田小娟，張 靜

（漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 漯河 462002）

根據(jù)相關(guān)醫(yī)學(xué)研究顯示，在前列腺疾病治療方面具有重要作用的物質(zhì)是PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，其中的雷帕霉素靶蛋白能夠在細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的過(guò)程中完成自身的控制和引導(dǎo)作用，有效調(diào)節(jié)不同細(xì)胞包括存活、增殖。

1 實(shí)驗(yàn)材料

材料準(zhǔn)備需要前列腺癌PC-3細(xì)胞株，并且保證其中含有10%的FBS，放置于CO2的飽和濕度敷箱培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃；

前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1細(xì)胞，RWPE-1細(xì)胞在含0.05 mg/ml BPE和5ng/ml EGF的K-SFM，培養(yǎng)溫度為37℃；

人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116細(xì)胞株，培養(yǎng)環(huán)境為含有10%的FBS（Hyclone），100 U/ml 青霉素，100 U/ml鏈霉素的DMEM（High Glucose）中，培養(yǎng)溫度為37℃；

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

（1）96孔板接種細(xì)胞：PC-3和RWPE-1、HCT-116接種濃度為5000個(gè)/孔、2000個(gè)/孔。每9個(gè)實(shí)驗(yàn)組為96孔板，每一個(gè)孔板上有6個(gè)復(fù)孔。其中的培養(yǎng)要求是0.25%胰酶-EDTA能夠在常規(guī)環(huán)境中完全消化，并且成為單個(gè)細(xì)胞懸液。培養(yǎng)的要求為CO2的飽和濕度敷箱培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)。

（2）刺激細(xì)胞：次日鹽酸川芎嗪干預(yù)細(xì)胞，刺激濃度依次為0、0.5、1.3、2.5、3.5、4.9、6.2、8.4 mM。培養(yǎng)的要求為CO2的飽和濕度敷箱培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)。

（3）呈色：在上述步驟進(jìn)行之后，在培養(yǎng)容器中添加5 mg/ml的MTT溶液20 ul（每孔劑量），并且保證培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定和正常，此次的培養(yǎng)時(shí)間為3小時(shí)左右。在此基礎(chǔ)上，將上清液吸走，并且在培養(yǎng)孔中添加150 ulDMSO。值得注意是添加此類試劑之后，液體中極易出現(xiàn)沉淀物，需要將試管輕輕晃動(dòng)，保證添加劑能夠充分溶解。

（4）比色：用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸收值，制成Excel表格，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

以上的實(shí)驗(yàn)環(huán)境需要重復(fù)三次，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確和有效。

2.2 Western blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白，mTOR蛋白及其下游關(guān)鍵蛋白及其磷酸化蛋白的表達(dá)

（1）SDS-PAGE凝膠電泳

灌分離膠：TEMED加入的計(jì)量與分子量的不同配置不同濃度之間具有密切的關(guān)系。在灌膠的過(guò)程中應(yīng)當(dāng)保證灌膠的速度，在灌膠高度在容器5.5 cm左右即可停止。進(jìn)而使用雙蒸水緩慢封閉，在操作的過(guò)程中應(yīng)當(dāng)保證動(dòng)作的輕柔，結(jié)束操作之后將其放置，并且自由凝固，時(shí)間為30 min。

灌濃縮膠：30 min自由凝固結(jié)束之后，觀察容器中水和膠水之間中存在一條明顯的折線就能夠證明膠水已經(jīng)凝固。這種情況下可以傾倒上層水，之后使用濾紙吸干水分。將配好的濃縮膠快速灌入，結(jié)束操作之后將其放置，并且自由凝固，時(shí)間為30 min。

上樣，加入蛋白樣本。

電泳，根據(jù)目的蛋白的分子量調(diào)節(jié)電壓。當(dāng)電泳至膠的下緣時(shí)停止電泳。

（1）蛋白轉(zhuǎn)膜

切膠：電泳完畢后，將玻璃板放入水中小心撬開(kāi)，把膠取出，參照marker按照目的蛋白的分子量大小切膠，切完之后測(cè)量長(zhǎng)和寬，放入新配置的轉(zhuǎn)膜緩沖液中室溫?fù)u晃。

剪膜和濾紙：換新的清潔干燥的一次性手套，依照膠的長(zhǎng)和寬裁剪PVDF膜和濾紙。首先將剪好的PVDF膜放在甲醇中活化30 s，然后將活化的PVDF膜和濾紙放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中室溫?fù)u晃15 min。

（2）一抗孵育

磷酸化一抗稀釋液：5%的牛血清白蛋白（TTBS稀釋）；非磷酸化一抗稀釋液：1%的牛奶（TPBS稀釋）。將膜放入加了一抗的稀釋液中，置于4℃冰箱緩慢搖床，放置12小時(shí)。

（3）二抗孵育

24小時(shí)之后，將膜取出用磷酸化或非磷酸化漂洗三次，每次十分鐘。磷酸化二抗稀釋液：3%的牛奶稀釋；非磷酸化二抗稀釋液：3%的牛奶稀釋，將膜放入加了二抗的二抗稀釋液中，室溫慢搖3小時(shí)。孵育完畢后用磷酸化或非磷酸化漂洗三次，每次十分鐘。

（4）化學(xué)發(fā)光，顯影

按照試劑的相關(guān)說(shuō)明將其中的發(fā)光試劑混合，并且盡量保證試劑能夠溶解均勻。

2.3 m7GTP 瓊脂糖珠 pulldown檢測(cè)

2.3.1 細(xì)胞準(zhǔn)備

對(duì)于PC-3細(xì)胞，0.25%胰酶-EDTA進(jìn)行常規(guī)消化，PC-3和RWPE-1、HCT-116接種濃度為5000個(gè)/孔、2000個(gè)/孔。每9個(gè)實(shí)驗(yàn)組為96孔板，每一個(gè)孔板上有6個(gè)復(fù)孔。45萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/瓶。并且將以上的細(xì)胞進(jìn)行24h刺激，換取新鮮培養(yǎng)基并加入鹽酸川芎嗪，使其終濃度分別達(dá)到4.9、6.2、8.4mM，持續(xù)培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)。

2.3.2 蛋白樣品的制備

（1）保證培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)24 h，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗，沖洗使用的試劑是4℃預(yù)冷的PBS。每瓶細(xì)胞將PBS盡量吸棄干凈，而后加入200 ul含蛋白酶抑制劑的RIPA，冰上裂解20 min。

（2）在上述工作完成之后，使用等移液槍緩慢將細(xì)胞碎片吹打至瓶底一角（稱為裂解蛋白液），在裂解蛋白液的過(guò)程中應(yīng)當(dāng)保證不要?dú)馀荨⒘呀庵蟮脑噭┓旁诒响o置10 min左右，與此同時(shí)將離心機(jī)4℃預(yù)冷。

（3）將裂解蛋白液移至EP管內(nèi)，放入預(yù)冷的離心機(jī)中，12000 r，30 min心，同時(shí)打開(kāi)紫外分光光度儀進(jìn)行初始化。

（4）上述實(shí)驗(yàn)步驟完成之后，將上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管內(nèi)，注意標(biāo)記。從三個(gè)EP管中各吸取2 ul的樣本各加入到2 ml考馬斯亮藍(lán)G250中充分混勻，并且靜置反應(yīng)10 min。

（5）取3×10 ul共三管，用不含蛋白酶抑制劑的RIPA洗3次，在上述步驟進(jìn)行之后，在培養(yǎng)容器中添加5 mg/ml的MTT溶液20 ul（每孔劑量），并且保證培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定和正常，此次的培養(yǎng)時(shí)間為3小時(shí)左右。在此基礎(chǔ)上，將上清液吸走，并且在培養(yǎng)孔中添加150 ul DMSO。需要將培養(yǎng)皿放在搖床上輕輕搖動(dòng)，保證其中的試劑能夠充分溶解。

2.3.3 蛋白樣品的制備

（1）在以上工序完成4 h之后，把三個(gè)EP管均放置在4℃預(yù)冷的離心機(jī)中，清洗EP管，清洗劑使用含蛋白酶抑制劑的RIPA。清洗的時(shí)間階段為3分鐘一次。

（2在）三個(gè)EP管中分別加入2×SDS+β-硫基乙醇25 ul，在加入之前根據(jù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的溫度進(jìn)行適當(dāng)預(yù)熱，將以上的試劑于沸水中煮10 min，備用。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 細(xì)胞增殖的檢測(cè)

MTT檢測(cè)刺激濃度依次為0、0.5、1.3、2.5、3.5、4.9、6.2、8.4 mM的鹽酸川芎嗪刺激前列腺癌PC-3細(xì)胞48 h和72 h，對(duì)人體結(jié)腸直腸癌細(xì)胞HCT-116和前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1刺激在48 h小時(shí)之后細(xì)胞出現(xiàn)的變化情況，由此可見(jiàn)不同濃度的鹽酸川芎嗪對(duì)于RWPE-1進(jìn)行刺激的效果并沒(méi)有明顯的變化，即（P＞0.05）。其中細(xì)胞具有明顯改善和變化的是7.2mM濃度以上的鹽酸川芎嗪，與此同時(shí)1.2 mM的鹽酸川芎嗪對(duì)于腫瘤細(xì)胞PC-3細(xì)胞和HCT-116的抑制作用也是十分明顯的，這就能夠判斷出腫瘤細(xì)胞對(duì)于鹽酸川芎嗪的刺激作用具有較為明顯的依賴性。不同濃度的鹽酸川芎嗪對(duì)于腫瘤細(xì)胞的影響存在一定的時(shí)間和濃度的關(guān)聯(lián)性和依賴關(guān)系，在刺激時(shí)間在48h和72h狀態(tài)下，IC50分別為7.2 mM和4.8 mM。

3.2 Western blotting檢測(cè)mTOR蛋白和下游關(guān)鍵蛋白及其磷酸化蛋白的表達(dá)

根據(jù)Western blotting檢測(cè)結(jié)果能夠表現(xiàn)出，在相同的環(huán)境背景下，4.8 mM、7.2 mM的鹽酸川芎嗪對(duì)于p-mTOR的表達(dá)都具有明顯的影響作用，并且應(yīng)用在p-p70S6k、p-S6、p-4E和p-4E-BP1的表達(dá)的影響上效果相同，其中（P＜0.01）。但是鹽酸川芎嗪對(duì)于mTOR、p70S6、S6、4E的表達(dá)影響下并沒(méi)有明顯的關(guān)聯(lián)性和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），由此可見(jiàn)，鹽酸川芎嗪可能通過(guò)抑制mTOR及其下游相關(guān)蛋白的磷酸化水平發(fā)揮作用。

4 結(jié)束語(yǔ)

鹽酸川芎嗪在世界范圍內(nèi)的臨床診療中具有廣泛并且良好的使用效果，由于在治療的過(guò)程中副作用較小，進(jìn)而成為了醫(yī)生們使用的高頻藥物。近年來(lái)，鹽酸川芎嗪逐漸被發(fā)現(xiàn)在治療前列腺腫瘤的治療中具有良好的效果，但是其中存在的安全隱患和局限性仍舊未能得到良好的整合和研究。在診療過(guò)程中使用抗雄激素療法能夠取得相應(yīng)的治療成效，然而患者在接受診療的過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)對(duì)激素治療的抵抗現(xiàn)象，進(jìn)而影響了前列腺治療的穩(wěn)定性和有效性。長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)對(duì)于治療前列腺的方式方法均沒(méi)有穩(wěn)定的界定和實(shí)施，進(jìn)而逐漸成為前列腺疾病治療的關(guān)鍵性難題。鹽酸川芎嗪通過(guò)mTOR信號(hào)通路和凋亡通路抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞具有良好的診療效果，值得在臨床中廣泛使用。