尹淑怡，王飛，李曹龍

（中國(guó)藥科大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，江蘇 南京 211198）

酶作為具有高度特異性的蛋白質(zhì)或RNA，可誘導(dǎo)生命體內(nèi)多種反應(yīng)發(fā)生，包括分解反應(yīng)、合成反應(yīng)、代謝反應(yīng)等，也是生化反應(yīng)的高效催化劑。酶的失活或變性阻礙了酶促反應(yīng)的發(fā)生，從而導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的代謝失衡，進(jìn)而引發(fā)部分疾病。如異氰酸酯-2-硫酸酯酶作為硫酸皮膚素和硫酸乙酰肝素的溶酶體降解途徑中的關(guān)鍵酶，其結(jié)構(gòu)改變會(huì)引起兒童疾病Hunter 綜合征[1]；半乳糖腦苷酶缺陷引起神經(jīng)退行性疾病Krabbe 病[2]等。因此，酶已經(jīng)成為了近年來(lái)新藥研發(fā)的重要靶標(biāo)之一[3-5]。此外，利用藥物對(duì)酶的抑制作用來(lái)治療腫瘤[6]、阿爾茨海默病（AD）[7]、糖尿病[8]、流感[9]等疾病在臨床中也備受關(guān)注。

在生物化學(xué)的分析手段中，常通過(guò)固定化酶的方式對(duì)酶促反應(yīng)速率、酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)、酶對(duì)目標(biāo)物的半數(shù)抑制濃度（IC50）、已知藥物或待開發(fā)先導(dǎo)化合物對(duì)酶的抑制率等參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，實(shí)現(xiàn)對(duì)上市藥物的檢測(cè)，并篩選出在臨床上等效或優(yōu)于已上市藥物的小分子化合物[10-13]。作為體內(nèi)檢測(cè)前的分析步驟，酶抑制劑的體外檢測(cè)為藥物的臨床研究提供了一定的參考，從而達(dá)到節(jié)約成本，提高研發(fā)成功率的目的。

采用酶抑制原理在分子水平篩選候選藥物的方法很多，其中傳統(tǒng)方法包括虛擬篩選法[14]、紫外-可見分光光度法[15]、熒光檢測(cè)法[16]、高效液相色譜法（HPLC）[17]。近年來(lái)處于科研前沿的篩選方法有質(zhì)譜法[18]、核磁共振波譜法（NMR）[19]、生物傳感法[20]、毛細(xì)管電泳篩選法[21]等。生物傳感法中的電化學(xué)檢測(cè)法是將酶固定于電極材料表面，在酶促反應(yīng)的過(guò)程中構(gòu)建氧化還原電子轉(zhuǎn)移的平臺(tái)，通過(guò)反應(yīng)中復(fù)合酶電極對(duì)目標(biāo)待測(cè)物的響應(yīng)程度，建立起電信號(hào)變化與目標(biāo)待測(cè)物濃度間的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)酶抑制劑類藥物的精準(zhǔn)測(cè)定。酶抑制型電化學(xué)傳感器既有生物傳感器小型化、高選擇性的特點(diǎn)，又體現(xiàn)了電化學(xué)分析法快速、高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，在藥物設(shè)計(jì)、藥物檢測(cè)、分子篩選等方面都具有積極意義。本文將根據(jù)酶的分類，簡(jiǎn)要介紹細(xì)胞色素P450 酶（CYP450）、酪氨酸酶（tyrosinase）、α-葡萄糖苷酶（α-Glu）、乙酰膽堿酯酶（AChE）等常用靶標(biāo)酶的電化學(xué)生物傳感器在材料選取以及目標(biāo)物檢測(cè)方面的應(yīng)用，并對(duì)酶抑制型電化學(xué)生物傳感器的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行綜述。

1 酶抑制型電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建

酶抑制型電化學(xué)生物傳感器是一種以酶為載體，將目標(biāo)物對(duì)酶的抑制程度與反應(yīng)進(jìn)程中的電信號(hào)變化相聯(lián)系，從而對(duì)待測(cè)目標(biāo)物進(jìn)行分析檢測(cè)的工具（檢測(cè)機(jī)制如圖1 所示）。在該類傳感器的構(gòu)建過(guò)程中，電極材料的選擇和酶的固定化效率是影響其性能的2 個(gè)關(guān)鍵因素。

圖 1 電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)酶抑制劑類藥物的原理示意圖Figure 1 Mechanism of electrochemical biosensor for detecting enzyme inhibitor drugs

目前應(yīng)用于酶生物傳感器的材料大多屬于金屬類或碳材料類。酶作為大分子蛋白質(zhì)，固定于電極表面會(huì)出現(xiàn)阻抗升高、酶活降低等不利于電信號(hào)測(cè)定的問(wèn)題，為了改善這一現(xiàn)狀，放大終端信號(hào)，傳統(tǒng)電極材料大多選用導(dǎo)電性良好的貴金屬（金或鉑）[22]。例如，Cui 等[23]制備出具有均勻尺寸的金納米線陣列材料，一方面解決了葡萄糖氧化酶（GOD）復(fù)合電極導(dǎo)電性差的問(wèn)題，另一方面該金屬材料的高電活性使酶?jìng)鞲衅鲗?duì)葡萄糖的檢測(cè)限大大降低。除金屬材料外，碳材料因其良好的生物相容性、對(duì)待測(cè)物氧化還原反應(yīng)的催化活性、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，也在酶生物傳感器的設(shè)計(jì)中備受青睞[24]。Peng 等[25]在傳感器的制備中引入石墨烯量子點(diǎn)（GQD）作為新型的酶催化反應(yīng)平臺(tái)。除了具備碳材料的一般特性外，GQD 還具有邊緣效應(yīng)，其羧基與電極上的甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行鍵合反應(yīng)，從而牢固地附著于電極表面，提升傳感器的靈敏性。Aliakbarinodehi 等[26]采用導(dǎo)電性更優(yōu)于石墨的多壁碳納米管（MWCNT），該材料具有更大的比表面積，能夠吸附更多的酶細(xì)胞色素P450 3A4（CYP3A4），不僅能實(shí)現(xiàn)電子的快速傳輸，還能增強(qiáng)酶與電極之間的電信號(hào)。在近年來(lái)的文獻(xiàn)報(bào)道中，金屬材料與碳材料的復(fù)合逐漸成為生物傳感器電極設(shè)計(jì)中的熱點(diǎn)方向。Uzak 等[27]采用還原氧化石墨烯（rGO）、多孔鋅-金屬有機(jī)骨架（Zn-MOF）和導(dǎo)電鉑納米顆粒3 種材料制備酶生物傳感器，不僅通過(guò)金屬鉑提高了電子遷移率，還通過(guò)Zn-MOF 提高傳感器的乙酰膽堿酯酶負(fù)載能力，同時(shí)rGO 增大了固定酶的表面積和孔隙率。在隨后的研究中，Dong 等[28]提出制備MOF 衍生材料的方法，在保留MOF 原有優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步增加了酶GOD 固定量，提高了電子傳遞速率。此外，還有其他新興材料也被用于提升酶?jìng)鞲衅餍阅堋an 等[29]以紙作為輔助材料，將酶GOD 預(yù)存儲(chǔ)于其中，再與絲網(wǎng)印刷電極（SPE）一同用于便攜式電化學(xué)生物傳感器的開發(fā)，構(gòu)建了低成本、高靈敏度、可重復(fù)生產(chǎn)的一次性電極檢測(cè)平臺(tái)。

固定化酶技術(shù)是生物傳感器構(gòu)建中的關(guān)鍵部分，它以靶標(biāo)酶作為生物傳感元件，將其固定于不同的電極材料中，實(shí)現(xiàn)對(duì)酶底物、酶產(chǎn)物或抑制劑的特異性檢測(cè)。在酶的固定化操作中，一方面需要保證酶的內(nèi)在結(jié)構(gòu)、酶活力、生物活性等不發(fā)生改變，另一方面需要保證靶標(biāo)酶與電極材料結(jié)合緊密，以防止其在使用過(guò)程中被解吸附，進(jìn)而影響傳感器的穩(wěn)定性以及使用壽命。根據(jù)傳感器應(yīng)用的不同需要，酶的固定化方法也略有不同。傳統(tǒng)的方法有吸附[30]、包埋[31]、交聯(lián)[32]、共價(jià)結(jié)合[33]、親和法[34]，目前也有文獻(xiàn)報(bào)道將上述個(gè)別方法結(jié)合起來(lái)，用以改善酶活性中心與電極表面的電荷轉(zhuǎn)移速率[35]。此外，納米粒子和磁性顆粒的引入也在一定程度上提高了酶的固定化效率。

2 基于酶抑制原理的臨床藥物檢測(cè)以及先導(dǎo)化 合物篩選

在目前已有的研究報(bào)道中，通常是將酶作為識(shí)別元件固定在電極表面，根據(jù)材料的不同特性設(shè)計(jì)出酶固定化效率較為理想的電極，再將生化反應(yīng)過(guò)程中的化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，一方面通過(guò)電化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)對(duì)已上市藥物的低檢測(cè)限精確檢測(cè)，另一方面將上述信號(hào)變化與待篩選活性小分子在酶電極上產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)行比對(duì)，完成具有潛在藥理活性先導(dǎo)化合物的快速高效篩選。根據(jù)檢測(cè)過(guò)程中靶標(biāo)酶種類的不同，我們將現(xiàn)有的生物傳感器進(jìn)行匯總并分類（見圖2）。

圖2 基于酶抑制原理的電化學(xué)生物傳感器的分類 Figure 2 Classification of electrochemical biosensors based on the principle of enzyme inhibition

2.1 細(xì)胞色素P450 生物傳感器

以血紅素為活性中心的細(xì)胞色素P450 在催化生物化學(xué)反應(yīng)的過(guò)程中，會(huì)將電子由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）經(jīng)CYP450 還原酶（CPR）傳遞至CYP450 血紅素，參與人體中內(nèi)源性物質(zhì)或藥物等外源性物質(zhì)的首過(guò)代謝[36]?；谠撛淼碾娀瘜W(xué)生物傳感器不需要氧化還原媒介體，可以減少媒介體對(duì)傳感器信號(hào)檢測(cè)的干擾。據(jù)此，研究者們?cè)O(shè)計(jì)出一系列包含CYP450 催化的生物電子平臺(tái)作為藥物等外源性物質(zhì)代謝的體外模型，監(jiān)測(cè)CYP450不同亞型的底物如奧美拉唑[37]、萘普生[38]、雄烯二酮[39]、17β-雌二醇[40]等的代謝。此后，對(duì)于代謝酶CYP450 抑制劑的研究也逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，包括抑制劑類藥物的檢測(cè)以及藥物研發(fā)中先導(dǎo)化合物的篩選都可以借助CYP450 酶活性[41]。若該酶固定于電極上，能夠直接從電極接受電子，而不依賴于作為電子供體和電子轉(zhuǎn)移伴侶酶的NADPH和CPR。CYP450 酶作為生物傳感器的一部分，有助于實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的高靈敏度檢測(cè)[42]。表1 總結(jié)了近5 年CYP450 的不同亞型以及相應(yīng)的生物傳感器在酶抑制劑類藥物檢測(cè)中的應(yīng)用。

Aliakbarinodehi 等[43]通過(guò)引入MWCNT 構(gòu)建相應(yīng)的生物傳感器，證實(shí)了前列腺癌靶向藥物阿比特龍對(duì)CYP3A4 的抑制作用。在該傳感器的構(gòu)建中，材料與酶相輔相成，一方面，MWCNT 的3D 多孔納米結(jié)構(gòu)能夠提高材料有效表面積以吸附大量酶并維持酶催化活性；另一方面，酶的存在也防止了阿比特龍對(duì)MWCNT 的材料污染。此外，該傳感器成功應(yīng)用于人血清樣本中阿比特龍的檢測(cè)，在多干擾物共存的情況下仍展現(xiàn)出230 nmol · L-1的優(yōu)良檢測(cè)限。Ajayi 等[44]將酶固定在以金電極為基底的聚（8-苯胺-1-萘磺酸）上，通過(guò)電流生物傳感器檢測(cè)了帕羅西汀對(duì)該酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。該傳感器對(duì)藥物的響應(yīng)范圍為0.005 ～ 0.05 μmol · L-1，檢測(cè)限低至0.002 μmol · L-1，響應(yīng)僅耗時(shí)30 s，除了這些良好的分析性能外，傳感器的重復(fù)性和穩(wěn)定性也顯著提高。上述幾篇文獻(xiàn)報(bào)道的酶?jìng)鞲衅麟m然材料組成不同，但原理都是先進(jìn)行酶活性檢測(cè)，再加入抑制劑類藥物后得到藥物分子對(duì)該酶的抑制率，實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物分子的精確檢測(cè)。

表1 基于CYP450 的生物傳感器在酶抑制劑類藥物檢測(cè)中的應(yīng)用Table 1 Application of CYP450-based biosensor in the detection of enzyme inhibitor drugs

2.2 酪氨酸酶生物傳感器

酪氨酸酶作為一種多功能含銅酶，參與人體中的黑色素合成反應(yīng)，其中，酚類和醌類會(huì)在酶的催化下產(chǎn)生電子轉(zhuǎn)移[47]。由于電流信號(hào)與酪氨酸酶活性成正比，采用電化學(xué)分析方法對(duì)電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，酶抑制劑類物質(zhì)的檢測(cè)下限可達(dá)納摩爾級(jí)別[48]。此類生物傳感器不僅可以檢測(cè)臨床藥物，在微生物、食品、環(huán)境、農(nóng)藥等分析領(lǐng)域也應(yīng)用廣泛[49-53]。表2 總結(jié)了近5 年以醌類物質(zhì)電信號(hào)變化為基礎(chǔ)的生物傳感器在酶抑制劑類藥物檢測(cè)中的應(yīng)用。

El Harrad 等[56]采用酪氨酸酶修飾的納米碳糊電極，不僅能夠成功檢測(cè)白蛋白和胰蛋白酶活性，還實(shí)現(xiàn)了對(duì)酪氨酸酶抑制劑亮抑酶肽的靈敏檢測(cè)，同時(shí)解決了醌類有色化合物無(wú)法進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)的難題，因此在臨床診斷和蛋白酶抑制劑的篩選中得到廣泛應(yīng)用。Frangu 等[58]構(gòu)建了用于檢測(cè)對(duì)乙酰氨基酚的電流型生物傳感器，通過(guò)修飾酪氨酸酶和非功能化石墨烯，使得傳感器的檢測(cè)電位可低至0 V，避免其他電化學(xué)活性物質(zhì)在電極表面發(fā)生反應(yīng)引起電信號(hào)變化，從而提高傳感器的選擇性。該方法輔助流動(dòng)注射分析法（FIA）用于上市藥品和人血清樣本的檢測(cè)，結(jié)果表明，其檢測(cè)性能可與HPLC媲美，且具有更好的選擇性、簡(jiǎn)便性和時(shí)效性。

表 2 基于酪氨酸酶的生物傳感器在酶抑制劑類藥物檢測(cè)中的應(yīng)用Table 2 Application of tyrosinase-based biosensor in the detection of enzyme inhibitor drugs

2.3 α-葡萄糖苷酶生物傳感器

α-葡萄糖苷酶在人體中催化底物釋放葡萄糖，是保持人體餐后血糖在正常范圍內(nèi)的重要因素，同時(shí)也是2 型糖尿病病理機(jī)制中的重要一環(huán)[60]。開發(fā)α-Glu 抑制劑類藥物，減緩糖尿病患者餐后利用碳水化合物產(chǎn)生葡萄糖的速度，降低患者血糖濃度，是目前主要的臨床治療策略[61]。在電化學(xué)檢測(cè)中，通常是以藥物對(duì)α-Glu 的抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，間接檢測(cè)藥物在體內(nèi)減緩葡萄糖產(chǎn)生的效果[62]。將其他化合物對(duì)該酶的抑制率與現(xiàn)有藥物的抑制率進(jìn)行對(duì)比，可以篩選出對(duì)α-Glu 有較強(qiáng)抑制作用的化合物，為新藥的發(fā)現(xiàn)提供指導(dǎo)幫助[8,12,63]。

Mohiuddin 等[64]構(gòu)建了用于評(píng)價(jià)藥用植物的活性成分抗糖尿病潛力的生物傳感器。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)葡萄糖苷酶催化底物對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚（p-NP），并用電化學(xué)循環(huán)伏安法記錄產(chǎn)物p-NP 的電信號(hào)。加入藥用植物活性成分前后的p-NP 的還原峰電信號(hào)差異用于評(píng)估其抗糖尿病潛力，有助于從藥用植物中尋找篩選具有抗糖尿病活性的天然活性組分。Li 等[65]引入具有特定氨基酸序列的適配體與α-Glu進(jìn)行反應(yīng)，其產(chǎn)物對(duì)氨基苯酚可引起明顯的電流變化，不僅可以應(yīng)用于酶活性的檢測(cè)，還可以進(jìn)行抑制劑的篩選。值得一提的是，該傳感器還具有可再生的特點(diǎn)，通過(guò)水洗即可重復(fù)使用。

2.4 乙酰膽堿酯酶生物傳感器

乙酰膽堿酯酶是一種從不同有機(jī)物中分離得到的酶，作為降解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿（ACh）的主要酶被引入AD 的治療策略中。目前較為被大眾接受的AD 病理機(jī)制即為“膽堿能學(xué)說(shuō)”[66]，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為老年性癡呆癥患者腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)ACh 的缺失是導(dǎo)致AD 的關(guān)鍵因素，因此，通過(guò)AChE 抑制劑來(lái)抑制ACh 的水解，從而改善由膽堿能神經(jīng)元受損而引起的AD 相關(guān)癥狀，也成為設(shè)計(jì)新型的電化學(xué)生物傳感器和篩選相關(guān)藥物的有力依據(jù)。

硫代膽堿是硫代乙酰膽堿在AChE 催化下所得產(chǎn)物，其濃度大小與其所測(cè)得的氧化電流高低成正比[67]。在酶抑制劑類藥物存在的情況下，硫代膽堿的氧化電流也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化，由此而產(chǎn)生的電信號(hào)被酶?jìng)鞲衅魉东@，可作為AChE 抑制劑類藥物的通用檢測(cè)原理。目前基于該原理而開發(fā)的上市藥物有他克林、多奈哌齊、卡巴拉汀、加蘭他敏、石杉?jí)A甲等，與之相關(guān)的高靈敏快速檢測(cè)型生物傳感器也被相繼開發(fā)（見表3）。

Shamagsumova 等[68]在玻碳電極上用電流滴定的方法電解沉積了樹枝狀銀納米晶體，并與電極上所涂布的低聚交酯組成復(fù)合材料構(gòu)建生物傳感器。該研究引入低聚交酯片段測(cè)定多奈哌齊、小檗堿、石杉?jí)A甲這3 種抗膽堿酯酶藥物，可以降低銀電極對(duì)傳感器的響應(yīng)干擾，使傳感器在低工作電勢(shì)（0.05 V）下具有更靈敏的信號(hào)響應(yīng)。除此之外，傳感器還能夠?qū)ι鲜? 種藥物在尿樣中的殘留進(jìn)行逐一分析。Ivanov 等[69]從AChE 的固定策略出發(fā)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)酶生物傳感器的性能優(yōu)化。在該研究中，聚電解質(zhì)復(fù)合物被引入用以提高AChE 的固定化效率。與一般的共價(jià)連接固定化酶策略相比，該方法在檢測(cè)抗AD 藥物（多奈哌齊和小檗堿）方面具有更高的靈敏度和更低的檢測(cè)限。此后，該課題組又針對(duì)聚電解質(zhì)進(jìn)行了優(yōu)化，將DNA 作為聚陰離子引入到聚電解質(zhì)復(fù)合物的組裝中，使得傳感器表面涂層更加穩(wěn)定，進(jìn)一步提高了藥物測(cè)定的靈敏度[70]。Alvau等[73]引入AChE 和膽堿氧化酶（ChOx）構(gòu)建酶?jìng)鞲衅?，用以量化檢測(cè)抗腫瘤藥伊立替康，利用雙酶反應(yīng)的產(chǎn)物過(guò)氧化氫來(lái)達(dá)到快速檢測(cè)目的，為腫瘤患者的臨床藥物實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)提供了全新的可靠途徑。此外，AChE 生物傳感器還可用于神經(jīng)毒素的快速檢測(cè)。Hu等[74]采用納米多孔金膜和還原氧化石墨烯-二氧化錫納米顆粒（RGO-SnO2）納米復(fù)合材料對(duì)酶進(jìn)行高效固定，避免了熒光檢測(cè)中繁瑣而費(fèi)力的標(biāo)記過(guò)程。此項(xiàng)研究中的生物傳感器僅在30 min 富集時(shí)間后即可靈敏檢測(cè)神經(jīng)毒素法西林，檢測(cè)限低至8 pmol · L-1，為毒素的篩選工作提供了一定的指導(dǎo)幫助。

表3 基于乙酰膽堿酯酶的生物傳感器在酶抑制劑類藥物檢測(cè)中的應(yīng)用Table 3 Application of acetylcholinesterase-based biosensor in the detection of enzyme inhibitor drugs

2.5 基于其他酶的生物傳感器

在對(duì)黃嘌呤氧化酶（XOD）有抑制活性的藥物的檢測(cè)中，El Harrad 等[75]建立了用電流型生物傳感器篩選藥用植物中具有XOD 抑制活性組分的方法。該研究采用普魯士藍(lán)（PB）修飾電極，通過(guò)Nafion 將XOD 固定在SPE 上，排除了其他易氧化物質(zhì)對(duì)分析檢測(cè)過(guò)程的干擾。實(shí)驗(yàn)結(jié)果一方面比較了已上市藥物別嘌呤醇和各類藥用植物提取液的抑制率，成功篩選出幾個(gè)抑制活性大于別嘌呤醇的天然活性成分；另一方面對(duì)比分光光度檢測(cè)法和電化學(xué)檢測(cè)法的檢測(cè)性能，發(fā)現(xiàn)后者具有更高的靈敏度。

單胺氧化酶（MAO）抑制劑同樣可以通過(guò)構(gòu)建酶?jìng)鞲衅鞯氖侄芜_(dá)到低濃度檢測(cè)的目的。Aigner等[76]采用苯乙胺作為底物，通過(guò)滲析膜將人單胺氧化酶B（hMAO B）固定在SPE 上，實(shí)現(xiàn)了對(duì)臨床藥物司來(lái)吉蘭的快速測(cè)定，并采用實(shí)際樣品驗(yàn)證傳感器性能，為后續(xù)酶抑制劑類藥物的篩選提供參考。Ishida 等[77]建立了新型的MAO 生物傳感器測(cè)量多巴胺（DA）的體內(nèi)外含量，不僅可以高選擇性地檢測(cè)DA 的含量而不受其他單胺類物質(zhì)的干擾，還實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)DA 水平變化的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

酶生物傳感器不僅可以用來(lái)檢測(cè)酶促反應(yīng)過(guò)程中的電信號(hào)響應(yīng)，還可以通過(guò)反應(yīng)之外的電信號(hào)響應(yīng)進(jìn)行酶活性評(píng)價(jià)。例如，Chowdhury 等[78]建立了將亞甲藍(lán)（MB）-脂質(zhì)體生物傳感器用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)鞘磷脂（SM）酶活性的方法。先將具有氧化還原性的MB包裹于SM脂質(zhì)體中，再用目標(biāo)酶破壞脂質(zhì)體，使MB 自由釋放，用電化學(xué)差分脈沖伏安法（DPV）檢測(cè)MB 的釋放濃度，間接檢測(cè)鞘磷脂酶的活性，且實(shí)現(xiàn)了信號(hào)的放大。此外，該傳感器還成功實(shí)現(xiàn)了人血清樣本中鞘磷脂酶的檢測(cè)。此方法的檢測(cè)限為7.2 mU · L-1，遠(yuǎn)低于市售的酶活性分析儀器，其具有便捷、響應(yīng)快速、高靈敏度的特點(diǎn)，為酶活性和抑制劑的即時(shí)篩選提供了一定的可能。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

本綜述簡(jiǎn)要總結(jié)了近5 年基于酶抑制原理的生物傳感器用于電化學(xué)檢測(cè)酶活性、臨床藥物以及部分藥用植物活性組分的研究工作，闡明了固定化酶生物傳感器在藥物篩選、實(shí)際樣本檢測(cè)、天然活性小分子先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域的重要意義。酶在人體中能夠參與多種生化反應(yīng)，同時(shí)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。酶的活性變化也常常與疾病的機(jī)制相聯(lián)系，因此，在生命分析領(lǐng)域，部分酶活性的檢測(cè)被用作相關(guān)疾病的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[79-81]。而在藥物分析領(lǐng)域，還有許多酶被視為藥物靶標(biāo)，如CYP450、AChE、XOD、環(huán)氧合酶（COX-2）[82]等。此外，根據(jù)酶抑制原理篩選自然界藥用植物活性成分或人工設(shè)計(jì)具有藥理活性的分子，進(jìn)而開發(fā)相應(yīng)藥物來(lái)治療疾病也是當(dāng)前較為熱門的研究方向。由此可見，開發(fā)新型、高效、靈敏的酶抑制劑分析檢測(cè)方法意義重大。由于酶具有專一性和多樣性的特點(diǎn)，一種酶只催化一種或一類底物，不同疾病所對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)酶也各有不同，這使得基于酶抑制劑的分析檢測(cè)方法趨于專屬化。不同于滴定、色譜或質(zhì)譜等傳統(tǒng)方法，電化學(xué)分析法具有快速、靈敏、易于原位檢測(cè)等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在與酶相關(guān)的分析檢測(cè)方法中脫穎而出，成為科研工作者們?nèi)遮呹P(guān)注的焦點(diǎn)。從檢測(cè)的實(shí)用性來(lái)看，采用酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)血樣或尿樣中的藥物含量的技術(shù)日趨成熟，但針對(duì)體內(nèi)血藥濃度的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)或表皮汗液監(jiān)測(cè)等問(wèn)題，酶?jìng)鞲衅鞯脑O(shè)計(jì)方向趨向于可穿戴式或皮下可植入式，使之在日常生活中應(yīng)用更加廣泛[83-84]。從傳感器的性能來(lái)看，由于傳感器中的酶固定量難以維持，以及酶自身使用壽命有限，設(shè)計(jì)能夠重復(fù)利用的可再生酶?jìng)鞲衅骰蚴堑统杀尽⑿⌒突?、一次性的商用酶?jìng)鞲衅鲗⑹墙鉀Q上述問(wèn)題較好的2 個(gè)切入點(diǎn)[85-86]。此外，在無(wú)機(jī)納米材料上修飾具有催化功能的化學(xué)基團(tuán)，結(jié)合功能納米材料的優(yōu)勢(shì)和酶的催化功能，構(gòu)建出人工合成的納米酶，也是目前彌補(bǔ)天然酶分子理化性質(zhì)不穩(wěn)定的方法之一[87]。

在過(guò)去的幾年中，有關(guān)酶?jìng)鞲衅鞯睦碚撗芯?、?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及商業(yè)使用都取得了巨大的進(jìn)步，但是，在維持電化學(xué)分析檢測(cè)自身優(yōu)勢(shì)的前提下，同時(shí)保證檢測(cè)結(jié)果的精確性、穩(wěn)定性、體內(nèi)嵌入的安全性，仍需要克服許多挑戰(zhàn)。在未來(lái)，基于酶抑制原理的藥物檢測(cè)存在更多發(fā)展方向。酶?jìng)鞲衅鞯臋z測(cè)對(duì)象不僅局限于能夠阻斷酶促反應(yīng)的藥物，部分電化學(xué)活性較差、難以直接電化學(xué)檢測(cè)的藥物分子也能夠通過(guò)酶抑制原理進(jìn)行識(shí)別檢測(cè)。此外，將天然藥用植物的活性成分或人工合成化合物對(duì)酶的抑制率與相關(guān)藥物所測(cè)得的抑制率進(jìn)行比較，可對(duì)具有藥理活性的化合物進(jìn)行大批量初步篩選，加快新藥研發(fā)的進(jìn)程。目前，仍有大量基于酶抑制原理檢測(cè)藥物或篩選化合物的方法有待開發(fā)，跨學(xué)科多領(lǐng)域交融也將為現(xiàn)階段的挑戰(zhàn)提供更多的思路和選擇。