動相A為0.1%的脂肪酸和10 mm的甲酸銨(在丙烯腈∶水中為60%∶40%)，流動相B為0.1%的脂肪酸和10 mm的甲酸銨(在異丙醇∶丙烯腈中為90%∶10%)。線性梯度設(shè)置如下:40% B,0～2 min 40% B to 43% B,2～2.1 min 43% B to 50% B,2.1～12 min 50% B to 54% B,12～12.1 min 54% B to 70% B,12.1～18 min 70% B to 99% B,18～18.1 min 99% B to 40% B,18.1～20 min 40% B。

高精度的質(zhì)譜數(shù)據(jù)由MassLynx 4.1軟件記錄(英國曼徹斯特沃特世公司)。采用Waters-QTOF質(zhì)譜儀(英國曼徹斯特沃特世公司)獨立于數(shù)據(jù)的MSE掃描方法，可自動獲得所有前體離子的高精度一次質(zhì)譜和二次質(zhì)譜數(shù)據(jù)。正負模式的毛細管電壓均為3.0 kV，錐形電壓均為25 V。源溫度設(shè)定為120 ℃，錐型氣體流量為50 L/h，去溶劑化溫度設(shè)定為450 ℃，去溶劑化氣體流量為850 L/h。亮氨酸-腦啡肽(英國曼徹斯特沃特世公司)被用作鎖定物質(zhì)，在正模式下以m/z 556.2771產(chǎn)生參考離子，在負模式下以m/z 554.2615產(chǎn)生參考離子，該離子是由鎖頻儀(英國曼徹斯特沃特世公司)以5 μL/min引入的，用于數(shù)據(jù)校準。均方誤差數(shù)據(jù)是在2個掃描函數(shù)中使用斜坡碰撞能量以連續(xù)模式獲得的。對于低能量模式，掃描范圍為50～2 000 Da，掃描時間為0.2 s，碰撞能量為6 V。對于高能量模式，掃描范圍為50～2 000 Da，掃描時間為0.2 s，碰撞能量為15～60 V。

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析 質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)經(jīng)過處理，峰注釋和標準化，以及通過數(shù)據(jù)庫搜索進行的脂質(zhì)鑒定，均由Progenesis QI軟件(英國曼徹斯特沃特世公司)完成。分析不同組之間的所有脂質(zhì)種類，對于每個單獨的樣品，所有檢測到的脂質(zhì)種類的強度按脂質(zhì)類別進行匯總。每個脂質(zhì)類別的相對量以百分比計算。配對樣本中各脂質(zhì)種類的強度采用非參數(shù)Wilcoxon符號秩檢驗(R package) 進行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。使用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)完成多變量統(tǒng)計分析，并獲得在特征變量投影重要性(VIP)>1的脂質(zhì)。

2 結(jié) 果

2.1 30名受試者針刺前后血壓節(jié)律改變情況 針刺治療后，30名受試者中有7名受試者血壓晝夜節(jié)律由非杓型轉(zhuǎn)為杓型，23名受試者血壓節(jié)律未改變。見表1。

表1 30名受試者針刺前后血壓節(jié)律改變情況

2.2 30名受試者針刺前后夜間血壓下降率比較 見表2。

表2 夜間血壓下降的變化

由表2可見，7名針刺后血壓節(jié)律轉(zhuǎn)為杓型的受試者與23名治療后血壓節(jié)律未變的受試者相比，其夜間收縮壓和舒張壓均明顯下降，但處于正常范圍內(nèi)。

2.3 受試者針刺治療前后總色譜圖比較 針刺治療前后血清樣品的UPLC-Q-TOF/MS圖以陽性和陰性模式顯示在圖1中。治療前后總體色譜圖無明顯差異。見圖1。

注：針刺治療前后血清樣本的代表性UPLC-Q-TOF/MS圖。A:積極模式；B:消極模式。上:針刺治療前；下:針刺治療后。

2.4 經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾后，在最終數(shù)據(jù)分析中選擇了429個變量(脂質(zhì)峰)(323個峰在ESI+模式，106個峰在ESI-模式)，對每個脂質(zhì)類和亞類的所有檢測到的脂質(zhì)種類的強度進行了匯總。針刺后由非杓型血壓轉(zhuǎn)為杓型血壓者，其血清中谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶低于非杓型血壓者，而血清甾醇高于非杓型血壓者。對亞類的進一步分析表明，杓型血壓磷脂酰膽堿明顯較低。見圖2。

圖2 脂質(zhì)種類的強度匯總

2.5 鑒別杓型血壓與非杓型血壓的關(guān)鍵脂質(zhì)的發(fā)現(xiàn)與鑒定 見圖3，表3。

注：A：OPLS-DA評分圖，藍色的點是以B為代表的針刺前的樣本；紅點是以A為代表的針刺后的樣本。B：OPLS-DA評分S圖，紅色框內(nèi)的點是VIP>1的變量。

表3 7名從非杓型血壓轉(zhuǎn)為杓型血壓受試者針刺前后血清中VIP>1的脂質(zhì)

由圖3A可知，OPLS-DA評分圖顯示了7名受試者在針刺治療后由非杓型血壓轉(zhuǎn)變?yōu)殍夹脱獕?，模型具有良好的擬合和預測性能(R2Y=0.99，Q2Y=0.88)。由圖3B和表3可知VIP值大于1的變量(脂質(zhì)種類)被認為在群體分離中起重要作用，共篩選出29種VIP>1的脂質(zhì)，具有區(qū)分杓型血壓和非杓型血壓的作用。

2.6 受試者針刺前后OPLS-DA評分圖比較 見圖4。

由圖4A可知，當使用OPLS-DA觀察23名受試者在針刺治療前后的組間差異時，這些受試者并未從非杓型血壓轉(zhuǎn)變?yōu)殍夹脱獕?，OPLS-DA評分圖僅顯示了血脂譜的差異趨勢，但不能很好地區(qū)分2組(R2Y=0.57，Q2Y=0.37)。由圖4B可知，對針刺后血壓水平和晝夜節(jié)律變?yōu)殍夹偷?名受試者進行了相同的分析作為對照。結(jié)果顯示配對血清與正常對照組沒有分離趨勢(R2Y=0.35，Q2Y=0)。

在以上2組中也計算了VIP值。為了減少間接影響血脂譜但與血壓夜間下降無關(guān)的其他因素的影響，從表2中篩選出圖4的OPLS-DA中VIP>1的血脂。嚴格過濾后，只有4種脂質(zhì)，即磷脂酰膽堿(20∶4/17∶0)、甘油三酯(18∶1/19∶0/22∶6)、3’-磺基半乳糖凝集素(d18∶1/18∶0)和甘油二酯(16∶0/20∶3)(表3以粗體顯示)，在區(qū)分杓型和非杓型血壓方面具有特異性。

注：A：23名受試者針刺前后OPLS-DA評分圖；B：7名受試者針刺前后OPLS-DA評分圖

2.7 針刺前后非杓型轉(zhuǎn)為杓型7名受試者脂類物質(zhì)濃度的統(tǒng)計分析 見圖5。

由圖5可知，用Wilcoxon秩檢驗法篩選出6種脂類物質(zhì)PC(20∶4/17∶0)、PC(22∶0/20∶4)、PS(O-18∶2/17∶0)、PS(O-20∶2/17∶0)、DG(16∶0/18∶3)、TG(20∶4/18∶220∶4)，在針刺前后比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在與VIP篩選的4種脂質(zhì)結(jié)合后，只有PC(20∶4/17∶0)被鑒定為能夠指示和辨別血壓晝夜節(jié)律狀態(tài)的關(guān)鍵脂質(zhì)種類。

圖5 針刺前后7名受試者脂類物質(zhì)濃度的統(tǒng)計

3 討 論

晝夜節(jié)律廣泛存在于人類和其他哺乳動物中，參與調(diào)節(jié)多種生理、心理和行為變化，是生命活動的本質(zhì)特性[1]。晝夜節(jié)律的中樞位于下丘腦視交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)，且廣泛表達于心臟、腎臟、骨骼肌等組織中[7-8]。晝夜節(jié)律紊亂會導致睡眠、心血管、代謝等多種功能障礙的發(fā)生[2-3]。人體正常血壓節(jié)律為“兩峰一谷”長柄杓狀樣特征波動模式，夜間收縮壓較晝間收縮壓下降比率為10%～20%，此種血壓波動模式對保證機體各種生理活動及維護心、腦、腎等重要臟器功能十分重要[9]。研究表明，血壓晝夜節(jié)律異常者伴發(fā)心臟、腎臟、血管靶器官損害以及心血管病的風險明顯增加[10-12]。而臨床研究表明，針刺能顯著降低血壓，改善晝夜血壓節(jié)律[13]。閻琦等[14]研究發(fā)現(xiàn)針刺人迎穴為主不僅能使血壓下降，而且可將非杓型恢復為杓型，并且針刺時間越長，杓型曲線越明顯。白樺等[15]證實，百會透刺前頂能夠在顯著降低晝夜平均收縮壓和平均舒張壓的基礎(chǔ)上，對晝夜血壓節(jié)律和降低腎素水平產(chǎn)生一定作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，高血壓具有家族聚集性，是高血壓患病的獨立危險因素[16]。有高血壓家族史的患者患高血壓的風險是無家族史的2～4倍[17]。同時研究表明，高血壓家族史是非杓型血壓晝夜節(jié)律紊亂的危險因素。本研究以具有高血壓家族史的非杓型健康大學生為觀察對象，采用“逆針灸”調(diào)整陰陽，糾正紊亂的血壓晝夜節(jié)律。

中醫(yī)學認為，血壓作為人體氣血陰陽運行的外在表現(xiàn)之一，其晝夜節(jié)律受氣血陰陽盛衰規(guī)律的影響呈現(xiàn)“雙峰一谷”的節(jié)律變化?！吨胁亟?jīng)》曰：“陽始于子前，末于午后，陰始于午后，末于子前，陰陽盛衰，各有時，更始更末，無有休止?！闭f明人必須適應自然界的周期性變化，反之則會導致陰陽失調(diào)，影響正常的血壓晝夜節(jié)律[18]?！端貑枴ふ{(diào)經(jīng)論》言“血氣不和，百病乃變化而生”?？梢姎庋蓙y導致臟腑功能失調(diào)，引發(fā)多種節(jié)律紊亂性疾病。故血壓晝夜節(jié)律紊亂的主要病機是陰陽失調(diào)，氣血失和。因此，本研究在“調(diào)氣血，和陰陽”理論的指導下，以“逆針灸”調(diào)整人體氣血，平衡機體陰陽，實現(xiàn)以平為期的目標。其選穴組方取陽明經(jīng)穴曲池、足三里進行針刺。陽明經(jīng)為多氣多血之脈，陽明之脈乃二陽合明，主司聚合，有內(nèi)斂陽氣、納陰蓄血之效。曲池可攝納陽明氣血，使氣血下降，平亢盛之肝陽，鎮(zhèn)上逆之邪火，有平衡陰陽之功。足三里是胃經(jīng)合穴，胃之下合穴，有和胃健脾、升降氣機、通腑化痰之功用，重在調(diào)臟腑氣血之平衡。并根據(jù)人體晝夜氣血流注變化規(guī)律和血壓“雙峰一谷”晝夜節(jié)律，于血壓晨峰(即辰時，7：00～9：00)為治療點，選二穴合用，擇時針刺，調(diào)和氣血，改善血壓晝夜節(jié)律，發(fā)揮將非杓型血壓晝夜節(jié)律轉(zhuǎn)變?yōu)殍夹偷男?/p>

本研究結(jié)果顯示，針刺治療后，30名受試者中7名變?yōu)殍夹蜁円构?jié)律。脂質(zhì)分析顯示，磷脂酰膽堿、甘油三酯、3’-磺基半乳糖凝集素和甘油二酯在針刺治療前后變化有差異，其中磷脂酰膽堿(20∶4/17∶0)可能是可以區(qū)分非杓型血壓與杓型血壓受試者的關(guān)鍵脂質(zhì)物種。表明針刺調(diào)節(jié)血壓晝夜節(jié)律可能與調(diào)節(jié)磷脂酰膽堿(20∶4/17∶0)、甘油三酯(18∶1/19∶0/22∶6)、3’-磺基半乳糖凝集素(d18∶1/18∶0)和甘油二酯(16∶0/20∶3)的代謝相關(guān)，磷脂酰膽堿(20∶4/17∶0)可能是鑒別杓型和非杓型血壓晝夜節(jié)律的關(guān)鍵物質(zhì)。

綜上所述，針刺能夠逆轉(zhuǎn)具有高血壓家族史非杓型血壓節(jié)律大學生的血壓節(jié)律，其作用機制可能與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)。由于研究樣本量較小，治療周期較短，使得非杓型血壓晝夜節(jié)律轉(zhuǎn)變?yōu)殍夹脱獕簳円构?jié)律的例數(shù)較少。今后應當增加樣本量，延長干預時間，進一步實現(xiàn)全身性脂質(zhì)譜的綜合表征，探索潛在的生物標志物用于區(qū)分杓型和非杓型型血壓，為針刺調(diào)節(jié)血壓晝夜節(jié)律提供思路，也為針刺治療其他節(jié)律紊亂性疾病提供參考依據(jù)。