彭 程， 薛海軍， 常曉曉， 邱繼水， 陳 喆， 林志雄， 陸育生*

(1． 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所∥農(nóng)業(yè)部南亞熱帶果樹生物學(xué)及遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∥廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510640； 2． 韶關(guān)市武江區(qū)生產(chǎn)力促進(jìn)中心， 韶關(guān) 512026)

黃皮(Clausenalansium)為嶺南特色果樹，原產(chǎn)中國(guó)，主要分布在廣東、廣西、福建和海南等地[1]，品種資源十分豐富. 黃皮果實(shí)外觀誘人、風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富，且具有生津止渴、健胃消食、止咳化痰、行氣止痛等功效[2]；此外，黃皮果實(shí)富含的多酚類等生物活性物質(zhì)還具有抗氧化[3]、抑腫瘤[4]、預(yù)防老年癡呆[5]等作用，是稀有的食藥兼用型水果，深受廣大消費(fèi)者的喜愛. 當(dāng)前我國(guó)商業(yè)栽培的黃皮產(chǎn)期主要集中在7月中旬至8月上旬，產(chǎn)期短，收獲集中；黃皮為典型的高呼吸代謝水果，采后品質(zhì)劣變迅速，2～3 d便失去商品價(jià)值[6]；隨著面積和產(chǎn)量的不斷增加，銷售壓力也日趨嚴(yán)峻，個(gè)別地區(qū)甚至開始出現(xiàn)供大于求、果賤傷農(nóng)的事件. 因此，為穩(wěn)定鮮果市場(chǎng)價(jià)格，增加果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入，除了靠產(chǎn)期調(diào)節(jié)和采后貯運(yùn)保鮮技術(shù)外，開展黃皮深加工利用極為必要. 開發(fā)附加值高的果汁產(chǎn)品是水果產(chǎn)業(yè)加工領(lǐng)域的主要方向[7]，品質(zhì)評(píng)價(jià)對(duì)果汁產(chǎn)品的研發(fā)、儲(chǔ)運(yùn)和流通具有重要的指導(dǎo)意義，彭程等[8]曾對(duì)黃皮果汁的有機(jī)酸組分和含量進(jìn)行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)檸檬酸是黃皮果汁有機(jī)酸的主要組分，且不同品種含量差異較大，然而目前尚未見有關(guān)黃皮果汁品質(zhì)綜合分析的報(bào)道. 在產(chǎn)品開發(fā)方面雖然有少數(shù)的報(bào)道[9-11]，但均集中在生產(chǎn)工藝方面，且僅限于研究階段，尚未見成熟的產(chǎn)品面世. 本研究選取了覆蓋我國(guó)所有栽培類型的20個(gè)黃皮代表性品種，測(cè)定分析其果汁的基礎(chǔ)品質(zhì)、主要抗氧化功能活性成分含量以及抗氧化能力，比較了不同品種間的差異性，以期為進(jìn)一步研究和開發(fā)黃皮果汁功能性產(chǎn)品提供理論依據(jù)，同時(shí)也為黃皮加工適用型品種的篩選提供借鑒.

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：黃皮果實(shí)均采自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所農(nóng)業(yè)部廣州黃皮種質(zhì)資源圃，供試的品種共20個(gè)，分別是從甜1號(hào)、冰糖、番禺1號(hào)、白云1號(hào)、鳳梢5號(hào)、白糖、崛督4號(hào)、老屋2號(hào)、揭陽無核、廣雜3號(hào)、細(xì)雞心、水西雞心、江門2號(hào)、果選1號(hào)、金雞心、龍門5號(hào)、后園1號(hào)、郁南無核、金豐、潮州2號(hào).

試劑：蔗糖、抗壞血酸、二硫蘇糖醇、沒食子酸、兒茶素、福林-酚試劑(Folin-Ciocalteu試劑)、水溶性維生素 E(Trolox)、2，4，6-三(2-吡啶基)-1，3，5-三嗪(TPTZ)及1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)等購(gòu)自美國(guó) Sigma-Aldrich 公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

儀器：不銹鋼手動(dòng)榨汁機(jī)購(gòu)自蘇州嘉力仕機(jī)械設(shè)備有限公司；XB323電子分析天平購(gòu)自上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋購(gòu)自常州國(guó)華電器有限公司；Sartorius酸度計(jì)購(gòu)自賽多利斯儀器有限公司；PAL-1數(shù)顯手持便攜式折光儀購(gòu)自日本愛宕公司；SP-722型可見分光光度計(jì)購(gòu)自上海光譜儀器有限公司；Centrifuge 5810R離心機(jī)購(gòu)自艾本德中國(guó)有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃皮果汁的制備 在果實(shí)成熟時(shí)采集上述不同品種的黃皮果實(shí)置于冰上立即送往實(shí)驗(yàn)室，剔除腐爛、機(jī)械損傷和病蟲危害等殘次果后充分清洗，去核，手工榨汁，汁液通過孔徑0.15 mm(100目)雙層濾布過濾，濾液于4 ℃、10 000 r/min條件下離心15 min后，取上清果汁樣品于-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆?

1.2.2 果汁基礎(chǔ)品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定 pH值采用Sartorius酸度計(jì)直接測(cè)定；可溶性固形物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用數(shù)顯手持便攜式折光儀Pocket PAL-1測(cè)定；可溶性糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用蒽酮比色法測(cè)定[12]；總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用酸堿滴定法[13]，以檸檬酸計(jì)；糖酸比用可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比值表示.

1.2.3 抗壞血酸質(zhì)量濃度的測(cè)定 參考KAMPFENKEL等[14]的方法，略作修改. 原果汁稀釋一定倍數(shù)后取150L，分別加入300L磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH 7.4)、150L 10 mmol/L二硫蘇糖醇，充分混勻后于42 ℃水浴中反應(yīng)15 min，然后加入150L 0.5%的N-乙基順丁烯二酰亞胺，靜置1 min后再分別加入750L 10%三氯乙酸溶液、600L 42%H3P04溶液、600L 4%聯(lián)吡啶溶液和300L 3% FeCl3(現(xiàn)配現(xiàn)用)，混勻后立即震蕩，42 ℃水浴中反應(yīng)40 min，于波長(zhǎng)525 nm處測(cè)定吸光值，以6%三氯乙酸溶液代替樣品作空白對(duì)照. 以抗壞血酸為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以每升果汁中含有的抗壞血酸毫克數(shù)計(jì),表示為mg/L.

1.2.4 總黃酮質(zhì)量濃度的測(cè)定 參考JIA等[15]的方法，略作修改. 原果汁稀釋一定倍數(shù)后取300L，加入1.2 mL H2O和120L 5%的NaNO2溶液，反應(yīng)5 min后加入90L 10% AlCl3·6H20溶液，6 min后加入600L 1mol/L的NaOH溶液，加蒸餾水補(bǔ)足總體積為3 mL，于510 nm處測(cè)定吸光值, 以70%的甲醇溶液代替樣品作空白對(duì)照. 以兒茶素(Catechin)為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終結(jié)果以每升果汁中含有的兒茶素當(dāng)量(Catechin Equivalent, CE)表示，單位為mg/L.

1.2.5 總酚質(zhì)量濃度的測(cè)定 參考KIM等[16]的方法，略作修改. 原果汁稀釋一定倍數(shù)后取300L，加入360L H2O，再加240L Folin-Ciocatieu試劑，充分搖勻后，室溫靜置6 min，隨后加入1.2 mL 7% Na2CO3溶液，加蒸餾水補(bǔ)足總體積為3 mL，暗室反應(yīng) 60 min后，于760 nm處測(cè)定吸光值，以70%的甲醇溶液代替樣品作空白. 以沒食子酸(Gallic Acid)為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終結(jié)果以每升果汁中含有的沒食子酸當(dāng)量(Gallic Acid Equivalent，GAE)表示，單位為mg/L.

1.2.6 抗氧化活性的測(cè)定

(1) DPPH自由基清除能力測(cè)定. 參考BRAND-WILLIAMS等[17]的方法，略作修改. 原果汁稀釋一定倍數(shù)后，取300L，加入2.7 mL 80mol/L的DPPH甲醇溶液，充分混勻后，置于暗室反應(yīng)30 min，于517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，以70%的甲醇溶液代替樣品作空白，按照文獻(xiàn)所述公式計(jì)算樣品對(duì)DPPH的清除率. 以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，配制系列質(zhì)量濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，用同樣方法測(cè)定并計(jì)算其對(duì)DPPH的清除率. 以Trolox質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線. 最終結(jié)果以每升果汁所含的Trolox當(dāng)量(Trolox Equivalent，TE)表示，單位為mg/L.

(2)鐵離子還原抗氧化力(Ferric Reducing Antioxidant Power，F(xiàn)RAP)測(cè)定. 參考BENZIE與STRAIN[18]方法，略作修改. 原果汁稀釋一定倍數(shù)后取300L，加入FRAP工作液2.7 mL(300 mmol/L pH 3.6醋酸鹽緩沖液25 mL、10 mmol/L TPTZ溶液2.5 mL、20 mmol/L FeC13·6H2O溶液2.5 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用)，充分混勻后，37 ℃水浴鍋中避光反應(yīng)40 min，于593 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，以70%的甲醇溶液代替樣品作空白. 以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線. 最終結(jié)果以每升新鮮果汁中含有Trolox當(dāng)量(Trolox Equivalent，TE)表示，單位為mg/L.

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)樣品測(cè)定重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)用Excel 2007進(jìn)行處理，用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析及聚類分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種黃皮果汁基礎(chǔ)品質(zhì)的比較

對(duì)供測(cè)樣品的pH、可溶性固形物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w(可溶性固形物))、可溶性糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w(可溶性糖))、可滴定酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w(可滴定酸))及糖酸比等基礎(chǔ)品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果見表1. 不同黃皮品種果汁的基礎(chǔ)品質(zhì)存在明顯差異. 20個(gè)品種黃皮的pH變化范圍為3.40～5.95，其中番禺1號(hào)最高，達(dá)5.95，其次是白云1號(hào)，后園1號(hào)的pH最低，僅為3.40. 可溶性固形物是評(píng)價(jià)果實(shí)品質(zhì)的綜合指標(biāo)，包含糖、酸、維生素和礦物質(zhì)等多種成分[19]. 不同品種黃皮果汁的w(可溶性固形物)在14.27%～21.67%之間，其中w(可溶性固形物)大于20%的品種有崛督4號(hào)、老屋2號(hào)、揭陽無核、水西雞心和廣雜3號(hào)，均顯著高于其他品種，而江門2號(hào)的w(可溶性固形物)最低. 果實(shí)中的糖、酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其配比是決定果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)最重要的指標(biāo)[20]，高酸低糖的果實(shí)口感過酸，而高糖低酸則會(huì)使果實(shí)風(fēng)味變淡. 就w(可溶性糖)而言，后園1號(hào)和果選1號(hào)的w(可溶性糖)較低，而揭陽無核和水西雞心的w(可溶性糖)較高. 后園1號(hào)、龍門5號(hào)和江門2號(hào)的w(可滴定酸)較高，而鳳梢5號(hào)的w(可滴定酸)最低. 鳳梢5號(hào)果汁的糖酸比最高，達(dá)299.94，而后園1號(hào)的糖酸比最低，僅有5.25. 綜合上述指標(biāo)，揭陽無核和老屋2號(hào)果汁的w(可溶性固形物)最高，糖酸比適中，風(fēng)味最好.

2.2 不同品種黃皮果汁的抗氧化物質(zhì)質(zhì)量濃度及抗氧化活性比較

抗壞血酸、總黃酮和總多酚是植物中重要的生物活性物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗氧化能力[21]. 從表2可知：不同品種黃皮果汁的3種抗氧化物質(zhì)質(zhì)量濃度也存在明顯差異. 各品種黃皮的ρ(抗壞血酸)在391.4～2 276.4 mg/L之間，老屋2號(hào)、崛督4號(hào)、揭陽無核和水西雞心的ρ(抗壞血酸)較高，均高于2 000.0 mg/L，細(xì)雞心和廣雜3號(hào)的次之，冰糖的最低，低于400.0 mg/L. 各品種黃皮的ρ(總黃酮)在11.6～479.1 mg/L，老屋2號(hào)和揭陽無核的較高，其次是廣雜3號(hào)和崛督4號(hào)，從甜1號(hào)、白糖和鳳梢5號(hào)的較低，均低于20.0 mg/L. 20個(gè)品種黃皮的ρ(總多酚)在551.1～4 673.3 mg/L 之間，ρ(總多酚)最高的品種是揭陽無核，老屋2號(hào)次之，番禺1號(hào)的最低.

目前，檢測(cè)水果抗氧化能力的方法有很多，常見的有DPPH法[17]、羥基自由基清除(Hydroxyl Radical Scavenging，HRSA)法[22]、氧自由基吸收能力(Oxygen Radical Absorbance Aapacity,ORAC)法[23]和FRAP法[18]等. 由于不同的方法測(cè)定機(jī)理有所差異，還沒有單獨(dú)一種方法能夠精確地評(píng)價(jià)果實(shí)的抗氧化活性[24-25]，因此需要采用多種方法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià). 本研究分別采用DPPH和FRAP法來評(píng)價(jià)黃皮果汁的抗氧化活性，結(jié)果表明：2種測(cè)定方法均表現(xiàn)出不同品種之間的抗氧化能力存在明顯差異，且不同測(cè)定方法的評(píng)價(jià)結(jié)果也不盡相同(表2). 不同品種的DPPH自由基清除能力變化范圍為163.8～1 243.8 mg/L，揭陽無核最高，其次是細(xì)雞心和崛督4號(hào)，鳳梢5號(hào)最低. 不同品種的FRAP抗氧化能力在86.8～1 523.6 mg/L 之間，F(xiàn)RAP抗氧化能力較高的品種有揭陽無核、老屋2號(hào)、崛督4號(hào)、細(xì)雞心、廣雜3號(hào)，白糖的FRAP抗氧化能力最弱.

表1 不同品種黃皮果汁的基礎(chǔ)品質(zhì)Table 1 The basic qualities of fruit juice in different wampee cultivars

注：數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，表3同.

表2 不同品種黃皮果汁的抗氧化物質(zhì)質(zhì)量濃度及抗氧化活性Table 2 The antioxidant contents and antioxidant activities of fruit juice in different wampee cultivars

2.3 聚類分析

利用SPSS16.0對(duì)20個(gè)黃皮品種的上述10項(xiàng)理化指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖1所示，在歐氏距離6.0處可將20個(gè)黃皮品種分成3組. 第Ⅰ組包括從甜1號(hào)、白糖、冰糖、白云1號(hào)、鳳梢5號(hào)和番禺1號(hào)，這6個(gè)品種的w(可溶性糖)中等，w(可滴定酸)最低，糖酸比最高，抗氧化物質(zhì)質(zhì)量濃度低，抗氧化能力最差，風(fēng)味清甜，無酸感. 第Ⅱ組包括果選1號(hào)、后園1號(hào)、潮州2號(hào)、龍門5號(hào)、郁南無核、金雞心和江門2號(hào)，這7個(gè)品種的w(可溶性糖)最低，w(可滴定酸)最高，糖酸比最低，風(fēng)味偏酸，抗氧化物質(zhì)的質(zhì)量濃度和抗氧化能力處中等水平. 第Ⅲ組包括老屋2號(hào)、揭陽無核、崛督4號(hào)、水西雞心、廣雜3號(hào)、細(xì)雞心和金豐，這7個(gè)品種在所有品種中的w(可溶性固形物)和w(可溶性糖)最高，ω(可滴定酸)和糖酸比中等，風(fēng)味酸甜可口，抗氧化物質(zhì)的質(zhì)量濃度高，抗氧化能力最強(qiáng). 可見，通過聚類分析可以將指標(biāo)水平相近的品種聚在一起，有利于對(duì)不同目標(biāo)的篩選.

圖1 基于理化指標(biāo)的黃皮品種聚類分析的樹狀圖Figure 1 The cluster analysis dendrogram of different wampee cultivars based on physic-chemical indices

2.4 黃皮果汁中抗氧化物質(zhì)質(zhì)量濃度與抗氧化活性的相關(guān)性分析

不同種類的抗氧化物質(zhì)對(duì)不同類型水果抗氧化活性的貢獻(xiàn)有所不同，丁秀玲等[12]的研究發(fā)現(xiàn)蘋果中的總酚含量與抗氧化活性之間呈顯著正相關(guān)，而抗壞血酸對(duì)蘋果的抗氧化作用沒有顯著貢獻(xiàn). 趙金梅等[19]和DU等[26]在研究不同品種獼猴桃的抗氧化活性時(shí)發(fā)現(xiàn)：總多酚和抗壞血酸對(duì)獼猴桃果實(shí)的抗氧化作用均具有顯著貢獻(xiàn). 羅亞等[27]在對(duì)草莓果實(shí)抗氧化能力及其抗氧化活性成分進(jìn)行分析時(shí)亦發(fā)現(xiàn)：總多酚和抗壞血酸與抗氧化能力顯著相關(guān)，而類黃酮對(duì)抗氧化作用的貢獻(xiàn)很小. 吳慧等[28]對(duì)越橘果實(shí)的研究結(jié)果則表明：總多酚和類黃酮是越橘抗氧化作用的主導(dǎo)成分. 本文研究了黃皮果實(shí)中不同抗氧化物質(zhì)對(duì)抗氧化活性的貢獻(xiàn)(表3)，結(jié)果表明：ρ(抗壞血酸)、ρ(總黃酮)和ρ(總多酚)均與DPPH自由基清除能力和FRAP抗氧化能力成極顯著正相關(guān)(P<0.01)，表明抗壞血酸、總黃酮和總多酚在黃皮抗氧化能力方面均發(fā)揮重要作用，其中以總多酚和抗壞血酸的作用尤為突出. 從表3還可以看出，DPPH自由基清除能力和FRAP抗氧化能力呈極顯著正相關(guān)，這與在番石榴[29]、枇杷[30]和草莓[27]等多種水果中的研究結(jié)果相一致，說明DPPH法和FRAP法用于評(píng)價(jià)黃皮抗氧化能力是可行的.

表3 黃皮果汁的抗壞血酸、總黃酮、總多酚的質(zhì)量濃度與抗氧化活性的相關(guān)性分析Table 3 The correlation analysis of the antioxidant activities and the contents of ascorbate, total flavonoids and total phenolics in wampee fruit juice

注：**表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)

3 結(jié)論

不同品種黃皮果汁的基礎(chǔ)品質(zhì)、抗氧化功能成分以及抗氧化活性存在明顯的差異，表明基因型是決定其品質(zhì)和抗氧化能力的重要因素. 基于10項(xiàng)理化指標(biāo)的聚類分析可將20個(gè)黃皮品種分為3大類群：第Ⅰ組糖酸比最高，風(fēng)味清甜，ρ(抗氧化物質(zhì))和抗氧化活性最低；第Ⅱ組的w(可滴定酸)最高，風(fēng)味偏酸；第Ⅲ組的w(可溶性固形物)、ρ(抗氧化物質(zhì))和抗氧化活性均最高，風(fēng)味品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最好. 可見，通過聚類有利于對(duì)不同目標(biāo)的篩選. DPPH自由基清除能力、FRAP抗氧化能力均與ρ(抗壞血酸)、ρ(總黃酮)和ρ(總多酚)呈極顯著正相關(guān)，表明抗壞血酸、總黃酮和總多酚是黃皮果汁抗氧化作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ). 20個(gè)品種中揭陽無核的w(可溶性固形物)最高，糖酸比適中，ρ(總多酚)、DPPH自由基清除能力以及FRAP抗氧化能力最強(qiáng)，可為黃皮果汁功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供材料.