蛋氨酸限制對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠胰島功能損傷的改善作用

羅婷玉，楊玉輝，許云聰，高秋麗，施用暉，吳國卿，樂國偉,*

（1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

近年來，肥胖的發(fā)病率逐年增加，引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注。長(zhǎng)期肥胖會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗（insulin resistance，IR），具有進(jìn)一步引發(fā)2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。IR增加了機(jī)體對(duì)胰島素合成和分泌的需求，在胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所合成的蛋白中超過50%為前胰島素，因此當(dāng)機(jī)體發(fā)生IR時(shí)，胰腺通過增加胰島素的合成以維持正常的血糖水平，從而導(dǎo)致β細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷過大，產(chǎn)生過量的錯(cuò)誤折疊蛋白，因而產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致β細(xì)胞功能障礙并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[3-4]。大量動(dòng)物及人體研究表明，IR個(gè)體內(nèi)參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)信號(hào)分子，如C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）、肌醇需求激酶1（inositol requiring enzyme 1，IRE1）和重鏈結(jié)合蛋白（heavychain binding protein，Bip）在β細(xì)胞中均高度表達(dá)[5-6]。此外，研究發(fā)現(xiàn)胰島β細(xì)胞的抗氧化酶水平較低[7]，在肥胖狀態(tài)下極易產(chǎn)生過量脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其可進(jìn)一步加劇β細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，影響胰島素的合成與分泌，損傷胰島細(xì)胞，甚至造成胰腺功能性障礙[8-9]。

自O(shè)rentreich等發(fā)現(xiàn)將飲食中的蛋氨酸含量從0.86%限制到0.17%可以增加30%～40%的壽命以來[10]，對(duì)飲食蛋氨酸限制（methionine restriction，MR）的研究日益增多且逐步深入，研究發(fā)現(xiàn)MR在降低體質(zhì)量、抗炎、減輕氧化應(yīng)激以及在增加胰島素敏感性等方面均有顯著的效果[11-13]。與能量限制和其他方法相比，MR的優(yōu)勢(shì)在于它只通過限制飲食中的蛋氨酸攝入量而非減少正常的飲食攝入來改善胰島素敏感性。Lees等[14]發(fā)現(xiàn)MR可以逆轉(zhuǎn)與年齡相關(guān)的IR，并證明胰島素敏感性的改善并不是減輕體質(zhì)量后的間接結(jié)果，MR可通過某些因素直接影響胰島素敏感性。胰腺作為胰島素分泌的重要組織，在調(diào)控機(jī)體糖代謝、改善IR方面發(fā)揮著巨大作用。然而目前還鮮有研究報(bào)道MR對(duì)于高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠胰腺組織損傷的影響。因此，本實(shí)驗(yàn)以C57BL/6J小鼠為研究對(duì)象，利用高脂飲食誘導(dǎo)肥胖模型，探究MR對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠胰腺保護(hù)作用，為肥胖、IR以及糖尿病人群的飲食策略提供新的思路和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

C57BL/6J雄性小鼠（4 周齡，約18 g），購于南京生物醫(yī)藥研究院，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2015-0001，合格證號(hào)201605176。

血糖試紙 強(qiáng)生（上海）醫(yī)療器械有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）、蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色液 南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑 美國Biomiga公司；RNA提取試劑盒、SYBR Green Master Mix諾維贊生物科技公司；基因引物 上海捷瑞生物工程公司；小鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 慧嘉生物科技公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

倍優(yōu)血糖儀 強(qiáng)生（上海）醫(yī)療器材有限公司；5804R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；Epoch酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek公司；ETC811聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀 東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；7900HT Fast實(shí)時(shí)熒光PCR儀美國ABI公司；石蠟組織切片機(jī) 德國Leica公司；BX43F顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物飼喂及分組

表 1 飼料組成Table 1 Compositions of experimental diets g/100 g

本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)江南大學(xué)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，許可證號(hào)JN.No.20161207-20170728，按照國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利指導(dǎo)方針進(jìn)行。將210 只C57BL/6J雄性小鼠以正常飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按照體質(zhì)量隨機(jī)分成兩組：正常飲食組（CON組，n＝30，0.86%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）蛋氨酸+4%脂肪）和高脂飲食組（HF組，n＝180，0.86%蛋氨酸+20%脂肪）。10 周后，HF組有120 只小鼠成功建立肥胖模型（肥胖度大于20%）。將成功建立肥胖模型的小鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分成4 組：1）高脂飲食組（HF組，n＝30）；2）高脂+MR飲食組（HF+MR組，n＝30，0.17%蛋氨酸+20%脂肪）；3）恢復(fù)正常飲食組（C*組，n＝30，0.86%蛋氨酸+4%脂肪）；4）恢復(fù)正常+MR飲食組（C*+MR組，n＝30，0.17%蛋氨酸+4%脂肪）。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，12 h/12 h晝夜循環(huán)光照，環(huán)境溫度（22f2）℃、相對(duì)濕度（50f10）%，保持飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均自由飲水采食，每周稱體質(zhì)量并記錄，采食量分別在造模成功分組后第8、16、24周采用綜合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)系統(tǒng)測(cè)定。飼料配方如表1所示。

1.3.2 口服糖耐量測(cè)定

造模成功后，小鼠隔夜禁食不禁水12 h，尾部采血測(cè)0 min血糖濃度；質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%葡萄糖溶液以2 g/kgmb灌胃后，分別在15、30、60、90、120 min測(cè)血糖濃度，并計(jì)算血糖曲線下面積（area under curve，AUC）。

1.3.3 血液、胰腺樣品的采集

飼養(yǎng)結(jié)束后，小鼠宰殺前禁食不禁水12 h，稱體質(zhì)量，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，心臟取血，放入肝素鈉抗凝管中，其余血液放置30 min后4 ℃、4 000 r/min離心10 min，取上層血漿，-80 ℃保存?zhèn)溆谩囝i處死，冰上迅速取胰腺，其中取0.1 g左右胰腺組織置于TRIzol試劑中，剪碎，-80 ℃保存用于總RNA的提??；取約0.1 g胰腺組織浸入體積分?jǐn)?shù)4%中性甲醛溶液中固定，4 ℃保存用于石蠟切片觀察組織形態(tài)。

1.3.4 血漿及胰腺指標(biāo)測(cè)定

空腹胰島素以及血漿和胰腺T-AOC、MDA、GSH、GSSG、GSH-Px水平均按照試劑盒說明書測(cè)定。胰島素抵抗指數(shù)（insulin resistance index，HOMA-IR）按下式計(jì)算。

1.3.5 血漿和胰腺H2S水平測(cè)定

取100 μL樣品，加入0.25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%醋酸鋅溶液和0.45 mL雙蒸水，室溫放置10 min；加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液0.25 mL，4 ℃、14 000hg離心10 min；取上清液600 μL，加入對(duì)苯二胺鹽酸鹽溶液（20 mmol/L）133 μL以及FeCl3（30 mmol/L）133 μL，充分混勻；室溫靜置20 min，于670 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。用Na2S標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 胰腺HE染色

胰腺在甲醛中固定后進(jìn)行乙醇梯度脫水，二甲苯透明，在包埋機(jī)中將樣品浸入石蠟包埋；預(yù)冷后將蠟塊固定在切片機(jī)上切成5 μm薄片，溫水展開后平貼于載玻片上；HE染色嚴(yán)格遵循試劑盒說明書進(jìn)行，滴少許中性樹脂封片，自然通風(fēng)晾干；置于顯微鏡下200 倍放大觀察胰腺切片并采集圖片。

1.3.7 胰腺總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

用TRIzol法提取胰腺中的總RNA，通過測(cè)定溶液中吸光度比值（A260nm/A280nm）確定所得RNA的純度，測(cè)得吸光度比值在1.8～2.0之間可用于下一步實(shí)驗(yàn)。加入適量DEPC水稀釋至1 μg/mL，取2.0 μg模板RNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：37 ℃，1.5 h；95 ℃，5 min；4 ℃冷卻。反轉(zhuǎn)錄所得cDNA存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

參照試劑盒說明書，以β-actin為內(nèi)標(biāo)，測(cè)定B細(xì)胞淋巴瘤基因2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bcl-2同源促凋亡基因（Bcl-2 associated protein X，Bax）、轉(zhuǎn)錄因子X盒結(jié)合蛋白-1（X-box binding protein-1，Xbp-1）、胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase，CSE）、胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-β-synthase，CBS）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體2（glucose transporter 2，GLUT2）、肌腱膜纖維肉瘤腫瘤基因同系物A（v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homologue A，MafA）、十二指腸同源框因子-1（pancreatic duodenal homeobox-1，Pdx-1）、CHOP、IRE1-α和BipmRNA的表達(dá)量，引物序列如表2所示。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)各模板的Ct值，通過2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量。反應(yīng)體系如下：0.4 μL上游引物（10 μmol/L）、0.4 μL下游引物（10 μmol/L）、5.4 μL SYBR Green Master Mix、3.7 μL無菌水和0.5 μL cDNA模板，形成10 μL體系。擴(kuò)增條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性20 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)40 次；72 ℃終末延伸2 min；4 ℃冷卻。

表 2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 2 Sequences of primers used for quantitative real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組間的比較采用單因素方差分析，對(duì)滿足方差齊性的結(jié)果用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，方差不齊時(shí)采用Tamhane檢驗(yàn)。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 MR對(duì)肥胖小鼠體質(zhì)量、采食量和能量攝入的影響

由圖1可知，與CON組小鼠相比，HF組小鼠體質(zhì)量顯著增加（P＜0.05）；HF+MR組小鼠體質(zhì)量顯著低于HF組小鼠（P＜0.05）；C*組小鼠體質(zhì)量停止增長(zhǎng)，并在16 周后出現(xiàn)下降趨勢(shì)；與C*組小鼠相比，C*+MR組小鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05）。

圖 1 MR對(duì)肥胖小鼠體質(zhì)量的影響Fig. 1 Effect of dietary MR on body mass of obese mice

表 3 MR對(duì)肥胖小鼠采食量和能量攝入的影響Table 3 Effect of dietary MR on food intake and energy intake

由表3可知，在8、16 周和24 周，與CON組小鼠相比，HF組小鼠采食量顯著下降，能量攝入顯著增加（P＜0.05）；與HF組小鼠相比，HF+MR組小鼠以及C*組小鼠采食量和能量攝入均顯著增加（P＜0.05）；與C*組小鼠相比，C*+MR組小鼠采食量和能量攝入量均顯著增加。

2.2 MR對(duì)肥胖小鼠血糖、胰島素水平、HOMA-IR和口服糖耐量的影響

由表4可知，8～24 周，與CON組小鼠相比，HF組小鼠空腹血糖水平顯著增加（P＜0.05）；與HF組小鼠相比，HF+MR組小鼠以及C*組小鼠空腹血糖水平顯著降低（P＜0.05）；與C*組小鼠相比，C*+MR組小鼠空腹血糖水平顯著下降（P＜0.05）；盡管HF+MR組小鼠血糖水平高于C*+MR組，但在8 周后無顯著性差異。同CON組小鼠相比，HF組小鼠空腹胰島素水平在8、16 周和24 周顯著上升（P＜0.05）；與HF組小鼠相比，HF+MR組小鼠空腹胰島素水平在8、16 周和24 周均顯著下降（P＜0.05）；C*組小鼠與C*+MR組小鼠空腹胰島素水平無顯著性差異；此外，24 周時(shí)，HF+MR組小鼠與C*+MR組小鼠空腹胰島素水平無顯著性差異。HOMA-IR及口服糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，HF組小鼠顯著高于CON組；HF+MR組小鼠顯著低于HF組（P＜0.05），且與C*+MR組小鼠無顯著性差異。

表 4 MR對(duì)肥胖小鼠空腹血糖、空腹胰島素水平和HOMA-IR的影響Table 4 Effect of dietary MR on fasting blood glucose and plasma insulin levels and insulin resistance index

圖 2 MR對(duì)肥胖小鼠24 周時(shí)糖耐量（A）和AUC（B）的影響Fig. 2 Effect of dietary MR on glucose tolerance test (A) and area under curve (B) at 24 weeks

2.3 MR對(duì)肥胖小鼠胰腺組織形態(tài)的影響

圖 3 胰腺HE染色結(jié)果（200×）Fig. 3 Pancreatic hematoxylin eosin staining (200 ×)

如圖3所示，CON組小鼠胰島呈圓形，胞漿界限清晰，胰島β細(xì)胞大小一致，核染色質(zhì)清晰；與CON組相比，HF組胰島β細(xì)胞形態(tài)不一，胞漿界限不清晰；與HF組小鼠相比，HF+MR組、C*組以及C*+MR組小鼠胰島胞漿略有不均勻，但胞漿界限清晰。

2.4 MR對(duì)肥胖小鼠血漿氧化還原狀態(tài)的影響

表 5 飲食MR對(duì)肥胖小鼠血漿氧化還原狀態(tài)的影響Table 5 Effect of MR on plasma redox status in obese mice

由表5可知，在16 周和24 周，HF組小鼠較CON組血漿GSH-Px水平顯著下降（P＜0.05），HF+MR組小鼠血漿GSH-Px水平較HF組小鼠顯著增加（P＜0.05）；C*、HF+MR組與C*+MR組小鼠GSH-Px水平無顯著性差異。HF+MR組小鼠血漿GSH/GSSG較HF組小鼠在8、16 周和24 周時(shí)顯著增加（P＜0.05）；C*+MR組小鼠較C*組小鼠GSH/GSSG在8 周顯著增加（P＜0.05），16 周和24 周無顯著性差異。3 個(gè)周期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HF組小鼠較CON組小鼠血漿T-AOC顯著降低（P＜0.05），HF+MR組小鼠較HF組小鼠血漿T-AOC顯著增加（P＜0.05）；16 周及24 周時(shí)，C*+MR組小鼠較C*組小鼠血漿T-AOC顯著增加（P＜0.05），C*+MR組與HF+MR組小鼠相比無顯著性差異。3 個(gè)周期中，與CON組相比，HF組小鼠MDA水平顯著增加（P＜0.05）；HF+MR組小鼠較HF組小鼠MDA水平顯著下降（P＜0.05）；C*+MR組小鼠較C*組小鼠MDA水平顯著下降（P＜0.05）；C*+MR組與HF+MR組小鼠無顯著性差異。

2.5 MR對(duì)肥胖小鼠胰腺氧化還原狀態(tài)的影響

由表6可知，CON組、HF組、HF+MR組小鼠胰腺GSH水平3 個(gè)周期均無顯著性差異；16 周及24 周時(shí)，C*+MR組小鼠GSH水平比C*組小鼠顯著下降（P＜0.05）。與CON組小鼠相比，HF組小鼠胰腺GSH/GSSG從16 周開始顯著下降（P＜0.05）；HF+MR組小鼠胰腺GSH/GSSG較HF組小鼠在24 周顯著增加（P＜0.05），且與C*+MR組小鼠無顯著性差異。16 周及24 周時(shí)，HF組小鼠較CON組小鼠胰腺T-AOC顯著降低（P＜0.05），HF+MR組小鼠較HF組小鼠胰腺T-AOC顯著增加（P＜0.05）；8 周時(shí)，C*+MR組小鼠較C*組小鼠胰腺T-AOC顯著增加（P＜0.05），16 周及24 周時(shí)無顯著性差異。3 個(gè)周期中，與CON組相比，HF組小鼠MDA水平呈增加趨勢(shì)，8 周和16 周顯著增加（P＜0.05）；與HF組小鼠相比，HF+MR組小鼠3 個(gè)周期的MDA水平均顯著下降（P＜0.05）；C*+MR組小鼠與C*組小鼠MDA水平無顯著性差異；HF+MR組與C*+MR組小鼠相比呈下降趨勢(shì)，3 個(gè)周期均有顯著性差異（P＜0.05）。

表 6 飲食MR對(duì)肥胖小鼠胰腺氧化還原狀態(tài)的影響Table 6 Effect of MR on pancreas redox status in obese mice

2.6 MR對(duì)肥胖小鼠血漿和胰腺H2S水平以及胰腺H2S合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖4所示，16 周及24 周，HF組小鼠血漿以及胰腺H2S水平較CON組小鼠顯著下降（P＜0.05），HF+MR組小鼠血漿以及胰腺H2S水平較HF組小鼠顯著增加（P＜0.05）；C*組、HF+MR組與C*+MR組小鼠血漿H2S水平無顯著差異；8 周時(shí)，C*+MR組比C*組小鼠胰腺H2S水平顯著上升（P＜0.05），16 周及24 周無顯著性差異。16 周及24 周，HF組小鼠胰腺CBSmRNA表達(dá)量較CON組小鼠顯著下降（P＜0.05）；8 周和16 周HF+MR組小鼠胰腺CBSmRNA表達(dá)量較HF組顯著增加（P＜0.05）；8 周及24 周，C*+MR組較C*組小鼠CBSmRNA表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）。與CON組相比，HF組CSEmRNA表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）；8 周和16 周HF+MR組小鼠CSEmRNA表達(dá)量較HF組小鼠顯著增加（P＜0.05）；24 周時(shí)，C*+MR組小鼠胰腺CSEmRNA表達(dá)量較C*組顯著增加（P＜0.05）。

圖 4 MR對(duì)肥胖小鼠血漿（A）、胰腺H2S含量（B）、胰腺CBS（C）和胰腺CSE（D）mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 4 Effect of dietary MR on H2S levels in plasma (A) and pancreas (B), CBS (C) and CSE (D) mRNA expression level in pancreas of obese mice

2.7 MR對(duì)肥胖小鼠胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖5所示，HF組小鼠較CON組小鼠CHOP、IRE1-α和Xbp-1mRNA表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，其中CHOP基因表達(dá)量在3 個(gè)周期均顯著增加（P＜0.05），IRE1-α和Xbp-1表達(dá)量均在16 周及24 周顯著增加（P＜0.05）；HF+MR組小鼠較HF組小鼠CHOP、IRE1-α和Xbp-1表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，其中CHOP基因表達(dá)量在3 個(gè)周期均顯著降低（P＜0.05），IRE1-α和Xbp-1表達(dá)量均在16 周及24 周顯著降低（P＜0.05）；與C*組、HF+MR組小鼠相比，C*+MR組小鼠CHOP、IRE1-α和Xbp-1mRNA表達(dá)量無顯著性差異；BipmRNA表達(dá)量在不同組小鼠中均無顯著性差異。

圖 5 MR對(duì)肥胖小鼠胰腺CHOP（A）、IRE1-α（B）、Bip（C）和Xbp-1（D）mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 5 Effect of dietary MR on CHOP (A), IRE1-α (B), Bip (C) and Xbp-1 (D) mRNA expression level in pancreas of obese mice

2.8 MR對(duì)肥胖小鼠胰腺組織細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖6所示，與CON組小鼠相比，HF組小鼠BaxmRNA表達(dá)量上升，其中24 周差異顯著；Bcl-2mRNA表達(dá)量下降，其中16 周及24 周差異顯著（P＜0.05）；與HF組小鼠相比，HF+MR組小鼠BaxmRNA表達(dá)量3 個(gè)周期均顯著下降（P＜0.05），Bcl-2mRNA表達(dá)量在16 周和24 周顯著上升（P＜0.05）；與C*組小鼠相比，C*+MR組小鼠BaxmRNA表達(dá)量下降，Bcl-2mRNA表達(dá)量上升，均在第8周有顯著差異（P＜0.05）；C*+MR組小鼠同HF+MR組小鼠BaxmRNA表達(dá)量無顯著性差異；24 周時(shí)C*+MR組小鼠同HF+MR組小鼠Bcl-2mRNA表達(dá)量無顯著性差異。

圖 6 MR對(duì)肥胖小鼠胰腺Bax（A）和Bcl-2（B）mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 6 Effect of dietary MR on Bax (A) and Bcl-2 (B) mRNA expression level in pancreas of obese mice

2.9 MR對(duì)肥胖小鼠胰腺胰島素分泌相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖 7 MR對(duì)肥胖小鼠胰腺M(fèi)afA（A）、Pdx-1（B）和GLUT2（C）mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 7 Effect of dietary MR on MafA (A), Pdx-1 (B) and GLUT2 (C)mRNA expression level in pancreas of obese mice

如圖7所示，3 個(gè)不同實(shí)驗(yàn)周期中，HF組小鼠較CON組小鼠MafA和Pdx-1mRNA表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；HF+MR組小鼠較HF組小鼠MafA和Pdx-1mRNA表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）；C*+MR組小鼠與C*組小鼠相比MafA和Pdx-1mRNA表達(dá)量均上升，其中8 周和24 周時(shí)差異顯著（P＜0.05）；8 周和24 周時(shí)C*+MR組小鼠同HF+MR組小鼠相比無顯著性差異。GLUT2mRNA在不同周期及不同組小鼠胰腺中的表達(dá)量均無顯著差異。

3 討 論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MR在增加肥胖小鼠采食量和能量攝入的條件下，能夠降低肥胖小鼠的體質(zhì)量，說明MR具有非常有效的減肥降脂作用，這與本課題組之前的研究結(jié)果一致[15-16]。另外，MR也能夠改善IR，使得肥胖小鼠的血糖維持在正常水平。過去的研究也報(bào)道MR能夠改善IR，增加胰島素敏感性[17-18]。胰島β細(xì)胞在分泌胰島素、維持機(jī)體血糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了重要的作用，肥胖引起的氧化應(yīng)激可損傷胰島β細(xì)胞結(jié)構(gòu)[19]。本研究的胰腺組織HE染色切片結(jié)果顯示，HF+MR和C*+MR組小鼠均有較為均勻的胰島胞漿，胞漿界限較為清楚，說明MR能夠有效改善高脂誘導(dǎo)的小鼠胰腺組織損傷。許多研究表明，胰島β細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激十分敏感[20]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，CHOP表達(dá)增加，Bip與IRE1-α等蛋白相解離，激活的IRE1-α特異性剪切Xbp-1，促進(jìn)Xbp-1s轉(zhuǎn)錄[4,9]。長(zhǎng)期高脂飲食可以破壞機(jī)體氧化還原體系，進(jìn)一步造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，損傷胰腺。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MR可顯著降低肥胖小鼠胰腺CHOP、IRE1-α和Xbp-1基因的表達(dá)水平，說明MR能夠改善肥胖誘導(dǎo)的小鼠胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而改善胰島β細(xì)胞功能。

機(jī)體的氧化還原體系同胰腺功能密切相關(guān)，但胰島β細(xì)胞的抗氧化酶水平較低[21-22]，極易產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物。功能正常的抗氧化防御系統(tǒng)可有效調(diào)節(jié)機(jī)體的氧還原狀態(tài)，其中T-AOC是反映機(jī)體抗氧化功能的綜合性指標(biāo)；GSH-Px是過氧化物分解酶，可分解體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物；GSH可與活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）結(jié)合被氧化成GSSG，因此，GSH/GSSG可有效反映機(jī)體氧化還原狀態(tài)；MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，其可以間接反映細(xì)胞遭受ROS損傷的程度。本研究結(jié)果顯示，MR可有效降低胰腺和血漿中MDA水平，增加T-AOC、GSH-Px水平和GSH/GSSG，表明MR可能通過增加胰腺的抗氧化酶活性，從而增加胰腺抗氧化能力，減少ROS的產(chǎn)生，改善由肥胖造成的氧化應(yīng)激，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用。

有研究發(fā)現(xiàn)MR可增加機(jī)體H2S水平[23-24]，H2S作為重要的氣體信號(hào)分子，在保護(hù)胰島β細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用[25-26]，其在機(jī)體中主要通過CSE和CBS作用產(chǎn)生。有研究指出，在高脂飲食條件下，CSE基因敲除小鼠同正常小鼠相比，胰島細(xì)胞更易受到糖脂毒性的危害[27]。體外實(shí)驗(yàn)表明，將胰島細(xì)胞長(zhǎng)期暴露在H2S供體NaHS中可顯著減少細(xì)胞凋亡，其與H2S改善了胰島細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)MR顯著增加了血漿和胰腺中H2S水平，不同程度上調(diào)了CBS及CSEmRNA表達(dá)水平，提示MR可能通過增加H2S的水平改善機(jī)體氧化還原狀態(tài)，從而保護(hù)胰腺組織。此外，有研究表明，氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相互作用，互為因果。機(jī)體抗氧化水平降低，脂質(zhì)過氧化物過度累積可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原狀態(tài)失衡，蛋白錯(cuò)誤折疊增加；而蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊增加可導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生，進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體的氧化應(yīng)激[8,29]。因此，MR可能通過同時(shí)改善肥胖小鼠胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化還原狀態(tài)，維持胰島β細(xì)胞正常功能。

此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與胰島β細(xì)胞凋亡和胰島素分泌相關(guān)。CHOP表達(dá)增加會(huì)導(dǎo)致促凋亡基因表達(dá)增加，抗凋亡基因表達(dá)減少，因此細(xì)胞凋亡通路被激活，胰島β細(xì)胞凋亡增加[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，MR顯著降低了BaxmRNA表達(dá)水平，增加了Bcl-2mRNA表達(dá)水平，說明MR減少了胰島細(xì)胞凋亡。Pdx-1以及MafA對(duì)胰島細(xì)胞發(fā)育和胰島素分泌至關(guān)重要，Johnson等的研究表明Pdx-1+/-小鼠糖耐量下降、胰島素分泌減少、胰島細(xì)胞凋亡增加[31]；Allagnat等的研究表明長(zhǎng)期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)產(chǎn)生的XBP-1抑制了Pdx-1以及MafA的表達(dá)[32]。本研究結(jié)果顯示，MR顯著上調(diào)了胰腺中Pdx-1以及MafAmRNA表達(dá)水平，表明MR改善了肥胖小鼠胰腺的功能，促進(jìn)了其胰島素的分泌。GLUT2也在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成，其作為胰腺中葡萄糖的主要轉(zhuǎn)運(yùn)載體，在葡萄糖刺激促進(jìn)胰島素分泌過程中十分重要[33]。本研究結(jié)果顯示，HF組GLUT2mRNA表達(dá)水平下降，HF+MR組GLUT2mRNA表達(dá)水平增加，但均無顯著差異。提示MR促進(jìn)胰島素的分泌并非通過促進(jìn)GLUT2表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)在小鼠肥胖后，MR的減重效果在恢復(fù)正常飲食模式下效果更為顯著，其可能與飲食結(jié)構(gòu)和能量來源不同相關(guān)，而無論在高脂飲食還是恢復(fù)到正常脂肪飲食的條件下，中長(zhǎng)期飲食MR無需限制能量攝入，均能夠改善肥胖小鼠IR。而且MR限制能夠使得肥胖小鼠在兩種飲食模式下，胰腺氧化還原狀態(tài)、H2S水平、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和胰島素分泌相關(guān)基因表達(dá)水平基本一致，暗示了MR飲食在改善肥胖誘導(dǎo)的胰腺損傷時(shí)可以不需要控制能量的攝入。

綜上，飲食MR能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠胰腺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化還原狀態(tài)失衡，減少胰腺組織細(xì)胞凋亡，進(jìn)而緩解胰腺組織損傷，促進(jìn)胰腺胰島素分泌，從而起到改善肥胖小鼠IR和血糖水平的作用。本研究從飲食的角度為改善長(zhǎng)期肥胖誘導(dǎo)的IR以及胰腺損傷提供了新的思路。