T7噬菌體穿孔素的克隆表達及對宿主損傷研究

徐海 鮑熹 董洪燕 郭長明 鄧碧華 盧宇 朱善元

摘要：為研究T7噬菌體穿孔素（Holin）蛋白對宿主細菌的增殖性能的影響，根據(jù)T7噬菌體gene 17.5設(shè)計引物，PCR擴增Holin基因和序列分析，將該基因插入原核表達載體構(gòu)建重組表達菌BL-Holin。IPTG誘導Holin蛋白表達，SDS-PAGE和Western-blot檢測目標蛋白。分光光度法測定Holin蛋白對宿主細菌增殖性能的影響，掃描電鏡觀察重組菌誘導后表面結(jié)構(gòu)的損傷情況。結(jié)果表明，成功擴增Holin基因，構(gòu)建的重組菌能高效表達Holin蛋白。T7噬菌體Holin蛋白含有1個跨膜區(qū)，氨基端位于胞外、羧基端位于胞內(nèi)。Holin蛋白的表達量隨誘導時間延長而逐漸增加，細菌濃度從誘導0 h至2 h逐漸升高，2 h后細菌濃度開始下降，直至6 h，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)誘導細菌表面塌陷、皺縮進而死亡。研究結(jié)果顯示，Holin蛋白具有抑菌活性，這為進一步開發(fā)噬菌體抗菌制劑提供應用基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：穿孔素;表達;宿主損傷;T7噬菌體

中圖分類號： S188 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）24-0045-04

噬菌體是分子生物學起源與發(fā)展的模式生物，在發(fā)現(xiàn)之初就被用于細菌感染性疾病的治療，隨著人類進入抗生素時代使得噬菌體逐漸淡出人們的視野。近年來，細菌的耐藥性已然成為全球范圍內(nèi)的公共健康問題，每年有近百萬因耐藥菌感染引起的死亡病例，面對這一嚴峻問題，人們開始尋找新的抗菌產(chǎn)品，這其中噬菌體作為細菌的天然殺手再次受到研究人員的關(guān)注[1-2]。然而，利用噬菌體防控細菌感染也面臨一個棘手問題，噬菌體宿主識別譜窄，一種噬菌體往往只侵染一種或一類細菌，這限制了噬菌體在抗菌領(lǐng)域推廣與應用[3]。烈性噬菌體裂解系統(tǒng)中的溶菌酶、穿孔素等蛋白作用于細菌的細胞壁、細胞膜，引起細菌裂解，效率高且不受宿主譜的限制，對細菌具有廣譜的裂解活性，已成為開發(fā)新型抗菌制劑的熱點之一[4-6]。

烈性噬菌體裂解宿主細菌的過程有著緊密的調(diào)控、遵循著嚴格的時間順序[7-9]。溶菌酶-穿孔素二元裂解模型的提出對這一過程給予系統(tǒng)的解析。穿孔素是控制裂解時間的小分子量疏水性跨膜蛋白，在特定時間以寡聚體形式聚集于細胞內(nèi)膜上并形成穩(wěn)定的跨膜孔道，是噬菌體啟動裂解步驟的“定時器”[10-12]。溶菌酶是一種胞質(zhì)水解酶，隨著孔道的打開，溶菌酶被釋放到胞外，對肽聚糖層進行高效的切割[13-14]。近年來發(fā)現(xiàn)的Spanin蛋白對二元裂解模型做了進一步完善，該蛋白定位在細菌外膜，通過構(gòu)象變化破壞細菌外膜結(jié)構(gòu)[15-16]。在溶菌酶、穿孔素和Spanin的共同作用下，被侵染細菌徹底崩解。因此，研究上述3種蛋白與宿主細菌的作用關(guān)系，探明各自對宿主的損傷機制，才能更科學地加以利用。

T7噬菌體是侵染大腸桿菌的小型烈性噬菌體，具有良好的生長性能，侵染宿主細菌1～2 h即能完全裂解。對T7噬菌體的生物學背景已有相對全面的研究，其全部基因序列己經(jīng)測定，是噬菌體研究的理想模型。本研究通過原核系統(tǒng)表達T7噬菌體穿孔素蛋白，分析其結(jié)構(gòu)特征，揭示該蛋白對宿主的損傷作用，并測定其抑菌活性，以期為新型抗菌制劑的開發(fā)提供有益探索。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

質(zhì)粒、菌株與噬菌體：質(zhì)粒pET-28a（+）為筆者所在實驗室保存。大腸桿菌BL21-DE3、T7 select 415-1b噬菌體購自Merck公司。

主要試劑：限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄酶為大連寶生物公司產(chǎn)品;HRP標記抗His標簽二抗購自Abcom公司;引物由金斯瑞生物公司合成，引物序列為：Holin-F：5′-ATACCATGGGCGTGCTATCATTAGACT-3′，Holin-R：5′-AGACTCGAGTCACTCCTTATTGGCT-3′，引入中下劃線分別表示限制酶切位點（NcoⅠ和 BamHⅠ）;其余試劑均為分析純。

1.2 Holin基因分析

將Holin基因翻譯成對應蛋白序列，利用在線分析工具TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）對其進行跨膜區(qū)預測;在Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org）進行比對，分析Holin蛋白所屬的家族;Protparam工具（https：//web.expasy.org/protparam）分析蛋白的理化性質(zhì);SOPMA工具（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行分析。

1.3 重組菌構(gòu)建

以T7 select415-1b噬菌體基因組為模板，PCR擴增Holin基因。根據(jù)預設(shè)的酶切位點將基因片段插入原核表達載體pET-28a（+），構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-Holin，NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定及測序分析。將序列正確的重組表達質(zhì)粒化學轉(zhuǎn)化導入大腸桿菌BL21-DE3感受態(tài)細胞，篩選表達Holin蛋白的重組菌BL-Holin。

1.4 Holin蛋白誘導表達與鑒定

挑取單菌落BL-Holin接入含有1 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過夜培養(yǎng)。取 50 μL 過夜培養(yǎng)菌液至5 mL新鮮卡那霉素抗性LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)2 h，加入工作濃度為0.5 mmol/L的IPTG進行誘導。同時，設(shè)BL21和BL-Holin未誘導對照。從誘導起始點開始，每隔2 h取樣，經(jīng)12% SDS-PAGE檢測蛋白表達情況。轉(zhuǎn)印蛋白至NC膜，用HRP標記的羊抗His tag二抗鑒定Holin蛋白。

1.5 Holin蛋白表達對宿主菌增殖的影響

以1 ∶ 100比例轉(zhuǎn)接過夜培養(yǎng)的BL21、BL-Holin至新鮮培養(yǎng)基，在對數(shù)生長前期往重組菌 BL-Holin 中加入工作濃度為0.5 mmol/L的IPTG進行誘導，同時設(shè)BL21和未誘導對照組，于37 ℃、200 r/s搖床持續(xù)培養(yǎng)。從轉(zhuǎn)接起始點開始每隔1 h取200 μL培養(yǎng)液測定D600 nm，繪制3組細菌的生長曲線。

1.6 Holin蛋白表達對宿主菌表面結(jié)構(gòu)的影響

以1 ∶ 100比例轉(zhuǎn)接過夜培養(yǎng)的BL-Holin重組菌，在對數(shù)生長前期加入IPTG進行誘導，持續(xù)誘導3 h，同時設(shè)未誘導對照。5 000 r/min，10 min收集重組菌，PBS重懸洗滌1次，再次離心后收集沉淀，采用4%多聚甲醛固定。樣品送至揚州大學檢測中心，掃面電鏡觀察細菌表面結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 Holin蛋白序列分析

利用多種生物學軟件對T7噬菌體Holin蛋白進行分析：Protparam工具顯示T7噬菌體Holin蛋白由67個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為7 359，穩(wěn)定系數(shù)為7.71，總平均親水性為0.464，為穩(wěn)定、疏水性蛋白質(zhì)。Pfam數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果表面T7噬菌體Holin蛋白屬于Phage_holin_2_2家族（PF10746）。TMHMM軟件分析表明其氨基酸端1～36 aa位于胞外區(qū)，37～55 aa為跨膜區(qū)，56～67 aa的羧基端為胞內(nèi)區(qū)。SOPMA工具顯示，holin蛋白。α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、延長鏈、和無規(guī)則卷曲分別占氨基酸總數(shù)的56.72%、0.00%、7.46%、10.45%和2537%（圖1）。

2.2 Holin基因的克隆及重組質(zhì)粒構(gòu)建

由圖2-A和2-B可知，以T7噬菌體基因為模板，PCR擴增出約250 bp的Holin基因，測序結(jié)果表明獲得基因片段序列正確。將該基因片段插入pET-28a（+）載體，成功構(gòu)建重組表達質(zhì)粒載體pET-Holin，NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定正確。

2.3 Holin蛋白誘導表達及鑒定

由圖3-A可知，對數(shù)生長前期的重組菌BL-Holin經(jīng)IPTG誘導后細菌濃度并未迅速上升，相反隨著誘導時間的延長，重組菌出現(xiàn)裂解現(xiàn)象，培養(yǎng)液變清亮且泡沫增多。由圖3-B可知，SDS-PAGE檢測誘導菌有蛋白表達。由圖3-C可知，利用Holin蛋白羧基端融合表達的His標簽進行Western-blot檢測，進一步確定誘導產(chǎn)生Holin蛋白，并且隨著誘導時間的延長Holin蛋白的累積量逐漸增加。

2.4 Holin蛋白的表達對宿主細菌增殖的影響

IPTG誘導重組大腸桿菌BL-Holin表達Holin蛋白，通過對重組表達菌不同時間點的濁度測定來評價Holin蛋白對宿主細菌增殖能力的影響，由圖4可知，BL-Holin轉(zhuǎn)接后2 h開始誘導，細菌濁度緩慢上升至4 h，然后濁度逐漸下降，6～8 h濁度維持在較低水平，8 h后濁度開始緩慢上升。而未經(jīng)誘導的BL-Holin表現(xiàn)出與BL21相似的增殖性能，表明Holin蛋白的表達抑制宿主的正常增殖。

2.5 Holin蛋白對宿主細菌表面結(jié)構(gòu)的損傷

通過掃面電鏡觀察經(jīng)IPTG誘導和未誘導的BL-Holin 重組菌表面結(jié)構(gòu)變化，評價Holin蛋白對宿主的損傷情況。由圖5-B可知，誘導表達Holin蛋白的重組菌表面塌陷，菌體皺縮，而未誘導的重組菌保持完整的表面結(jié)構(gòu)（圖5-A）。由此可知，重組菌表達Holin蛋白后造成胞膜的損傷，其結(jié)構(gòu)完整性被破壞致使內(nèi)容物釋放到胞外，引起菌體死亡。

3 討論

上世紀40年代開始，噬菌體研究進入早期的黃金時代，以λ噬菌體和T4噬菌體作為模式生物的相關(guān)研究為現(xiàn)代分子生物學的建立作出了卓越貢獻。Young于1992年首次提出了著名的穿孔素-溶菌酶二元裂解系統(tǒng)理論，清晰地闡明了λ噬菌體裂解宿主的過程[17]。當然，這一理論將肽聚糖層的破壞作為裂解宿主菌的主要標志，卻忽視了細菌外膜對裂解過程的阻礙。近年來，第三類裂解相關(guān)蛋白Spanin的發(fā)現(xiàn)進一步完善了該理論，至此λ噬菌體裂解宿主的過程可分為3個步驟：Holin蛋白在細菌內(nèi)膜打孔，釋放胞內(nèi)溶菌酶切割肽聚糖層，Spanin通過構(gòu)象變化撕裂細菌外膜，最終導致細菌的徹底崩解。參與這一過程的穿孔素、溶菌酶和Spanin均能造成細菌表面結(jié)構(gòu)的損傷，因此被視為開發(fā)新型抗菌制劑的候選物質(zhì)而備受關(guān)注。

T7噬菌體裂解系統(tǒng)研究報道較少，現(xiàn)已明確溶菌酶（gene3.5）、穿孔素（gene17.5）以及可能發(fā)揮Spanin功能的gene18.5/18.7構(gòu)成了T7噬菌體裂解系統(tǒng)[15，18]。本研究對T7噬菌體Holin蛋白進行序列分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白分子僅有1個跨膜區(qū)，屬于Phage_holin_2_2家族（PF10746），氨基酸端位于胞外，羧基端位于胞內(nèi)，這與報道的T4、T5噬菌體的Holin蛋白拓撲結(jié)構(gòu)相同。為了不影響T7噬菌體Holin蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運，選擇位于胞內(nèi)的羧基端融合表達His標簽用于Western-blot檢測。結(jié)合圖3-C和圖4，重組菌誘導后2 h內(nèi)Holin蛋白處于積累階段，此時細菌濃度緩慢上升，當Holin蛋白量積累到一定閾值后造成細菌膜結(jié)構(gòu)損傷，此時細菌濃度逐漸下降并維持在較低水平。繼續(xù)誘導后期至8 h，此時Holin蛋白積累量仍然增加，而細菌濃度也逐步增加，對于這一現(xiàn)象尚需要進一步研究分析。由圖5可見，Holin蛋白在細菌內(nèi)膜聚集并形成孔道，由于缺少溶菌酶的釋放，并不會對胞外結(jié)構(gòu)造成直接破壞，但此時胞內(nèi)可溶性蛋白、電解質(zhì)等可通過孔道流失，菌體呈現(xiàn)塌陷、皺縮狀態(tài)，最終死亡。

作為噬菌體裂解系統(tǒng)，穿孔素、溶菌酶無論單獨使用還是聯(lián)合使用，均能起到有效抑制細菌增殖的作用[19]。穿孔素還可以作為轉(zhuǎn)運載體，輔助藥物、核酸、蛋白質(zhì)進入菌體內(nèi)部，進一步提高抗菌效率[20-21]。此外，噬菌體在入侵宿主時需要在菌體表面開孔注入核酸物質(zhì)，例如T7噬菌體的gp16能夠水解細胞壁啟動感染，這類蛋白也可以用作抗菌制劑的開發(fā)[22]。本研究對T7噬菌體的穿孔素進行原核表達，分析該蛋白的結(jié)構(gòu)、評價其抑菌活性，并初步解析其損傷細菌膜結(jié)構(gòu)的機制，這可為進一步研究穿孔素的抑菌機制以及開發(fā)利用穿孔素的抗菌活性做出有益的探索。

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