茶樹葉片響應(yīng)茶餅病侵染的轉(zhuǎn)錄組分析

孫云南，許燕，冉隆珣，蔣會(huì)兵，宋維希，夏麗飛，陳林波，梁名志

茶樹葉片響應(yīng)茶餅病侵染的轉(zhuǎn)錄組分析

孫云南，許燕*，冉隆珣，蔣會(huì)兵，宋維希，夏麗飛，陳林波，梁名志*

云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/云南省茶樹種質(zhì)資源創(chuàng)新與配套栽培技術(shù)工程研究中心/云南省茶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 勐海 666201

采用高通量測序技術(shù)對(duì)被茶餅病病菌侵染的茶樹葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選得到差異基因359個(gè)，其中248個(gè)上調(diào)表達(dá)，111個(gè)下調(diào)表達(dá)。差異基因中有216個(gè)獲得GO（Gene ontology）數(shù)據(jù)庫功能注釋，主要涉及到生物合成過程、催化活性、細(xì)胞過程等諸多生理生化過程；KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）數(shù)據(jù)庫富集分析發(fā)現(xiàn)，共有106個(gè)基因被注釋到47個(gè)代謝通路中，其中，單萜生物合成、卟啉和葉綠素代謝、核糖體、氮代謝、雙萜生物合成、植物病原互作等通路顯著富集。有32個(gè)差異基因被鑒定為轉(zhuǎn)錄因子，分布在16個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族中。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real time quantitative PCR，qRT-PCR）驗(yàn)證了隨機(jī)挑選的差異基因在感病葉片和未感病葉片中的相對(duì)表達(dá)量，與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的變化趨勢一致。結(jié)果表明，茶樹響應(yīng)病原菌侵染是一個(gè)復(fù)雜的過程，大量基因被誘導(dǎo)或抑制表達(dá)，與抗病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子被大量激活且上調(diào)表達(dá)。本研究為深入挖掘茶樹抗病基因及進(jìn)一步研究抗病分子機(jī)制提供了理論依據(jù)。

茶樹；茶餅??；轉(zhuǎn)錄組；差異基因

茶葉生產(chǎn)在我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)、農(nóng)村發(fā)展和社會(huì)主義新農(nóng)村建設(shè)方面占有舉足輕重的地位，是農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收的重要產(chǎn)業(yè)。然而茶樹病害一直是我國茶葉高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和高效生產(chǎn)的重要限制因子之一[1-2]。同時(shí)，隨著歐盟對(duì)茶葉進(jìn)口農(nóng)殘檢測標(biāo)準(zhǔn)的一再提高，茶樹病害及其防治過程中的農(nóng)殘問題也成為限制我國茶葉產(chǎn)品出口的重要因素[3]。因此，開展茶樹對(duì)病害防御機(jī)制和新型內(nèi)源相關(guān)抗病基因篩選的研究已成為解決這一問題的關(guān)鍵。

茶餅病病害在中國所有茶區(qū)幾乎都有分布，尤其是在中國西南山區(qū)茶園中發(fā)生極為嚴(yán)重[2]。茶餅病病原菌為，屬擔(dān)子菌亞門，外擔(dān)菌目，外擔(dān)菌屬真菌，屬于活體營養(yǎng)真菌。主要危害嫩葉、新梢，是茶樹上一種主要芽葉病害，不僅影響產(chǎn)量，而且用感病芽葉生產(chǎn)的毛茶易碎且味苦，茶葉品質(zhì)下降明顯，影響經(jīng)濟(jì)效益[4-7]。近年來，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-seq）被廣泛應(yīng)用于植物與病原菌互作機(jī)理研究，在水稻[8]、擬南芥[9]、番茄[10]、棉花[11]、蘋果[12]、葡萄[13]、玉米[14]、板栗[15]和煙草[16]等多種植物中都有應(yīng)用，篩選出了大量與抗病相關(guān)的基因及代謝通路，為深入研究植物和病原菌互作分子機(jī)制和植物抗病機(jī)理提供了重要信息。王玉春[17]利用RNA-seq技術(shù)，以抗病品種中茶108和龍井43為試驗(yàn)材料，進(jìn)行炭疽菌感染，結(jié)果表明茶樹抗炭疽病與茶樹植物激素和咖啡堿的合成代謝相關(guān)。

目前，對(duì)茶餅病的研究主要集中在發(fā)生危害規(guī)律、抗病品種選育，以及防控藥劑的篩選上[4,18-22]，在轉(zhuǎn)錄組水平上研究茶樹響應(yīng)茶餅病病原菌侵染的關(guān)鍵基因表達(dá)研究仍鮮見報(bào)道。本研究利用Illumina HiSeq高通量測序技術(shù)對(duì)感病和未感病茶樹葉片的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究，結(jié)合生物信息學(xué)分析方法對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG代謝通路富集分析，基于轉(zhuǎn)錄組水平研究茶樹響應(yīng)茶餅病病原菌侵染關(guān)鍵基因的表達(dá)，挖掘與抗病相關(guān)的基因，為茶樹抗病相關(guān)基因的克隆和功能驗(yàn)證以及茶樹抗病機(jī)理等研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所科研試驗(yàn)基地內(nèi)種植的無性系良種76-38（由云南省農(nóng)科院茶葉研究所以南糯大葉茶群體后代為原始材料，經(jīng)系統(tǒng)選育獲得）為材料，測序樣品來自田間管理方式完全相同的同一地塊，根據(jù)葉片的感病狀況，試驗(yàn)材料分為感病組YCCB（感病初期茶樹葉片）和對(duì)照組YCCK（健康的茶樹葉片）（圖1）。感病組取受茶餅病感染，病斑剛好發(fā)白直徑為0.3~0.5?cm且無其他病斑、蟲眼的茶樹葉片，去除病斑，液氮速凍；對(duì)照組取與感病葉同等嫩度的無病斑、無蟲眼的健康葉片，并去除與感病葉病斑同等大小葉面積的葉片，液氮速凍。轉(zhuǎn)錄組測序分析由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.2 樣品RNA的提取與檢測

使用Trizol法提取樣品的總RNA，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳、NanoPhotometer?spectrophotometer（IMPLEN，CA，USA）、Qubit?2.0 Flurometer（Life Technologies，CA，USA）、Agilent Bioanalyzer 2100 system（Agilent Technologies，CA，USA）對(duì)提取到的RNA進(jìn)行純度、濃度和完整性的檢測。

1.3 文庫的構(gòu)建和測序

檢測合格的RNA樣品，用Oligo（dT）富集mRNA，使用SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用Blue Pippin進(jìn)行片段篩選，對(duì)全長cDNA進(jìn)行損傷修復(fù)、末端修復(fù)、連接測序接頭得到最終的文庫。構(gòu)建好的文庫采用Qubit 2.0、Agilent 2100進(jìn)行檢測。庫檢合格后，使用高通量測序平臺(tái)Illumina HiSeq2500測序。

圖1 健康葉片和感病葉片

1.4 轉(zhuǎn)錄本拼接與基因的功能注釋

由于試驗(yàn)開始時(shí)茶樹基因組測序未完成，所以按無參考基因組的樣本進(jìn)行組裝分析。測序得到的原始序列經(jīng)過濾后，得到clean reads，采用Trinity軟件對(duì)clean reads進(jìn)行拼接，挑選最長的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene（Universal gene），使用Nr（NCBI non-redundant protein sequences）、Nt（NCBI nucleotide sequences）、Pfam（Protein family）、KOG/COG（euKaryotic ortholog groups/Clusters of orthologous groups of proteins）、Swiss-prot（A manually annotated and reviewed protein sequence database），KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）、GO（Gene ontology）等七大數(shù)據(jù)庫對(duì)Unigene進(jìn)行基因功能注釋。植物轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測使用iTAK軟件，其原理是利用數(shù)據(jù)庫中分類定義好的TF（Transcription factor）家族及規(guī)則，通過hmmscan鑒定TF。

1.5 差異表達(dá)基因的篩選與分析

以Trinity拼接獲得的轉(zhuǎn)錄組為參考序列，把樣品的clean reads與參考序列進(jìn)行比對(duì)，采用RSEM軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品比對(duì)到每個(gè)基因上的數(shù)目，通過TMM（Trimmed mean of M-values）對(duì)統(tǒng)計(jì)到的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后用DEGseq（DEGseq is an R package to identify differentially expressed genes from RNA-Seq data）進(jìn)行差異分析，以差異顯著性qvalue<0.005且表達(dá)差異倍數(shù)|log2Fold change|>1（Fold change=YCCB/YCCK）為條件來篩選差異基因，當(dāng)某個(gè)基因的qvalue<0.005且log2Fold_change>1，則該基因?yàn)橛酗@著性差異的上調(diào)表達(dá)基因；反之，若qvalue<0.005且log2Fold_change<–1，則認(rèn)為該基因?yàn)橛酗@著性差異的下調(diào)表達(dá)基因。采用KEGG代謝通路富集分析和GO功能富集分析方法對(duì)篩選得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

利用Illumina HiSeq 2500測序平臺(tái)分別對(duì)感茶餅病葉片（YCCB）和對(duì)照葉片（YCCK）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。測序得到的原始序列經(jīng)去除接頭、未知序列比例大于10%的reads和低質(zhì)量reads后，在YCCK中獲得64?006?918條clean reads，在YCCB中獲得45?114?082條clean reads。測序結(jié)果顯示，感病葉片和對(duì)照葉片GC含量均大于44%，Q20、Q30值都高于91%（表2），表明轉(zhuǎn)錄組測序的質(zhì)量較高，可以進(jìn)行下一步分析。采用Trinity對(duì)clean reads進(jìn)行拼接，得到271?523條轉(zhuǎn)錄本序列，挑選最長的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene，共獲得174?809條，其平均長度為1?138?bp，N50為1?622?bp，說明拼接效果良好。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的基因及引物

表2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)一覽表

2.2 基因表達(dá)水平分析

采用RSEM軟件，以Trinity拼接獲得的轉(zhuǎn)錄組為參考序列，把樣品的clean reads與參考序列進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品比對(duì)到每個(gè)基因上的數(shù)目，并對(duì)其做FPKM（Expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced）轉(zhuǎn)換，用于分析基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，感病葉片有33?205?924條序列定位到參考序列，占clean reads的78.39%。對(duì)照葉片有47?425?126條序列定位到參考序列，占clean reads的78.70%。對(duì)不同試驗(yàn)條件下基因的FPKM做密度分布圖及盒形圖（圖2），在整體水平上檢查不同試驗(yàn)條件下FPKM分布的情況，從FPKM密度分布發(fā)現(xiàn)，感茶餅病葉片和對(duì)照葉片的基因總體表達(dá)量在離散度和總體分布度上存在一定差異，表明茶樹在茶餅病侵染后，部分基因的表達(dá)發(fā)生了改變。

2.3 差異表達(dá)基因的篩選

利用差異顯著性（qvalue）結(jié)合差異表達(dá)倍數(shù)（Fold change=YCCB/YCCK）來控制假陽性率，以qvalue<0.005且|log2(Fold change)|>1為閾值來篩選差異基因，統(tǒng)計(jì)分析所得的差異基因個(gè)數(shù)，共獲得差異基因359個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)248個(gè)，下調(diào)表達(dá)有111個(gè)（圖3）。說明茶樹在茶餅病危害后，茶樹的自我防御機(jī)制被啟動(dòng)，通過對(duì)自身基因表達(dá)的改變來防御茶餅病對(duì)茶樹的危害。

2.4 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析

對(duì)篩選出的差異基因進(jìn)行GO功能富集分析，尋找茶樹葉片在受到茶餅病病菌感染后表達(dá)變化顯著的差異基因的主要功能，結(jié)果如圖4所示。

359個(gè)差異基因中有216個(gè)獲得功能注釋，對(duì)127個(gè)上調(diào)的差異表達(dá)基因富集結(jié)果進(jìn)行分析，生物過程共富集到690個(gè)GO條目，其中顯著富集的有23個(gè)GO條目，富集差異基因數(shù)最多的是細(xì)胞成分組成或生物起源（Cellular component organization or biogenesis）。細(xì)胞組分共富集到159個(gè)GO條目，其中顯著富集的有5個(gè)GO條目，富集差異基因數(shù)最多的是細(xì)胞質(zhì)（Cytoplasm）。分子功能共富集到232個(gè)GO條目，其中顯著富集的有15個(gè)GO條目，富集差異基因數(shù)最多的是碳氧裂合酶活性（Carbon-oxygen lyase activity）。進(jìn)一步通過topGO有向無環(huán)圖分析富集程度發(fā)現(xiàn)，生物過程中倍半萜烯合成酶活性（Sesquiterpene synthase activity）富集程度最高，分子功能中倍半萜烯生物合成過程（Sesquiterpenoid biosynthetic process）富集程度最高，細(xì)胞組分中細(xì)胞壁（Cell wall）富集程度最高。

圖2 基因表達(dá)水平比對(duì)

注：散點(diǎn)代表各個(gè)基因，藍(lán)色圓點(diǎn)表示無顯著性差異的基因，紅色圓點(diǎn)表示顯著上調(diào)的差異基因，綠色圓點(diǎn)表示顯著下調(diào)的差異基因

下調(diào)的89個(gè)差異表達(dá)基因中，生物過程共富集到549個(gè)GO條目，其中顯著富集的有酰胺生物合成過程（Amide biosynthetic process）和應(yīng)激反應(yīng)（SOS response）。細(xì)胞組分共富集到182個(gè)GO條目，其中顯著富集的有細(xì)胞壁（Cell wall）和細(xì)胞質(zhì)（Cytoplasm）。分子功能共富集到281個(gè)GO條目，其中顯著富集的有胞嘧啶核苷酸激酶活性（Cytidylate kinase activity）、四氫葉酸脫氫酶活性[Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase (NADP+) activity]、RNA解旋酶活性（RNA helicase activity）和核苷酸激酶活性（Nucleotide kinase activity）4個(gè)GO條目。

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

KEGG富集分析結(jié)果顯示（圖5），共有106個(gè)差異表達(dá)基因被注釋到了47個(gè)通路中，其中顯著富集通路（＜0.05）有6個(gè)，主要參與到單萜生物合成（Monoterpenoid biosynthesis）、卟啉和葉綠素代謝（Porphyrin and chlorophyll metabolism）、核糖體（Ribosome）、氮代謝（Nitrogen metabolism）、雙萜生物合成（Diterpenoid biosynthesis）、植物病原互作（Plant-pathogen interaction）。單萜生物合成（Monoterpenoid biosynthesis）注釋到6個(gè)差異表達(dá)基因（1個(gè)下調(diào)，5個(gè)上調(diào)）、卟啉和葉綠素代謝（Porphyrin and chlorophyll metabolism）注釋到5個(gè)差異表達(dá)基因（3個(gè)下調(diào)，2個(gè)上調(diào)）、核糖體（Ribosome）注釋到9個(gè)差異表達(dá)基因（8個(gè)下調(diào)，1個(gè)上調(diào)）、氮代謝（Nitrogen metabolism）注釋到3個(gè)差異表達(dá)基因（1個(gè)下調(diào)，2個(gè)上調(diào)）、雙萜生物合成（Diterpenoid biosynthesis）注釋到2個(gè)差異表達(dá)基因（2個(gè)均為上調(diào)）、植物病原互作（Plant-pathogen interaction）注釋到7個(gè)差異表達(dá)基因（4個(gè)下調(diào)，3個(gè)上調(diào)）。

圖4 差異基因的GO富集分析

圖5 差異基因的KEGG顯著富集分析

2.6 差異基因的轉(zhuǎn)錄因子分類

359個(gè)差異基因中有32個(gè)與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)，其中有23個(gè)上調(diào)表達(dá)，9個(gè)下調(diào)表達(dá)。如表3所示，AP2-EREBP轉(zhuǎn)錄因子基因家族有6個(gè)差異基因，全部為上調(diào)基因，豐度最高；其次為HMG、FHA、MYB轉(zhuǎn)錄因子基因家族，各有3個(gè)差異基因；C2H2、C3H、WRKY、PHD家族各有2個(gè)差異基因；zf-HD、HB、GRAS、SNF2、TUB、bHLH、G2-like、Sigma70-like家族也有差異基因被注釋。32個(gè)轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因分布到了16個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族中，且大量分布在與植物抗生物脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族中。

2.7 差異表達(dá)基因的qRT-PCR分析

以茶樹的GAPDH（AB120309.1）基因?yàn)閮?nèi)參基因，隨機(jī)選取6個(gè)差異表達(dá)基因（Cluster-1911.66155、Cluster-1911.67296、Cluster-1911.44247、Cluster-1911.78592、Cluster-1911.61836和Cluster-1911.66418）進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。從圖6可以看出，6個(gè)差異表達(dá)基因在感染茶餅病葉片和未感染茶餅病葉片的相對(duì)表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組差異分析的變化趨勢是一致的，從而說明轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果是可靠的。

3 討論

植物響應(yīng)病原體入侵時(shí)激活的免疫機(jī)制十分復(fù)雜，茶樹品種76-38在受到茶餅病病菌侵染后，病原菌誘導(dǎo)或抑制茶樹大量基因的表達(dá)變化。

植物通過進(jìn)化形成多種防御機(jī)制來抵御病蟲害入侵。一種是物理防御機(jī)制，有研究認(rèn)為植物抵御大多數(shù)病原菌侵染的第一道屏障是細(xì)胞壁，當(dāng)病原菌入侵時(shí)，植物通過合成木質(zhì)素聚合物、沉積胼胝質(zhì)、積累酚類化合物等，使病原菌入侵點(diǎn)的細(xì)胞壁強(qiáng)度增強(qiáng)來抵御病蟲害入侵[23-26]；另一種為化學(xué)防御機(jī)制，即利用生物活性分子物質(zhì)防御，植物通過合成和積累生物活性分子物質(zhì)包括皂苷、咖啡因、水楊酸甲酯、植保素（Phytoalexin）等[27]抑制或殺滅病原菌。植保素的種類繁多，現(xiàn)已有200多種被發(fā)現(xiàn)并鑒別，其中研究最深入的是類黃酮和萜類[28]。本研究GO富集分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的差異基因富集程度最高的是倍半萜烯生物合成過程（Sesquiterpenoid biosynthetic process）、倍半萜烯合成酶活性（Sesquiterpene synthase activity）和細(xì)胞壁（Cell wall）。KEGG代謝通路富集顯示單萜生物合成（Monoterpenoid biosynthesis）和雙萜生物合成（Diterpenoid biosynthesis）代謝通路顯著富集，說明茶樹在受到茶餅病病原菌侵染后，物理防御被激活，與細(xì)胞壁相關(guān)的差異基因大量上調(diào)表達(dá)，以增強(qiáng)細(xì)胞壁強(qiáng)度抵御茶餅病病原菌的入侵，同時(shí)化學(xué)防御機(jī)制被激活，產(chǎn)生大量的萜烯類生物活性分子抑菌物質(zhì)，抑制病菌繁殖，阻止病原菌進(jìn)一步擴(kuò)散。

表3 差異基因中轉(zhuǎn)錄因子

注：“*”代表基因在YCCB和YCCK之間的表達(dá)差異顯著性，*：P<0.05，**：P<0.01

Ca2+是細(xì)胞的第二信使，當(dāng)病原菌侵染后細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的鈣信號(hào)參與調(diào)節(jié)介導(dǎo)植物抗病基因的表達(dá)[29]。在植物中，環(huán)腺苷酸門通道（CNGCs）參與K+、Na+和Ca2+等陽離子的非選擇性吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，Dodd等[30]發(fā)現(xiàn)擬南芥CNGCs基因調(diào)節(jié)Ca2+濃度參與對(duì)病原微生物的響應(yīng)。鈣調(diào)蛋白（CaM）是一類鈣離子結(jié)合蛋白，是最重要的Ca2+受體，在植物的生長發(fā)育和抗逆抗病過程中起重要的調(diào)控作用。Yamakawa等[31]研究發(fā)現(xiàn)，煙草在受到煙草花葉病毒侵染后，煙草中鈣調(diào)蛋白基因的表達(dá)上調(diào)。鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）是在植物及原生動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與多種Ca2+介導(dǎo)的信號(hào)通路，在Ca2+介導(dǎo)的發(fā)育信號(hào)和逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用，Lu等[32]對(duì)擬南芥的CPK基因進(jìn)行沉默后，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌激發(fā)子flg22介導(dǎo)的活性氧損傷和病原菌的防御反應(yīng)被AtCPK4、CPK5、CPK6和CPK11共同調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，茶樹響應(yīng)茶餅病病原菌侵染的過程中KEGG代謝通路富集顯示，在植物病原互作代謝通路中與Ca2+相關(guān)的CNGCs、CDPK、CaM等基因的表達(dá)量變化顯著，這與前人的研究結(jié)果一致。

Seifi等[33]提出，在植物與病原菌互作中，谷氨酸代謝與植物的防御策略密切相關(guān)。Kadotani等[34]的研究首次發(fā)現(xiàn)水稻根部用外源谷氨酸處理后，可提高植株對(duì)稻癌病的抗性。楊佳麗[35]研究發(fā)現(xiàn)L-谷氨酸不論是采前噴灑還是采后處理的方式均可有效提高果實(shí)對(duì)采后病原菌的抵御能力。本研究發(fā)現(xiàn)氮代謝通路顯著富集，其中谷氨酸合成酶顯著上調(diào)表達(dá)，谷氨酸是否也參與了茶樹對(duì)抗病原菌還有待進(jìn)一步的研究。

相關(guān)研究顯示，當(dāng)植物受到病原菌侵染時(shí)，在植物與病原菌互作的過程中轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。目前，C2H2、AP2-ERF、WRKY和MYB等與植物抗病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子已有較多報(bào)道，何蘭蘭等[36]發(fā)現(xiàn)，棉花在受到枯萎病菌誘導(dǎo)后，AP2-EREBP亞族轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)量明顯增加，并且抗病品種顯著高于感病品種。Zhao等[37]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AP2-EREBP轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)χ参锟够颐共【哂姓蛘{(diào)節(jié)功能。MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物與病原菌互作過程中是正調(diào)控因子，能夠通過調(diào)控細(xì)胞程序性死亡或激活植物的防御反應(yīng)來增強(qiáng)植物抵抗病原菌的能力[38]。McHale等[39]發(fā)現(xiàn)，煙草的MYB家族基因參與茉莉酸調(diào)控的防御反應(yīng)，通過間接調(diào)控下游基因的沉默和過量表達(dá)來減輕病害威脅。Tian等[40]發(fā)現(xiàn)馬鈴薯C2H2鋅指蛋白基因在受到致病疫霉感染后其表達(dá)量增加。Zhang等[41]發(fā)現(xiàn)煙草C2H2鋅指蛋白基因被沉默時(shí)核盤菌SScut蛋白誘導(dǎo)的煙草免疫反應(yīng)被抑制。AbuQamar等[42]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)5個(gè)C3H型鋅指蛋白，其中發(fā)生突變后，對(duì)灰葡萄孢菌的敏感性增加。Guo等[43]從鹽脅迫誘導(dǎo)的棉花植株中克隆出來一個(gè)C3H轉(zhuǎn)錄因子基因，當(dāng)基因在煙草中過量表達(dá)時(shí)，煙草對(duì)鹽脅迫的耐受力增強(qiáng)，而且對(duì)病原菌R.solani產(chǎn)生了較高的抗性。Mayrose等[44]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌病害侵染番茄時(shí)，GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族中有6條基因上調(diào)表達(dá)，當(dāng)沉默基因時(shí)，番茄對(duì)細(xì)菌病害的抵抗能力降低。上述研究表明轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病過程中的重要性，與本研究中茶樹在被茶餅病病原菌侵染后AP2-EREBP、MYB、C2H2、C3H、GRAS、bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子全部上調(diào)表達(dá)的結(jié)果互相印證。

本研究通過對(duì)感染茶餅病的茶樹葉片和未感病茶樹葉片的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)情況進(jìn)行分析，篩選出差異表達(dá)基因359條，其中有248條上調(diào)表達(dá)，111條下調(diào)表達(dá)。差異基因的GO功能富集分析顯示，生物學(xué)過程中倍半萜烯生物合成過程（Sesquiterpenoid biosynthetic process）條目、細(xì)胞組分中細(xì)胞壁（Cell wall）條目、分子功能中倍半萜烯合成酶活性（Esquiterpene synthase activity）條目的富集程度最高；KEGG富集分析顯示，單萜生物合成（Monoterpenoid biosynthesis）通路、卟啉和葉綠素代謝（Porphyrin and chlorophyll metabolism）通路、核糖體（Ribosome）通路、氮代謝（Nitrogen metabolism）通路、雙萜生物合成（Diterpenoid biosynthesis）通路、植物病原互作（Plant-pathogen interaction）通路被顯著性富集。這些顯著性富集的功能和代謝通路大多數(shù)與植物抗病相關(guān)，并且上調(diào)的差異表達(dá)基因明顯多于下調(diào)，同時(shí)，茶樹在響應(yīng)茶餅病侵染后，激活了AP2-EREBP、MYB、C2H2、C3H、GRAS、bHLH等大量與抗病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子高表達(dá)。本研究為挖掘茶樹抗病基因、進(jìn)一步研究茶樹抗病分子機(jī)制以及茶樹對(duì)茶餅病抗性育種提供了豐富的信息和重要的理論依據(jù)。

[1] 蒲國濤, 張錫友, 胡春學(xué), 等. 茶樹茶餅病防治研究進(jìn)展[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 61(5): 79-81. Pu G T, Zhang X Y, Hu C X, et al. Research advances in management of tea blister blight [J]. Shaanxi Journal of Agricultural Sciences, 2015, 61(5): 79-81.

[2] 陳宗懋. 茶樹病害的診斷和防治[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1990. Chen Z M. Diagnosis and prevention of tea tree diseases [M]. Shanghai: Shanghai Scientific & Technical Publishers, 1990.

[3] 鄭國建, 高海燕. 我國茶葉產(chǎn)品質(zhì)量安全現(xiàn)狀分析[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào), 2015, 6(7): 2869-2872. Zheng G J, Gao H Y. The status analysis of tea quality safety in China [J]. Journal of Food Safety & Quality, 2015, 6(7): 2869-2872.

[4] 譚榮榮, 毛迎新, 龔自明. 茶餅病的發(fā)生規(guī)律及病原菌的生物學(xué)特性研究[J], 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 54(20): 5027-5030. Tan R R, Mao Y X, Gong Z M. Studies on the occurrence law of tea blister blight and biological characteristics ofMassee [J]. Hubei Agricultural Sciences, 2015, 54(20): 5027-5030.

[5] 智亞楠, 陳利軍, 史洪中, 等. 茶樹茶餅病的綜合防治研究進(jìn)展[J]. 信陽農(nóng)林學(xué)院學(xué)報(bào), 2018, 28(1): 98-100. Zhi Y N, Chen L J, Shi H Z, et al. Research advances in integrated management of tea blister blight [J]. Journal of Xinyang Agriculture and Forestry University, 2018, 28(1): 98-100.

[6] 趙曉珍, 王勇, 任亞峰, 等. 茶餅病病原—侵染茶樹葉片過程的形態(tài)學(xué)觀察[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2018, 34(5): 117-122. Zhao X Z, Wang Y, Ren Y F, et al. The morphology observation of infection process for the pathogenof tea blister blight against tea leaf [J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2018, 34(5): 117-122.

[7] 郭春秋, 王文龍, 吳娜. 茶餅病菌的分離培養(yǎng)及其刺激作用[J]. 吉首大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2005, 26(4): 103-108. Guo C Q, Wang W L, Wu N. Culture of()and its stimulating effects [J]. Journal of Jishou University(Natural Sciences Edition), 2005, 26(4): 103-108.

[8] Tian L, Shi S, Nasir F, et al. Comparative analysis of the root transcriptomes of cultivated and wild rice varieties in response toinfection revealed both common and species-specific pathogen responses [J]. Rice, 2018, 11(1): 26. doi: 10.1186/s12284-018-0211-8.

[9] Windram O, Madhou P, McHattie S, et al.defense against: chronology and regulation deciphered by high-resolution temporal transcriptomic analysis [J]. The Plant Cell, 2012, 24(9): 3530-3557.

[10] Smith J E, Mengesha B, Tang H, et al. Resistance toininvolves widespread transcriptional reprogramming [J]. BMC Genomics, 2014, 15(1): 334. doi: 10.1186/1471-2164-15-334.

[11] Li X, Zhu L, Tu L, et al. Lignin metabolism has a central role in the resistance of cotton to the wilt fungusas revealed by RNA-Seq-dependent transcriptional analysis and histochemistry [J]. Journal of Experimental Botany, 2011, 62(15): 5607-5621.

[12] Ke X, Yin Z, Song N, et al. Transcriptome profiling to identify genes involved in pathogenicity ofon apple tree [J]. Fungal Genetics and Biology, 2014, 68(7): 31-38.

[13] Wu J, Zhang Y, Zhang H, et al. Whole genome wide expression profiles ofgrape responding to downy mildew by using Solexa sequencing technology [J]. BMC Plant Biology, 2010(10): 234. doi: 10.1186/1471-2229-10-234.

[14] Wang Y, Zhou Z, Gao J, et al. The mechanisms of maize resistance toby comprehensive analysis of RNA-seq data [J]. Front Plant Scienec, 2016(7): 1654. doi: 10.3389/fpls.2016.01654.

[15] Serrazina S, Santos C, Machado H, et al. Castanea root transcriptome in response tochallenge [J]. Tree Genetics & Genomes, 2015(11): 6. doi: 10.1007/s11295-014-0829-7.

[16] Faino L, de Jonge R, Thomma B.P.. The transcriptome of-infecteddetermined by deep RNA sequencing [J]. Plant Signaling & Behavior, 2012, 7(9): 1065-1069.

[17] 王玉春. 中國茶樹炭疽菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究及茶樹咖啡堿抗炭疽病的作用[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2016. Wang Y C. Phylogenetics ofspecies isolated fromin China and effects of caffeine in tea plant resistance to anthracnose [D]. Yangling: Northwest A&F University, 2016.

[18] 冉隆洵, 玉香甩, 曾莉, 等. 云南大葉種茶樹茶餅病發(fā)生及防治研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2009, 22(3): 651-654. Ran L X, Yu X S, Ceng L, et al. Occurrence and control ofMassee on large-leaf variety tea plants in Menghai tea growing area [J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2009, 22(3): 651-654.

[19] 李向陽, 齊普應(yīng), 陳凱, 等. 幾種生物農(nóng)藥對(duì)高海拔茶區(qū)茶餅病的防效試驗(yàn)初報(bào)[J]. 茶葉學(xué)報(bào), 2017, 58(4): 201-203. Li X Y, Qi P Y, Chen K, et al. A preliminary study on biopesticides for controllingMassee at high altitude tea plantations [J]. Acta Tea Sinica, 2017, 58(4): 201-203.

[20] 魏朝霞, 唐嘉義. 4種生物農(nóng)藥對(duì)茶餅病的防效試驗(yàn)[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(3): 98-100. Wei C X, Tang J Y. Control effect of four biological pesticides on[J]. Guizhou Agricultural Sciences, 2011, 39(3): 98-100.

[21] 吳全聰, 陳方景, 雷永宏, 等. 麗水市茶餅病發(fā)生及影響因子分析[J]. 茶葉科學(xué), 2013, 33(2): 131-139. Wu Q C, Chen F J, Lei Y H, et al. Analysis on the occurrence and its influencing factors of tea blister blight in Lishui city [J]. Journal of Tea Science, 2013, 33(2): 131-139.

[22] 王紹梅, 宋文明. 茶餅病的發(fā)生規(guī)律與綜合防治[J]. 云南農(nóng)業(yè)科技, 2012(4): 45-46. Wang S M, Song W M. The occurrence law of tea blister blight and its comprehensive [J]. Yunnan Agricultural Science and Technology, 2012(4): 45-46.

[23] Cantu D, Vicente A, Labavitch J, et al. Strangers in the matrix: plant cell walls and pathogen susceptibility [J]. Trends in Plant Science, 2008, 13(11): 610-617.

[24] Underwood W, Somerville S. Focal accumulation of defences at sites of fungal pathogen attack [J]. Journal of Experimental Botany, 2008, 59(13): 3501-3508.

[25] Schulze-Lefert P. Knocking on the heaven’s wall: pathogenesis of and resistance to biotrophic fungi at the cell wall [J]. Current Opinion in Plant Biology, 2004, 7(4): 377-383.

[26] Lipka V, Dittgen J, Bednarek P, et al. Pre- and postinvasion defenses both contribute to nonhost resistance in[J]. Science, 2005, 310(5751): 1180-1183.

[27] 郭艷玲, 張鵬英, 郭默然, 等. 次生代謝產(chǎn)物與植物抗病防御反應(yīng)[J]. 植物生理學(xué)報(bào), 2012, 48(5): 429-434. Guo Y L, Zhang P Y, Guo M R, et al. Secondary metabolites and plant defence against pathogenic disease [J]. Plant Physiology Journal, 2012, 48(5): 429-434.

[28] Ahuja I, Kissen R, Bones A. Phytoalexins in defense against pathogens [J]. Trends in Plant Science, 2012, 17(2): 73-90.

[29] Lecourieux D, Lamotte O, Bourque S, et al. Proteinaceous and oligosaccharidic elicitors induce different calcium signatures in the nucleus of tobacco cells [J]. Cell Calcium, 2005, 38(6): 527-538.

[30] Dodd A, Kudla J, Sanders D. The language of calcium signaling [J]. Annual Review of Plant Biology, 2010, 61(4): 593-620.

[31] Yamakawa H, Mitsuhara I, Ito N, et al. Transcriptionally and post-transcriptionally regulated response of 13 calmodulin genes to tobacco mosaic virus-induced cell death and wounding in tobacco plant [J]. European Journal of Biochemistry, 2001, 268(14): 3916-3929.

[32] Lu D, Wu S, Gao X, et al. A receptor-like cytoplasmic kinase, BIK1, associates with a flagellin receptor complex to initiate plant innate immunity [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, 107(1): 496-501.

[33] Seifi H, Van Bockhaven J, Angenon G, et al. Glutamate metabolism in plant disease and defense: friend or foe? [J]. Molecular Plant-microbe Interactions, 2013, 26(5): 475-485.

[34] Kadotani N, Akagi A, Takatsuji H, et al. Exogenous proteinogenic amino acids induce systemic resistance in rice [J]. BMC Plant Biology, 2016, 16(1): 60. doi: 10.1186/s12870-016-0748-x.

[35] 楊佳麗. L-谷氨酸對(duì)果實(shí)抗性的誘導(dǎo)作用及其相關(guān)機(jī)理研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2017. Yang J L. Effect of L-glutamate on inhibiting postharvest diseases by inducing resistance in fruit and the possible defense mechanisms involved [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2017.

[36] 何蘭蘭, 柴蒙亮, 韓澤剛, 等. 棉花抗枯萎病相關(guān)ERF-B3亞組轉(zhuǎn)錄因子的克隆與表達(dá)[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2013, 33(12): 2375-2381. He L L, Cai M L, Han Z G, et al. Cloning and expression of ERF-B3 subgroup transcription factor related to resistantf. sp.in cotton [J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2013, 33(12): 2375-2381.

[37] Zhao Y, Wei T, Yin K, et al.RAP2.2 plays an important role in plant resistance toand ethylene responses [J]. New Phytologist, 2012, 195(2): 450-460.

[38] Raffaele S, Rivas S, Roby D. An essential role for salicylic acid in AtMYB30-mediated control of the hypersensitive cell death program in Arabidopsis [J]. FEBS Letters, 2006, 580(14): 3498-3504.

[39] McHale N, Koning R.regulates development of the adaxial mesophyll in nicotiana leaves [J]. The Plant Cell, 2004, 16(5): 1251-1262.

[40] Tian Z, Zhang Y, Liu J, et al. Novel potato C2H2-type zinc finger protein gene,, which responds to biotic and abiotic stress, plays a role in salt tolerance [J]. Plant Biology, 2010, 12(5): 689-697.

[41] Zhang H, Zhao T, Zhuang P, et al. NbCZF1, a novel C2H2-type zinc finger protein, as a new regulator of SsCut-induced plant immunity in[J]. Plant and Cell Physiology, 2016, 57(12): 2472-2484.

[42] AbuQamar S, Chen X, Dhawan R, et al. Expression profiling and mutant analysis reveals complex regulatory networks involved in Arabidopsis response toinfection [J]. The Plant Journal, 2006, 48(1): 28-44.

[43] Guo Y, Yu Y, Wang D, et al. GhZFP1, a novel CCCH-type zinc finger protein from cotton, enhances salt stress tolerance and fungal disease resistance in transgenic tobacco by interacting with GZIRD21A and GZIPR5 [J]. New Phytologist, 2009, 183(1): 62-75.

[44] Mayrose M, Ekengren S, Melech-Bonfil S, et al. A novel link between tomato GRAS genes, plant disease resistance and mechanical stress response [J]. Molecular Plant Pathology, 2006, 7(6): 593-604.

Transcriptome Analysis of the Tea Leaves (var.) Infected by Tea Blister Blight

SUN Yunnan, XU Yan*, RAN Longxun, JIANG Huibing, SONG Weixi, XIA Lifei, CHEN Linbo, LIANG Mingzhi*

Tea Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yunnan Engineering Research Center of Tea Germplasm Innovation and Matching Cultivation/Yunnan Provincial Key Laboratory of Tea Science, Menghai 666201, China

IlluminaHiSeq2500, a high-through transcriptome sequencing technology, was applied for transcriptome analysis of tea leaves infected by tea blister blight. Through differential expression analysis, a total of 359 differentially expressed genes (DEGs）were identified after infection, of which 248 were up-regulated and 111 were down-regulated. With GO function annotation classifications, a total of 216 genes were divided into 122 function categories. The mainly involved functional categories included biological synthesis process, catalytic activity, cell process and many other physiological and biochemical processes.KEGG enrichment analysis showed that a total of 106 genes were annotated to 47 metabolic pathways, with monoterpenoid biosynthesis, porphyrin and chlorophyll metabolism, ribosome, nitrogen metabolism, diterpenoid biosynthesis, plant-pathogen interaction pathway significantly enriched. There were 32 differentially expressed transcription factors(TFs). Those TFs were classified into 16 families.qRT-PCR of randomly selected differentially expressed genes was used to validate transcriptome result, which showed high consistence.The result shows that tea tree response to pathogen infection is a complicated process. A number of genes were induced or suppressed. Disease-resistant transcription factors were highly activated and up-regulated.This study provided a theoretical basis for identifying tea resistance genes and potential molecular mechanism.

, tea blister blight,transcriptomics, different expression genes

S571.1；S435.711

A

1000-369X(2020)01-113-12

2019-04-02

2019-06-18

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31660224）、國家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2016YFD0200903）、國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-19）、云南省人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（2015HB105）

孫云南，男，助理研究員，主要從事茶樹生理生化方面的研究，sunyn2013@126.com。

liangmingzhi@126.com