曾申昕，黃文海，沈正榮

（杭州醫(yī)學(xué)院 浙江省神經(jīng)精神疾病藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310013）

自然界已進(jìn)化出高效的酶系統(tǒng)來(lái)調(diào)控泛素化和隨后的蛋白質(zhì)降解。如果這些酶系統(tǒng)能夠被人為利用和重新靶向以達(dá)到疾病的治療目的，其潛力將是巨大的。蛋白降解靶向嵌合體（proteolytic targeting chimera，PROTAC）技術(shù)正是一種人為化學(xué)誘導(dǎo)靶蛋白（protein of interest，POI）多聚泛素化，最終通過(guò)蛋白酶體通路靶向降解POI 的新興技術(shù)，為疾病的治療提供了新的策略。PROTAC 是由靶蛋白配體和E3 泛素連接酶配體通過(guò)適當(dāng)?shù)倪B接鏈組成的雙功能分子，能夠同時(shí)招募靶蛋白和E3 泛素連接酶誘導(dǎo)靶蛋白泛素化降解，其獨(dú)特的作用模式具有廣泛的應(yīng)用前景和發(fā)展空間，備受學(xué)術(shù)界和制藥工業(yè)界的關(guān)注，在克服耐藥性以及傳統(tǒng)“不可成藥”（undruggable）靶點(diǎn)方面有巨大的潛力，更是一種全新的藥物研發(fā)策略[1]。

1 PROTAC 的降解機(jī)制及特點(diǎn)

通常，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）和自噬/溶酶體2 條途徑進(jìn)行降解[2]。2004 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)被授予Ciechanover、Hershko 和Rose 這3 位科學(xué)家，以表彰他們?cè)诜核卣{(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解方面的卓越貢獻(xiàn)，此后泛素介導(dǎo)的蛋白降解機(jī)制被穩(wěn)步揭曉。蛋白質(zhì)泛素化是一種多功能的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過(guò)程，影響著細(xì)胞的分化、增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡、基因表達(dá)、信號(hào)傳遞等整個(gè)生命過(guò)程。泛素化過(guò)程可以簡(jiǎn)單地概括為：泛素標(biāo)簽首先與E1 泛素激活酶結(jié)合，然后轉(zhuǎn)移到E2 泛素結(jié)合酶上，隨后依賴于一個(gè)大家族的銜接蛋白（E3 泛素連接酶）將其泛素傳遞到靶蛋白上。被泛素標(biāo)記的蛋白質(zhì)被蛋白酶體特異性識(shí)別并降解[3]。蛋白酶體是細(xì)胞內(nèi)的一種復(fù)合物，主要負(fù)責(zé)將特異性泛素化的蛋白質(zhì)降解[4]（見(jiàn)圖1）。

圖 1 泛素化過(guò)程示意圖Figure 1 Schematic diagram of ubiquitination process

PROTAC 分子由靶蛋白配體、連接鏈和E3 泛素連接酶配體3 部分組成，是一種能特異性結(jié)合靶蛋白同時(shí)招募E3 泛素連接酶并使POI 多聚泛素化、最終通過(guò)蛋白酶體系統(tǒng)降解的雙功能分子[5]。PROTAC 分子泛素化標(biāo)記POI 并促使蛋白降解后可與POI 解離并可在細(xì)胞內(nèi)循環(huán)利用，起到亞化學(xué)計(jì)量催化的效果，減少藥物的使用劑量從而減少體內(nèi)藥物暴露量，降低毒副作用[6]（見(jiàn)圖2）。

從作用模式來(lái)看，PROTAC 分子與傳統(tǒng)的抑制劑有著根本的區(qū)別。傳統(tǒng)的抑制劑是以占用驅(qū)動(dòng)（occupancy-driven）的作用模式，特異性結(jié)合于靶蛋白的空腔內(nèi)。這種模式需要較高的藥物濃度，以維持對(duì)靶蛋白的占用水平，進(jìn)而發(fā)揮藥理活性，獲得臨床應(yīng)用價(jià)值[7]。相反，PROTAC 是事件驅(qū)動(dòng)（event-driven）的作用模式，其不受均衡占有率（equilibrium occupancy）的影響，在較低濃度就能夠?qū)崿F(xiàn)超90%的靶蛋白降解，這對(duì)占用驅(qū)動(dòng)模式是難以實(shí)現(xiàn)的[8]。

圖 2 PROTAC 作用模式Figure 2 Mode of action of PROTAC

2 PROTAC 重要發(fā)展歷程

早在2001 年，耶魯大學(xué)Craig M. Crews 教授團(tuán)隊(duì)和加州理工大學(xué)的Raymond J. Deshaies 教授首次提出PROTAC 這一概念并經(jīng)過(guò)一系列的概念驗(yàn)證（proof of concept）報(bào)道了首個(gè)PROTAC 分子——Protac-1（1），其可靶向降解甲硫氨酰氨肽酶-2（MetAp-2）[9]。隨后繼續(xù)對(duì)其深入研究，不斷擴(kuò)大應(yīng)用范圍并成功降解雌激素受體（ER）和雄激素受體（AR）[10]。

基于希佩爾·林道（Von Hippel Lindau，VHL）E3 泛素連接酶的多肽類PROTAC 于2004 年被首次報(bào)道[11]。這些早期基于多肽類的PROTAC 是源于轉(zhuǎn)錄因子低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）衍生的肽序列構(gòu)建的，HIF-1α 被脯氨酰羥化酶羥化后能與VHL 蛋白結(jié)合。隨后的大量研究工作發(fā)現(xiàn)了阻斷HIF-1α 和VHL 相互作用的小分子抑制劑[12]。X 射線衍射技術(shù)闡明了高效小分子抑制劑的結(jié)合模式。最初的HIF-1α 衍生肽被含有羥脯氨酸結(jié)構(gòu)的小分子取代，得到了高親和力和高特異性VHL 配體[12]。大量文獻(xiàn)研究表明，基于小分子的VHL-PROTAC 能有效降解雌激素相關(guān)受體（ERRα）[6]、AR[13]、激酶RIPK2[6]、BCR-ABL 融合蛋白[14-15]、含溴區(qū)結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)（BRD）4[16]、TBK1、跨膜酪氨酸激酶（EGFR、HER2 和c-Met）[17]、MEK[18]和TRIM24 蛋白[19]。

早期基于多肽的PROTAC 在體外驗(yàn)證以及作為生物化學(xué)分子工具具有一定的價(jià)值，然而由于細(xì)胞通透性、化學(xué)穩(wěn)定性以及成藥性方面的問(wèn)題，其在體內(nèi)的進(jìn)一步研究受到一定程度限制。因此，非肽類PROTAC 在該領(lǐng)域的研發(fā)至關(guān)重要。

2008 年，耶魯大學(xué)Craig M. Crews 教授團(tuán)隊(duì)首次合成了含有nutlins 的小分子PROTAC，成功地將AR 募集到鼠雙微體2（mouse double minute 2，MDM2）上，并作為E3 泛素連接酶觸發(fā)其泛素化和蛋白酶體降解[20]。MDM2 是一種主要靶向腫瘤抑制因子p53 的E3 泛素連接酶[21]。此外，Craig M. Crews 團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果表明，以idasanutlin 為MDM2配體，JQ1 為BRD4/BET 抑制劑組成的MDM2 誘導(dǎo)BRD4 泛素降解的A1874 化合物對(duì)靶蛋白BRD4 的降解率為98%，在納摩爾水平表現(xiàn)出較好的生物活性[22]。值得注意的是，該P(yáng)ROTAC 既能降解BRD4 又能穩(wěn)定p53，是關(guān)于E3 泛素連接酶配體和靶蛋白配體的協(xié)同抗增殖作用的首次報(bào)道。2019 年1 月，清華大學(xué)饒燏教授團(tuán)隊(duì)基于MDM2 的E3 泛素連接酶設(shè)計(jì)并合成了具有靶向降解作用的多腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP1）降解子[23]。

2010 年，Ito 等[24]揭示了沙利度胺致畸作用的分子靶點(diǎn)和主要原因——Cereblon 蛋白（CRBN）。沙利度胺及其衍生物來(lái)那度胺和泊馬度胺作為免疫調(diào)節(jié)藥物（IMiD）[25]已被批準(zhǔn)用于多發(fā)性骨髓瘤。在機(jī)制上，IMiD 靶向E3 泛素連接酶CUL4-RBX1-DDB1-CRBN（ 也 被 稱 為CUL4CRBN）。IMiD 與CRBN 結(jié)合，使得IKAROS 家族轉(zhuǎn)錄因子（IKZF1 和IKZF3）被募集到CRBN 上進(jìn)而泛素化降解[26]。2014 年，與沙利度胺和來(lái)那度胺結(jié)合的DDB1-CRBN 復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)得以解析[27]，從此，以CRBN 為靶點(diǎn)的IMiD 小分子和以各種蛋白質(zhì)為靶點(diǎn)的PROTAC 迅猛發(fā)展?，F(xiàn)已成功開(kāi)發(fā)出靶向BRD2/3/4[28]、FK506 結(jié) 合 蛋 白12（FKBP12）[29]、BCR-ABL 融合蛋白[30]、BRD9[31]、沉默信息調(diào)節(jié)因子2（Sirt2）[32]、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶9（CDK9）[33]、FMS 樣酪氨酸激酶3（FLT3）[34]、布魯頓酪氨酸激酶（BTK）[35]、間變性淋巴瘤激酶（ALK）[36]、周期蛋白依賴性激酶4/6（CDK4/6）[37]和組蛋白去乙?；?（HDAC6）[38]的小分子PROTAC。

另一種E3 泛素連接酶，細(xì)胞凋亡抑制蛋白1（cIAP1）也被用于PROTAC 的設(shè)計(jì)。2010 年，Hashimoto 課題組公開(kāi)了由甲基貝他定（methyl bestatin，MeBS）和全反式視黃酸（ATRA）組成的PROTAC，其中MeBS 可選擇性地結(jié)合到cIAP1的BIR3 結(jié)構(gòu)域（其RING 結(jié)構(gòu)域促進(jìn)自動(dòng)泛素化），維甲酸受體內(nèi)源性配體ATRA 能募集細(xì)胞內(nèi)維甲酸結(jié)合蛋白CRABP-1 和CRABP-2[39]。該項(xiàng)工作是首次基于cIAP1 的PROTAC 成功地誘導(dǎo)CRABP-1和CRABP-2靶蛋白泛素化蛋白酶體降解。通過(guò)用MV1 配體（即cIAP1/cIAP2/XIAP 配體）替換MeBS，可進(jìn)一步改進(jìn)PROTAC，實(shí)現(xiàn)cIAP1 和CRABP-2 這2 種蛋白同時(shí)敲除[40]。其他開(kāi)發(fā)的該類PROTAC 小分子還有SNIPER（specific and nongenetic IAP-dependent protein eraser），該小分子可靶向降解ERα[41]、BRD4[42]、轉(zhuǎn)錄相關(guān)酸性卷曲蛋白3（TACC3）[43]和BCR-ABL 融合蛋白[44]。

2017 年，Ciulli 教授領(lǐng)銜的科研團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道了PROTAC 分別與E3 泛素連接酶和靶蛋白受體形成的穩(wěn)定三元復(fù)合物共晶結(jié)構(gòu)[45]。實(shí)驗(yàn)證明，PROTAC 分子是通過(guò)中間連接鏈適當(dāng)?shù)卣郫B彎曲，讓其兩端分別深入兩受體疏水空腔內(nèi)部，拉近E3泛素連接酶與靶蛋白的距離，形成特異性的蛋白-蛋白相互作用，促進(jìn)靶蛋白的泛素化。該研究為后續(xù)的理性PROTAC 藥物分子設(shè)計(jì)奠定了基礎(chǔ)。

PROTAC 發(fā)展歷程中的重要事件見(jiàn)圖3。

表1 介紹了具有代表性的小分子PROTAC（2 ～ 31）。

圖 3 PROTAC 發(fā)展歷程重要事件Figure 3 Important events in the development of PROTAC

表 1 代表性小分子PROTACTable 1 Representative small molecular PROTACs

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

3 小分子PROTAC 新藥研發(fā)面臨的機(jī)遇、挑 戰(zhàn)及研究近況

PROTAC 技術(shù)問(wèn)世至今已經(jīng)走過(guò)近20 年的發(fā)展歷史，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)已有超過(guò)30 個(gè)靶點(diǎn)可以被PROTAC 分子泛素化降解[46]，展現(xiàn)出廣闊的疾病治療前景。自2013 年起，Arvinas、C4 Therapeutics、Kymera Therapeutics 等專注于PROTAC 分子開(kāi)發(fā)的公司相繼成立，默克、基因泰克、輝瑞、諾華、勃林格殷格翰等制藥巨頭也紛紛布局這一技術(shù)領(lǐng)域。制藥工業(yè)界的加入必將給PROTAC 帶來(lái)新的發(fā)展契機(jī)。2019 年3 月，Arvinas 公司宣布其開(kāi)發(fā)的首個(gè)用于治療前列腺癌的AR 降解劑ARV-110 進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT03888612）。2019 年10 月23日，Arvinas 公司公布了ARV-110 和ARV-471 的Ⅰ期臨床試驗(yàn)初始結(jié)果：口服PROTAC 對(duì)腫瘤患者具有良好的安全性和耐受性。ARV-110 是公開(kāi)報(bào)道的首個(gè)進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)的PROTAC 分子，標(biāo)志著PROTAC 技術(shù)的研究進(jìn)入新的階段。鑒于PROTAC的分子特點(diǎn)及其獨(dú)特的作用機(jī)制，PROTAC 技術(shù)在新藥研發(fā)及疾病治療中面臨著諸多機(jī)遇與挑戰(zhàn)[47]。

3.1 PROTAC 的機(jī)遇

3.1.1 有望克服耐藥性 腫瘤耐藥已成為當(dāng)前臨床治療面臨的主要挑戰(zhàn)。隨著新靶點(diǎn)和新型藥物發(fā)現(xiàn)技術(shù)不斷涌現(xiàn)，通過(guò)小分子藥物靶向致病蛋白或受體為腫瘤的治療提供了強(qiáng)有力的策略。特別是在過(guò)去的20 年里激酶抑制劑領(lǐng)域蓬勃發(fā)展，在臨床應(yīng)用中取得了驚人的效果，極大地改善了腫瘤患者的生活質(zhì)量，并延長(zhǎng)其生存期[48]。然而盡管靶向藥物的效果十分顯著，但患者在治療一段時(shí)間后往往會(huì)出現(xiàn)不同程度的耐藥，造成疾病復(fù)發(fā)。因此開(kāi)發(fā)新技術(shù)克服腫瘤耐藥是抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。

經(jīng)過(guò)近20 年的發(fā)展，PROTAC 在克服腫瘤耐藥性方面已獲得顯著性進(jìn)展[49]。2018 年Craig M. Crews課題組研發(fā)的靶向AR 的PROTAC 分子ARCC-4（32）可有效克服前列腺癌對(duì)恩扎魯胺的耐藥性（DC50= 5 nmol · L-1，Dmax= 98%）[50]。清華大學(xué)饒燏課題組開(kāi)發(fā)的PROTAC 分子P13I（33）可以同時(shí)降解野生型BTK（DC50= 9.2 nmol · L-1，Dmax= 89%）和對(duì)ibrutinib耐藥的C481S 突變的BTK（DC50= 30 nmol · L-1）[51]。該課題組開(kāi)發(fā)的第2 代PROTAC 小分子L18I（34）水溶性顯著提升且可降解不同C481 突變的BTK（DC50＜ 50 nmol·L-1）[52]。PROTAC 分 子GMB-475（35）不僅可以降解野生型BCR-ABL 還能降解特定突變的BCR-ABL[15]。GMB-475 是基于imatinib的新穎PROTAC 分子，在300 nmol · L-1下對(duì)K562和Ba/F3 細(xì)胞的BCR-ABL1 和c-ABL1 均有顯著降解作用。GMB-475 對(duì)BaF3（T315I 突變）的IC50達(dá)1.98 μmol · L-1，活性是imatinib 的20 倍，對(duì)G250E突變的細(xì)胞株IC50達(dá)0.37 μmol · L-1。在降解方面，GMB-475 可以完全降解G250 突變蛋白（DC50= 310 nmol · L-1），部分敲低BCR-ABL1 T315I 蛋白。PROTAC 技術(shù)不僅在克服腫瘤耐藥性方面獲得重大進(jìn)展，也有望被用于解決其他臨床疾病的耐藥性問(wèn)題。Priscilla L.Yang 課題組設(shè)計(jì)并合成了首個(gè)可有效降解病毒蛋白的PROTAC 分子——DGY-08-097（36）（DC50= 50 nmol · L-1）[53]。該研究工作成功證明可通過(guò)降解病毒蛋白的新策略解決病毒抑制劑的耐藥問(wèn)題。

3.1.2 提高靶向選擇性 在結(jié)構(gòu)優(yōu)化中，增加化合物對(duì)靶蛋白的選擇性是藥物研發(fā)的重要目標(biāo)。藥物在體內(nèi)的作用環(huán)境是復(fù)雜的，有許多潛在的因素會(huì)與之發(fā)生作用。蛋白質(zhì)、DNA、RNA、脂類、糖類、代謝物和其他小分子化合物都有可能與藥物相互作用[54]。在許多情況下，這種相互作用會(huì)導(dǎo)致意想不到的生化反應(yīng)，甚至是毒副作用。

CDK 是真核生物中保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)至關(guān)重要[55]。CDK 家族共有20 個(gè)亞型：CDK1、2、4 和6 負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞周期，CDK7 ～ 13 負(fù)責(zé)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄；CDK14 ～ 20 作用機(jī)制尚不清楚，但廣泛地調(diào)控各種細(xì)胞活動(dòng)[56]。CDK9 是轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)的重要調(diào)節(jié)因子，是腫瘤治療的一個(gè)有希望的靶點(diǎn)，特別是對(duì)于由轉(zhuǎn)錄失調(diào)引起的腫瘤[57]。Nathanael S. Gray 課題組通過(guò)研究SNS-032/CDK2 共晶結(jié)構(gòu)（PDB : 5D1J）[58]，設(shè)計(jì)合成了名為T(mén)HAL-SNS-032 的小分子PROTAC 化合物[33]。

3.1.3 可通過(guò)降解整個(gè)蛋白影響非激酶依賴型功能 在過(guò)去的幾十年發(fā)展中，酶抑制策略已被證明是許多傳統(tǒng)小分子藥物開(kāi)發(fā)的有效手段。但是對(duì)某些非激酶依賴活性的疾病難以發(fā)揮有效的藥理活性。

黏著斑激酶（FAK）是腫瘤入侵、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子，同時(shí)也是多種信號(hào)蛋白的激酶和支架[60]。盡管小分子FAK 抑制劑在臨床前和臨床研究中取得一定進(jìn)展[61]，但FAK 支架作用介導(dǎo)的許多基本功能仍然是激酶抑制劑所無(wú)法抑制的[61-62]。為克服激酶抑制劑難以靶向FAK 的缺點(diǎn)，Craig M. Crews課題組研制了高選擇性、高活性的FAK 降解化合物PROTAC-3（39，DC50= 3.0 nmol · L-1，Dmax= 99%）[63]。PROTAC-3 在FAK 激活以及FAK 介導(dǎo)的細(xì)胞遷移和入侵方面均優(yōu)于臨床候選化合物defactinib。其他作用于FAK 的代表性小分子PROTAC 還有FC-11（40）[64]和BI-3663（41，DC50= 27 nmol · L-1，Dmax= 95%）[65]。THAL-SNS-032（37）保持了對(duì)CDK1/CycB（IC50= 171 nmol · L-1）、CDK2/CycC（IC50= 62 nmol · L-1）、CDK7/CycH/MNAT1（IC50= 398 nmol · L-1）和CDK9 CycT1（4 nmol · L-1）的泛抑制活性。更有趣的是，THAL-SNS-032 在5 μmol · L-1時(shí)可以僅降解CDK9而對(duì)其他CDK 靶點(diǎn)幾乎沒(méi)有降解效果，說(shuō)明通過(guò)靶蛋白與E3 泛素連接酶之間的協(xié)同作用，PROTAC分子可以在小分子抑制劑的基礎(chǔ)上提高其選擇性。最近，饒燏課題組通過(guò)系統(tǒng)地考察PROTAC 連接鏈、連接鏈的成分、POI 配體以及親和力，發(fā)現(xiàn)了代表性化合物CP-10[59]。CP-10（38）是基于首個(gè)CDK4/6 的雙功能抑制劑palbocilid 的PROTAC，其僅對(duì)CDK6 表現(xiàn)出明顯的降解作用（DC50= 2.1 nmol · L-1）。該研究表明，通過(guò)引入PROTAC 技術(shù)可以將泛抑制劑轉(zhuǎn)變成選擇性降解劑，從而提高選擇性和靶向性。PROTAC 提供了同時(shí)阻斷FAK 激酶信號(hào)和支架能力的可能性。該研究證明了PROTAC 具有拓展藥物靶點(diǎn)空間和控制蛋白質(zhì)功能特別是非激酶依賴型功能（kinase-independent function）方面的潛力，而這些作用對(duì)于傳統(tǒng)的小分子抑制劑是不容易解決的。

3.1.4 有望降解“不可成藥”的靶點(diǎn) 傳統(tǒng)的小分子通過(guò)直接作用于靶蛋白表面具有一定深度的蛋白結(jié)合口袋（binding pocket）來(lái)調(diào)節(jié)蛋白功能。據(jù)統(tǒng)計(jì)，人類超過(guò)80%的蛋白屬于“不可成藥”靶點(diǎn)[66]。通?！安豢沙伤帯卑悬c(diǎn)蛋白表面平坦光滑，傳統(tǒng)小分子難以尋找到有效的結(jié)合位點(diǎn)（binding site）。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）是細(xì)胞表面受體向細(xì)胞核傳遞信號(hào)的轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員。STAT3 信號(hào)激活在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、代謝及抑制腫瘤免疫反應(yīng)等過(guò)程中扮演極其重要的作用[67]。STAT3 是人類腫瘤和其他疾病極具吸引力的治療靶點(diǎn)。STAT3 結(jié)構(gòu)特殊，缺乏傳統(tǒng)小分子抑制劑可以直接作用的結(jié)合口袋，因而直接影響小分子抑制劑的研發(fā)。盡管在過(guò)去的幾十年中有相關(guān)的直接抑制劑被報(bào)道，但效果不佳且缺乏特異性，目前臨床上尚無(wú)有效藥物[68]。王少萌課題組通過(guò)基于結(jié)構(gòu)的優(yōu)化策略從先前報(bào)道的STAT3 高親和力擬肽化合物CJ-887 出發(fā)，優(yōu)化得到SI-109。分析SI-109 與STAT3 的共晶結(jié)構(gòu)（PDB : 6NUQ）[69]，設(shè)計(jì)合成了STAT3 降解劑SD-36（42）（DC50= 60 nmol · L-1）[70]。該研究工作首次證明PROTAC 技術(shù)可以將“不可成藥”靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為“可成藥”（druggable）靶點(diǎn)，為后續(xù)PROTAC 技術(shù)在“不可成藥”靶點(diǎn)方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

RAS是癌癥中最為常見(jiàn)的突變癌基因，也是腫瘤發(fā)生的重要驅(qū)動(dòng)因素，約占所有癌癥的30%[71]。由于RAS 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要作用，其靶向治療已成為抗腫瘤研究的一個(gè)熱點(diǎn)。近年來(lái)，隨著針對(duì)K-RAS（G12C）突變蛋白的小分子藥物深入開(kāi)發(fā)，直接抑制RAS 的抑制劑取得了一定成功。然而，這些抑制劑對(duì)G12C 突變腫瘤的適用性仍非常有限。因此，RAS基因過(guò)去一度被認(rèn)為是“不可成藥”靶點(diǎn)[72]。目前已有學(xué)者報(bào)道了多種E3 泛素連接酶如Rabex-5[73]、亮氨酸拉鏈樣轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子因子1（LZTR1）[74]和β-TrCP[75]等參與RAS 的泛素化降解。近日，Eric S.和Nathanael S. Gray 課題組利用K-RAS 抑制劑通過(guò)連接鏈的優(yōu)化得到基于CRBN的PROTAC 分 子X(jué)Y-4-88（43）[76]。XY-4-88 可以誘導(dǎo)GFP-KRASG12C 降解。但是，對(duì)內(nèi)源性KRASG12C 不能起到降解作用。未來(lái)還需要進(jìn)一步探討PROTAC 在降解內(nèi)源性KRAS 方面的研究，為進(jìn)一步尋找更廣泛有效的靶向RAS 藥物帶來(lái)契機(jī)。

3.1.5 提供了一種新型的快速可逆的化學(xué)蛋白敲除方法

蛋白敲低策略是研究靶基因功能喪失后果的有效手段[77]。從傳統(tǒng)意義上來(lái)說(shuō)，基因功能喪失的研究主要是通過(guò)RNA 干擾[78]、基于重組基因的敲除、CRISPR-Cas9[79]等基因編輯技術(shù)來(lái)開(kāi)展的。然而，這些策略難以實(shí)現(xiàn)快速可逆的蛋白敲低[80]。傳統(tǒng)的基因敲除與蛋白敲低技術(shù)實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、費(fèi)用高等缺點(diǎn)給研究者帶來(lái)諸多挑戰(zhàn)，尤其在大型非靈長(zhǎng)類動(dòng)物上。此外，許多基因的缺失將導(dǎo)致胚胎死亡，限制了相關(guān)科學(xué)研究[81]。作為一種新型、快速、高效的蛋白敲低模型的方法，PROTAC 是現(xiàn)有遺傳性工具的有效補(bǔ)充手段[29,82]。

3.2 PROTAC 面臨的挑戰(zhàn)及發(fā)展策略

3.2.1 打破“類藥五規(guī)則”的規(guī)律 由于PROTAC 分子是由三部分組成，不可避免地導(dǎo)致相對(duì)分子質(zhì)量過(guò)大，且目前報(bào)道的PROTAC 的相對(duì)分子質(zhì)量基本在800 以上，均不符合Lipinski“類藥五規(guī)則”定律，而該定律是小分子藥物細(xì)胞通透性和生物利用度的一個(gè)重要指標(biāo)[83]。如何提高細(xì)胞攝取率、生物利用度以維持PROTAC 在生物體內(nèi)必要的暴露量，以及獲得具有理想的物理化學(xué)性質(zhì)的分子將是一大挑戰(zhàn)。面對(duì)這一挑戰(zhàn)，饒燏課題組系統(tǒng)地研究了PROTAC 在小鼠、豬和恒河猴體內(nèi)的效果[29]。結(jié)果表明，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中PROTAC RC32 可以顯著降低FKBP12（DC50= 0.27 nmol · L-1）和BTK 的濃度。雖然PROTAC 相對(duì)分子質(zhì)量大，細(xì)胞通透性差，但還是可以通過(guò)連接鏈的優(yōu)化，以及靶蛋白配體的選擇來(lái)克服的。目前對(duì)于PROTAC 透過(guò)細(xì)胞膜的機(jī)制還不清楚，后續(xù)還需要更多的理論和實(shí)踐來(lái)支撐PROTAC 的吸收、分布、代謝、排泄以及毒性研究。

3.2.2 繼續(xù)攻克“不可成藥”靶點(diǎn) 人體中多數(shù)藥靶為“不可成藥”靶點(diǎn)。如何攻克“不可成藥”靶點(diǎn)，為疾病的治療提供多種選擇是未來(lái)藥物研發(fā)必須面臨的考驗(yàn)。

目前報(bào)道的基于PROTAC 技術(shù)的靶蛋白小分子降解劑靶向的多數(shù)靶點(diǎn)為可成藥靶點(diǎn)，而“不可成藥”靶點(diǎn)甚少。未來(lái)還需要深入研究，獲取足夠的證據(jù)來(lái)佐證靶向“不可成藥”靶點(diǎn)的事實(shí)。

3.2.3 建立科學(xué)的評(píng)價(jià)體系 由于PROTAC 在體內(nèi)能以亞化學(xué)劑量發(fā)揮催化循環(huán)作用，因此傳統(tǒng)的藥代動(dòng)力學(xué)（PK）、藥效動(dòng)力學(xué)（PD）方法不能很好地評(píng)估PROTAC 的PK 和PD 性質(zhì)，針對(duì)PROTAC 分子，目前尚無(wú)成熟的PK 和PD 評(píng)價(jià)體系，量效關(guān)系、時(shí)效關(guān)系的規(guī)律尚未完全掌握，蛋白降解所致的毒性尚未透徹了解。未來(lái)亟需建立合適的PK 和PD 評(píng)價(jià)體系。

3.2.4 完善PROTAC 的理性藥物設(shè)計(jì) PROTAC 分子設(shè)計(jì)也是PROTAC 技術(shù)面臨的一大挑戰(zhàn)。目前僅有少數(shù)科學(xué)家成功解析出PROTAC 的三元復(fù)合物[45,84]。Ciulli 課題組解析了PROTAC 分子MZ1 與靶蛋白BRD4、E3 泛素連接酶VHL 的三元復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)（PDB : 5T35）[45]，發(fā)現(xiàn)MZ1 在拉近靶蛋白和E3 泛素連接酶的同時(shí)，還可誘導(dǎo)靶蛋白和E3泛素連接酶結(jié)合界面之間的相互作用，連接鏈的組成和長(zhǎng)度都對(duì)這種協(xié)同作用有較大影響。這對(duì)后續(xù)PROTAC 的理性設(shè)計(jì)具有實(shí)際指導(dǎo)意義。未來(lái)還需要更細(xì)致地從結(jié)構(gòu)上進(jìn)一步闡明PROTAC 的作用機(jī)制以及開(kāi)展更多的構(gòu)效關(guān)系研究，為PROTAC 的分子設(shè)計(jì)提供更多的指導(dǎo)。

3.2.5 拓展E3 泛素連接酶配體 在蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白降解過(guò)程中，E3 泛素連接酶是至關(guān)重要的組成部分。人體中已知的E3 泛素連接酶有600 多個(gè)，但迄今僅不到1%的E3 泛素連接酶具有小分子配體[85]，目前報(bào)道的90%以上的PROTAC 小分子化合物均以最為常見(jiàn)的E3 泛素連接酶為招募對(duì)象，例如CRBN、VHL、MDM2、cIAP1[86]。如何拓展可用于PROTAC 技術(shù)的E3 泛素連接酶也是PROTAC 所面臨的挑戰(zhàn)之一。未來(lái)能否尋找到在特定細(xì)胞或組織中具有特異性的E3 泛素連接酶及其配體也是必須考慮的一大科學(xué)問(wèn)題。常見(jiàn)E3 泛素連接酶配體有沙利度胺（44）、來(lái)那度胺（45）、泊馬度胺（46）、VHL 配體（47）、(-)-nutlin 3（48）、idasanutlin（49）、methyl bestatin（50）、MV1 配 體（51）、cIAP 配體（52）、氨基酸選擇性雌激素受體降解劑（SERD，53）、橋接三環(huán)SERD（54）和單環(huán)SERD（55）等。3.2.6 其他 PROTAC 只有在形成穩(wěn)定的“靶蛋白-PROTAC-E3 泛素連接酶”三元復(fù)合物時(shí)才能高效特異性泛素化靶蛋白。然而，由于三元復(fù)合物的復(fù)雜體系難以捕獲，目前研究PROTAC 介導(dǎo)的三元配合物的方法還不多見(jiàn)，主要有時(shí)間分辨熒光能量轉(zhuǎn)移法（TR-FRET）、AlphaLISA 法、表面等離子體共振法（SPR）和等溫滴定量熱法（ITC）[87-88]。雖然這些方法對(duì)三元復(fù)合物的形成的分析都有一定價(jià)值，但并不能完整概括出POI 降解所需要的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)。目前大多數(shù)研究工作主要探討目標(biāo)蛋白與泛素連接酶各自配體的“二元復(fù)合物”穩(wěn)定性。未來(lái)將深入考察“靶蛋白-PROTAC-E3 泛素連接酶”三元復(fù)合物體系的穩(wěn)定性。

PROTAC 中間Linker 的設(shè)計(jì)也至關(guān)重要，線性脂肪鏈烴或醚結(jié)構(gòu)有被氧化代謝的風(fēng)險(xiǎn)，大大減少了藥物暴露濃度與時(shí)間，加快PROTAC 分子排出生物體外。如何構(gòu)建PROTAC 中間連接鏈的長(zhǎng)度與組成現(xiàn)在還沒(méi)有規(guī)律的認(rèn)識(shí)。

最后，PROTAC 分子的復(fù)雜性給化學(xué)家也帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。Soural 研究團(tuán)隊(duì)運(yùn)用固相合成技術(shù)快速高效地合成了基于沙利度胺的PROTAC 分子[89]。未來(lái)亟待繼續(xù)開(kāi)拓高效、快捷、無(wú)污染的合成技術(shù)平臺(tái)，從而為臨床研究以及后續(xù)的規(guī)模化生產(chǎn)提供充足的原料。

總的來(lái)說(shuō)，任何干預(yù)內(nèi)源性蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)機(jī)制的藥物都需要高度的設(shè)計(jì)水平和特異性來(lái)調(diào)控一系列的生物學(xué)事件，這是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。相信通過(guò)學(xué)術(shù)界和制藥工業(yè)界廣大科研人員的共同努力，這些問(wèn)題在不遠(yuǎn)的將來(lái)都可以得到滿意的解決方案。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

起初，Craig M. Crews 把PROTAC 描述為“cute chemical curiosity”，可能僅僅是出于一種學(xué)術(shù)上的好奇心。如今，PROTAC 技術(shù)已成為新藥研發(fā)的新策略，為疾病的治療提供新方法，未來(lái)幾年將是PROTAC 發(fā)展的關(guān)鍵時(shí)期，越來(lái)越多的PROTAC小分子將進(jìn)入臨床前和臨床研究，進(jìn)一步檢驗(yàn)PROTAC 的治療效果。PROTAC 面臨的各種問(wèn)題將被逐一解決，成為繼小分子抑制劑、單克隆抗體之后的又一種重磅抗腫瘤手段。