王國強(qiáng)，馬紅芳，曾華輝，賈 媛，蘇運(yùn)芳，毛夢迪，劉保光，尚立芝*，張振強(qiáng)*

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；4.河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

【研究意義】豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)，由豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)引起仔豬和育肥豬的一種以嘔吐和水樣腹瀉為特征的高度接觸性腸道傳染病，其可感染各年齡段的豬，導(dǎo)致較高的發(fā)病率和死亡率，3 日齡以內(nèi)的哺乳仔豬感染后死亡率最高可達(dá)100 %，臨床變化和癥狀與豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV)、豬血凝性腦脊髓炎病毒(Porcine hemmagglutinatipg Encephalomyelitis Virus，PHEV) 及豬丁型冠狀病毒(Porcine Deltacorona Virus，PDCo V)極為相似[1]。該病于1971年在英格蘭首次被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，在比利時流行期間被確認(rèn)其病原為PEDV[2-4]。PEDV屬于尼多病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)的Ⅰ型成員，其基因組為約28 kb大小的單鏈正義RNA，可編碼4個結(jié)構(gòu)蛋白(S，E，M和N)和非結(jié)構(gòu)蛋白(1a，1ab和ORF3)[5]。從2010年下半年開始，我國全國范圍內(nèi)爆發(fā)PEDV，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在形態(tài)學(xué)、臨床變化和癥狀上，PEDV和TGEV、PHEV以及PDCo V極為相似，又很難做到鑒別區(qū)分。因此，實(shí)驗(yàn)室快速、準(zhǔn)確診斷PEDV對防控尤為重要，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)可以用來檢測組織和糞便的病料，其便捷、快速、準(zhǔn)確，靈敏性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等特點(diǎn)，成為PEDV檢測的首選?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自1990年代初以來，聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ，PCR)被廣泛用作診斷工具，改變了微生物診斷方法，尤其是RT-PCR的使用徹底改變了RNA病毒的診斷檢測方法，可對各種樣品中的RNA進(jìn)行快速，特異和靈敏的檢測。隨著RT-PCR分子診斷技術(shù)的迅猛發(fā)展，擁有出色的質(zhì)量控制或標(biāo)準(zhǔn)對于確保精確和排除不正確的結(jié)果顯得尤其重要，對具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、以及可以全程監(jiān)控整個檢測過程的質(zhì)控品的需求日益增長，要求越來越高。相較于僅感染人或者人畜共患的病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，僅感染動物的病毒類核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究明顯滯后[6]。用來作為RNA病毒檢測的質(zhì)控品目前主要有三類，一是全病毒顆粒(活病毒、滅活病毒或陽性動物病料血清或組織)，其雖可以全程監(jiān)控病毒核酸裂解、提取和擴(kuò)增檢測的全過程，但成本高，稀缺陽性材料難以大量獲取，存在生物安全等問題[7]；二是裸露的RNA，其制備簡單，可以精確定值，安全性好，但是環(huán)境中到處都是RNase，極易降解；三是包封目標(biāo)RNA的假病毒顆粒，其在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上與天然病毒類似，但不具有感染性，高度穩(wěn)定，可實(shí)現(xiàn)RNA病毒核酸檢測的全程監(jiān)控，是一種理想的質(zhì)控品[8]。MS2噬菌體具有在體外利用自身基因組中成熟酶蛋白基因(A)、衣殼蛋白基因(CP)和包裝位點(diǎn)基因(PAC)，將插入其下游的外源RNA 的cDNA序列組裝形成病毒樣顆粒(Virus-like Particle, VLPs)，也被稱為裝甲RNA(Armored RNA)[9-10]。通過基因工程手段構(gòu)建含MS2外殼蛋白基因、PAC位點(diǎn)基因以及外源待測核酸序列的原核表達(dá)載體，很容易在大腸桿菌中大量表達(dá)，在體外形成包封待測RNA的VLPs作為質(zhì)控品?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究選取PEDV基因組中保守的N蛋白基因(155 bp)作為靶檢測序列，采用分子克隆方法將該保守序列插入原核載體pET28a/CP(前期構(gòu)建，包含MS2噬菌體外殼蛋白CP基因和PAC位點(diǎn)基因)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a/CP/PEDV，重組質(zhì)粒在大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)，純化，得到了CP 蛋白，其經(jīng)過透射電鏡進(jìn)行物理表征，顯示在體外自組裝形成了VLPs。純化的VLPs用核酸酶充分消化殘留的DNA和RNA后，提取RNA，通過熒光定量PCR檢測，證明VLPs包封了外源的PEDV靶序列，形成了盔甲RNA?？識NA耐RNase，具有良好的穩(wěn)定性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】制備的盔甲RNA可以作為PEDV RT-PCR檢測的質(zhì)控品，其安全無污染，可以做到從核酸提取到擴(kuò)增檢測的全程監(jiān)控，為PEDV的準(zhǔn)確快速診斷和防控提供支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株、重組質(zhì)粒和主要試劑 克隆菌株DH5α，表達(dá)菌株BL(DE3)，重組質(zhì)粒pET28a(+)/CP(包含噬菌體MS2衣殼蛋白CP基因和PAC位點(diǎn)基因)為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建和保存；限制性內(nèi)切酶BamH I-HF和HindΙΙΙ-HF、T4 DNA連接酶購自NEB(北京)，Protein Marker購自北京索萊寶科技有限公司；RNAiso Plus核酸提取試劑、PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑、Probe qPCR Mix熒光探針PCR檢測試劑購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；Benzonase核酸酶購自Sigma公司；氯仿，異丙醇等其它化學(xué)試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 引物 根據(jù)NCBI上PEDV/MEX/MICH/01/2013株(GenBank:MH006957.1)，選取N蛋白基因保守區(qū)序列，通過引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5和https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/設(shè)計(jì)引物和探針序列，探針5’用熒光報(bào)告基團(tuán)FAM修飾，3’用淬滅基團(tuán)BHQ1修飾，上游和下游引物分別加上BamH I和HindΙΙΙ酶切位點(diǎn)。引物和探針序列見表1，引物、探針和pUC57載體(攜帶有PEDV N蛋白基因中155 bp靶序列)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成和構(gòu)建。

表1 RT-PCR中用到的引物和探針序列

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 重組載體構(gòu)建 以pUC57為模板，PEDV-F和PEDV-R為引物，擴(kuò)增PEDV N蛋白基因靶序列。用BamHⅠ和HindΙΙΙ 分別雙酶切質(zhì)粒pET28a(+)/CP(攜帶有MS2噬菌體外殼蛋白CP基因和PAC位點(diǎn)基因)和PCR擴(kuò)增的N蛋白基因靶序列，回收、連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。提取質(zhì)粒，通過雙酶切和測序進(jìn)行鑒定，結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命為pET28a(+)/CP-PEDV(表1)。

1.2.2 重組蛋白的表達(dá)與純化 測序正確的重組質(zhì)粒pET28a(+)/CP-PEDV轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)至OD600 nm值為0.5～0.7，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.1 mM，18 ℃振蕩誘導(dǎo)表達(dá)20 h。用0.01M PBS緩沖液重懸菌體，超聲破碎，離心收集上清。上清加入30 %的飽和硫酸銨，4 ℃攪拌30 min，離心收集沉淀，PBS重懸沉淀后用2 L PBS緩沖液攪拌透析除去硫酸銨。透析后樣品過濾后用Sephacryl s-1000凝膠過濾層析柱純化。

1.2.3 純化蛋白的物理表征 硫酸銨沉淀和凝膠過濾層析純化的目的蛋白，在2 %磷鎢酸復(fù)染，100 kV 加速電壓條件下，通過JEM-1400(日本)透射電子顯微鏡，觀察顆粒粒徑和均一度。

1.2.4 病毒樣顆粒核酸酶消化和殘余核酸檢測 0.01M PB緩沖液透析凝膠過濾層析純化的病毒樣顆粒，取1 mL透析后得病毒樣顆粒加入終濃度為2 mM的Mg2+，同時加入300 U的Benzonase全能核酸酶，在37 ℃條件下消化8 h。取消化后的病毒樣顆粒100 μl，用RNAiso Plus裂解提取RNA，按照PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)說明書反轉(zhuǎn)錄得到CDNA。用Probe qPCR Mix熒光探針PCR檢測試劑檢測Benzonase核酸酶消化后病毒樣顆粒和病毒樣顆粒裂解反轉(zhuǎn)錄的CDNA。

1.2.5 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立和病毒樣顆粒核酸拷貝數(shù)確定 用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測量重組質(zhì)粒pET28a(+)/CP-PEDV的濃度，按照公式：樣品Copies/μl = 阿伏伽德羅常數(shù)(6.02×1023)拷貝數(shù)×濃度(ng/μl×10-9)/重組質(zhì)粒平均分子量(DNA length×660)，計(jì)算重組質(zhì)粒pET28a(+)/CP-PEDV原始拷貝數(shù)。對重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋，然后分別以各個稀釋度為模板，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時，用標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測以Benzonase核酸酶消化后病毒樣顆粒裂解反轉(zhuǎn)錄的CDNA，確定病毒樣顆粒核酸拷貝數(shù)。

1.2.6 病毒樣顆粒耐核糖核酸酶(Ribonuclease, RNase)攻擊檢測 將600 μl Benzonase核酸酶消化后的病毒樣顆粒，分為2組，每組3份，每份100 μl。其中一組(3份)直接進(jìn)行裂解和反轉(zhuǎn)錄，另一組(3份)在樣品裂解前加入10 μl 1mg/L的RNase，37 ℃條件下放置60 min后，再進(jìn)行裂解和反轉(zhuǎn)錄。最后，2份CDNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測，比較檢測結(jié)果。

1.2.7 病毒樣顆粒穩(wěn)定性檢測 取2 mL Benzonase核酸酶消化后的病毒樣顆粒，用0.22 μm針頭濾器無菌過濾，分為4份，每份500 μl。1份4 ℃放置，剩余3份37 ℃分別放置5、10、15 和20 d，然后進(jìn)行樣品裂解、反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR檢測，比較其Ct值變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體構(gòu)建和目的蛋白的表達(dá)、純化

PCR擴(kuò)增的PEDV N蛋白基因靶序列，通過雙酶切插入到質(zhì)粒pET28a(+)/CP中MS2噬菌體CP基因和PAC位點(diǎn)基因的下游，雙酶切和測序結(jié)果均正確。重組質(zhì)粒pET28a(+)/CP-PEDV在大腸桿菌表達(dá)菌株中誘導(dǎo)表達(dá)，目的蛋白經(jīng)過硫酸銨和分子篩進(jìn)行純化，SDS-PAGE顯示純度達(dá)85 %以上(圖1-b)。

a：箭頭所指為目的蛋白峰；b：M，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：超聲破碎后上清；2：硫酸銨沉淀后重懸上清；3：凝膠過濾層析第一個流出峰濃縮后 a: The peak pointed by the arrow is the target protein; b: M, protein marker; Lane 1: Supernatant after sonication; Lane 2: Resuspension after precipitation of ammonium sulfate; Lane 3: The first peak of gel filtration chromatography

2.2 透射電鏡觀察病毒樣顆粒

純化的目的蛋白經(jīng)磷鎢酸染色，通過透射電鏡(150 000×)進(jìn)行觀察，目的蛋白在體外自組裝形成了大小均一，直徑約為23～28 nm的病毒樣顆粒(圖2)，符合MS2噬菌體直徑大小。

圖2 電鏡觀察病毒樣顆粒(盔甲RNA)的形狀及粒徑 Fig.2 Observation of the shape and size of virus-like particles (Armor RNA) by electron microscope

2.3 病毒樣顆粒核酸酶消化和殘余核酸檢測

為了完全除去純化的病毒樣顆粒含有的殘余核酸(重組質(zhì)粒pET28a(+)/CP-PEDV和大腸桿菌基因組)對后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成的影響，純化的VLPs經(jīng)Benzonase核酸酶消化，消化后通過熒光定量PCR檢測，結(jié)果顯示消化后樣品直接PCR，Ct值為38.76，說明殘余重組質(zhì)粒pET28a(+)/CP-PEDV已被徹底消化；而消化后的樣品，經(jīng)過裂解和RT-PCR檢測，Ct值為11.13，表明形成的VLPs包封了N蛋白基因靶序列，即形成盔甲RNA(圖3)。

圖3 核酸酶消化后病毒樣顆粒殘余核酸檢測Fig.3 Detection of residual nucleic acid of virus-like particles after nuclease digestion

2.4 病毒樣顆粒核酸拷貝數(shù)確定

通過公式計(jì)算重組質(zhì)粒pET28a(+)/CP-PEDV的濃度為1.5×107copies/μl，重組質(zhì)粒10倍系列稀釋后，選取10-2、10-3、10-4、10-5和10-6稀釋度建

立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以質(zhì)粒系列稀釋度為橫坐標(biāo)，PCR擴(kuò)增的閾循環(huán)數(shù)(threshold cycle, Ct)為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)，其回歸方程為Y= -3.315X+42.424，斜率為-3.315，相關(guān)系數(shù)R2= 0.998，表明PCR擴(kuò)增效率高，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，樣品濃度對數(shù)值與閾循環(huán)數(shù)之間具有良好的相關(guān)性。病毒樣顆粒稀釋100倍后熒光定量PCR檢測，其Ct值為17.52，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，病毒樣顆?？截悢?shù)為2.4×106copies/μl。

a：擴(kuò)增曲線；b：標(biāo)準(zhǔn)曲線 a: Amplification curve; b: Standard curve

2.5 病毒樣顆粒耐RNase攻擊實(shí)驗(yàn)

用RNase處理VLPs后與未處理對照組，平行進(jìn)行樣品裂解、RNA提取、RT-PCR后，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示：RNase處理前后，目的條帶亮度基本一致(圖5)，說明制備的病毒樣顆粒能夠抵抗RNase的降解作用。

M：核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、3：RNase未處理；4、5、6：RNase 37 ℃處理60 minM: Nucleic acid molecular weight standard; 1, 2, 3: RNase untreated; 4, 5, 6: RNase treated at 37 ℃ for 60 min

2.6 病毒樣顆粒的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

過濾除菌的病毒樣顆粒在37 ℃條件下放置5、10和15 d，RT-PCR檢測其Ct值和4 ℃基本一致，沒有差異，37 ℃條件下放置20 d的Ct值升高(圖6)，從Ct值變化趨勢可看出，制備的盔甲RNA在37 ℃條件下至少可以儲存15 d，具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖6 病毒樣顆粒(盔甲RNA)的熱穩(wěn)定性檢測 Fig.6 Detection of thermal stability of virus-like particles (Armor RNA)

3 討 論

PEDV是目前危害養(yǎng)豬業(yè)最重要的病原體之一，其主要危害仔豬(3～10 日齡)，導(dǎo)致仔豬嚴(yán)重水樣腹瀉和脫水死亡，部分地區(qū)的豬場仔豬腹瀉樣品中PEDV核酸檢出率甚至高達(dá)80 % 以上[11]，快速準(zhǔn)確的診斷對PEDV的防控有重要意義。相較于常規(guī)的病原學(xué)檢測、血清學(xué)檢測以及病原的快速檢測(免疫膠體金層析)等方法，以核酸擴(kuò)增為基礎(chǔ)的分子檢測技術(shù)，因其具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速高效、定量準(zhǔn)確和高通量等優(yōu)點(diǎn)，在動物疾病診斷中發(fā)揮了巨大作用[12]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增[13]、巢氏PCR技術(shù)[14]、多重PCR技術(shù)[15]、SYBR Green I 熒光定量PCR[16]、TaqMan熒光定量PCR[17]等核酸檢測方法均用于PEDV的快速檢測，效果良好。PEDV基因組中的M基因和N基因保守性非常強(qiáng)，常作為PEDV診斷的候選基因，但不能區(qū)分經(jīng)典毒株和變異毒株[11]；致弱毒株的ORF3基因有51個堿基缺失，并且造成病毒毒力減弱，可以作為鑒別強(qiáng)弱毒株的依據(jù)[18]，S 基因是PEDV 毒株毒力和進(jìn)化的特征性基因，之前也有學(xué)者報(bào)道了通過S基因區(qū)分變異毒株的RT-PCR 方法[19-20]。

雖然病毒核酸擴(kuò)增檢測成為新發(fā)再發(fā)病毒類疾病快速準(zhǔn)確診斷的有效方法，但影響試驗(yàn)過程的因素太多：核酸擴(kuò)增過程本身的高靈敏度，些許的氣溶膠就會導(dǎo)致假陽性無法控制；實(shí)驗(yàn)操作人員的操作失誤或隨機(jī)誤差；核酸提取抑制物的殘留；儀器控溫不精確和空間的差異；引物和探針設(shè)計(jì)的不合理；逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增效率差；試劑良莠不齊等，這些都會造成最終結(jié)果的偏差，甚至結(jié)果不可使用[21]。因此，核酸擴(kuò)增檢測特別是RNA病毒的核酸擴(kuò)增檢測，必須使用質(zhì)控品，對檢測的全過程進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制才能保證結(jié)果的可靠性。能做到穩(wěn)定可靠、全過程監(jiān)控(核酸提取、反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增分析)、安全無生物危害、易于制備的VLPs(盔甲RNA)無疑是理想的質(zhì)控品[22]。利用MS2噬菌體外殼蛋白在體外可以將PAC位點(diǎn)下游的核酸包封成VLPs，HCV、HEV、HIV、EV71、流感病毒以及馬動脈炎病毒等多種RNA病毒質(zhì)控品都已成功制備[21]。

本實(shí)驗(yàn)選取PEDV基因組中保守性強(qiáng)的N蛋白基因作為靶基因，插入到含有MS2噬菌體外殼蛋白基因和PAC位點(diǎn)基因下游，構(gòu)建重組載體，通過原核表達(dá)系統(tǒng)，在體外成功得到了包封靶基因的盔甲RNA。在本研究構(gòu)建重組載體過程中，將MS2噬菌體外殼蛋白CP基因和PAC位點(diǎn)基因插入原核載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒和工程菌株。該工程菌株在低溫誘導(dǎo)條件下，電鏡觀察和熒光RT-PCR檢測，外殼蛋白自組裝且包封靶序列形成了盔甲RNA。為了消除純化的VLPs殘余的大腸桿菌基因組以及重組質(zhì)粒核酸，實(shí)驗(yàn)前期使用了DNase I和RNase 37 ℃進(jìn)行消化，但是效果并不理想，仍有殘余的重組質(zhì)粒，后期使用Benzonase全能核酸酶，可以很好消除殘余核酸影響。本研究獲得的盔甲RNA可以抵抗一定RNase的降解，無菌過濾后，在37 ℃條件下可以穩(wěn)定保存15 d，是一個理想的RT-PCR質(zhì)控品，可為PEDV的快速準(zhǔn)確檢測提供技術(shù)支持。

4 結(jié) 論

MS2噬菌體外殼蛋白可以在體外包封外源RNA(PEDV N蛋白基因靶序列)，并形成熱穩(wěn)定性好，耐Rnase攻擊的病毒樣顆粒(盔甲RNA)，該盔甲RNA可從RNA提取、反轉(zhuǎn)錄到擴(kuò)增檢測全程進(jìn)行監(jiān)控，可作為RT-PCR檢測豬流行性腹瀉病毒的質(zhì)控品，從而保證檢測結(jié)果的正確性。其制備方法具有通用性，可為其它RNA病毒核酸檢測質(zhì)控品的制備提供參考。