植物甾醇酯對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠部分血清代謝物的影響

歐陽(yáng)鵬凌，管 玘，曲 丹，丁信文，楊 麗，宋立華,3,*

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.上海市第七人民醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科，上海 200137；3.上海交通大學(xué)陸伯勛食品安全研究中心，上海 200240）

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是由除酒精和其他對(duì)肝臟有明確損害因素導(dǎo)致的脂肪在肝細(xì)胞中過(guò)度沉積為主要特征的臨床病理表現(xiàn)[1]，包括從簡(jiǎn)單的脂肪變性發(fā)展到脂肪性肝炎、肝纖維化及肝硬化的整個(gè)疾病譜[2]。調(diào)查顯示，NAFLD的全球患病率為25.24%[3]，在我國(guó)的發(fā)病率為20.09%[4]。NAFLD的發(fā)生與2型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、慢性腎病等密切相關(guān)，是代謝綜合征在肝臟中的體現(xiàn)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者患病4 年間2型糖尿病的發(fā)病率約為9.9%[6]，而2型糖尿病患者伴有NAFLD的概率接近60%[7]。NAFLD也是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)危險(xiǎn)標(biāo)志[8]，Wong等[9]的研究顯示，84.6%的NAFLD患者體內(nèi)冠狀血管狹窄至少超過(guò)50%，而冠狀動(dòng)脈狹窄程度是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的最直接體現(xiàn)。另有研究結(jié)果表明NAFLD患者在5 年內(nèi)慢性腎病的累積發(fā)病率為3.1%，在10 年內(nèi)的累計(jì)發(fā)病率為12.2%[10]?？梢?jiàn)NAFLD與多種疾病互相關(guān)聯(lián)，已成為21世紀(jì)世界范圍內(nèi)的一個(gè)重要公共健康問(wèn)題。

肝臟是人體最大的代謝器官，參與的代謝通路十分復(fù)雜，一旦肝臟出現(xiàn)病變，難以通過(guò)檢測(cè)單一代謝物的水平來(lái)反映代謝改變的全貌，而代謝組學(xué)能夠反映經(jīng)歷一系列變化之后機(jī)體在代謝產(chǎn)物上的整體性變化，運(yùn)用此方法研究肝臟疾病的演變具有技術(shù)優(yōu)勢(shì)[9]。血清中含有1 000多種內(nèi)源性小分子代謝物，是代謝組學(xué)中非常重要的體液樣本。Barr[11]利用超高效液相色譜-質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）對(duì)NAFLD小鼠的血液進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)NAFLD模型組小鼠血清中有機(jī)酸、鞘磷脂、卵磷脂、游離脂肪酸以及膽酸含量上升。蘇趙威[12]對(duì)NAFLD大鼠血清進(jìn)行代謝組學(xué)研究，結(jié)果表明大鼠血清中糖類(lèi)、氨基酸類(lèi)和脂肪酸類(lèi)代謝物較正常組有明顯差異，提示NAFLD狀態(tài)下機(jī)體能量代謝及脂類(lèi)代謝出現(xiàn)紊亂。袁洋[13]的研究也發(fā)現(xiàn)NAFLD狀態(tài)下血清類(lèi)脂含量降低，而乳酸含量顯著升高，進(jìn)一步證明NAFLD狀態(tài)下機(jī)體代謝出現(xiàn)紊亂。上述研究結(jié)果提示，通過(guò)檢測(cè)分析血清中小分子代謝物，可在一定程度上揭示NAFLD在代謝途徑方面的致病機(jī)制及預(yù)防靶點(diǎn)。

目前，誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)NAFLD的主要方法是進(jìn)行高脂飲食的飼喂。該方法可誘導(dǎo)大鼠肥胖，使其產(chǎn)生胰島素抵抗等癥狀，能較好地體現(xiàn)人體內(nèi)出現(xiàn)NAFLD時(shí)的機(jī)制[14]。因此，從飲食調(diào)節(jié)和膳食干預(yù)的角度出發(fā)，可從源頭上對(duì)NAFLD進(jìn)行預(yù)防。植物甾醇（phytosterols，PS）是玉米、大豆等油料作物中的主要活性物質(zhì)，其酯類(lèi)形式植物甾醇酯（phytosterol esters，PSE）較PS具有更好的溶解性和吸收率[15]。前期研究發(fā)現(xiàn)PSE可顯著減輕NAFLD大鼠肝臟的脂肪變性程度[16-17]，并且其可通過(guò)調(diào)節(jié)PPAR-α、PPAR-γ等脂代謝相關(guān)基因發(fā)揮預(yù)防NAFLD的作用[16]，但具體機(jī)制不明。為進(jìn)一步探究PSE干預(yù)對(duì)NAFLD預(yù)防作用的代謝分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上利用UPLC聯(lián)用四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-quadrupole-tandem time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)檢測(cè)NAFLD大鼠血清中小分子代謝物的變化，從代謝組學(xué)的角度進(jìn)一步闡明PSE發(fā)揮NAFLD預(yù)防作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

清潔級(jí)SD大鼠，6 周齡，雄性，體質(zhì)量（170f10）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。大鼠飼料購(gòu)自福貝世亨生物醫(yī)藥（上海）有限公司?；A(chǔ)飼料組成：粗蛋白≥20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、水分≤10%、灰分≤8%、粗纖維≤5%、粗脂肪≥4%、鈣1%～1.8%、賴(lài)氨酸1.32%、蛋氨酸+胱氨酸0.78%、磷0.6%～1.2%；高脂飼料配方：基礎(chǔ)飼料52.65%、豬油21%、酪蛋白10%、蔗糖10%、麥芽糊精2.7%、預(yù)混料1.9%、膽固醇1.25%、膽鹽0.5%。

PSE混合標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥91%，包括β-谷甾醇（42.0%～55.0%）、菜油甾醇（20.0%～29.0%）、豆甾醇（12.0%～23.0%）） 巴斯夫中國(guó)有限公司；乙腈、甲醇（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity UPLC I-Class系統(tǒng)（配備二元泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱）、VION IMS Q-TOF-MS儀美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 灌胃用PSE強(qiáng)化牛奶的制備

于65 ℃水浴鍋中將PSE液化，將其與牛奶混合并通過(guò)高壓均質(zhì)乳化（20 MPa），分別制成0.05、0.10 g/mL PSE強(qiáng)化牛奶。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與樣本收集

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為以下4 組：正常對(duì)照組（NC，n＝4）、高脂模型組（HF，n＝9）、低劑量PSE組（PSE-L，n＝9）和高劑量PSE組（PSE-H，n＝9）。NC組大鼠飼喂基礎(chǔ)飼料，其余各組飼喂高脂飼料。NC和HF組灌胃給予普通純牛奶（1 mL/100 gmbgd），PSE-L和PSE-H組分別灌胃給予與NC組同體積的低（0.05 g/100 gmbgd）、高劑量（0.10 g/100 gmbgd）PSE強(qiáng)化牛奶（相當(dāng)于成人3 g/d和6 g/d的攝入量），連續(xù)灌胃12 周。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境：相對(duì)濕度為45%～65%，室溫為（25f1）℃，12 h明暗輪換采光，可自由進(jìn)食及飲水。實(shí)驗(yàn)期間每天記錄各組大鼠攝食量，每周稱(chēng)量記錄各組大鼠體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，腹腔注射40 mg/kg質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，用普通采血管于腹主動(dòng)脈取血，血液室溫凝結(jié)后離心取血清。

1.3.3 血清樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

取50 μL血清，分別加150 μL和200 μL前處理試劑甲醇-乙腈（1∶1（V/V，下同）），振蕩混合均勻，靜置2 h后于12 000 r/min離心20 min，取上清液于試劑瓶中待測(cè)。

1.3.4 UPLC-Q-TOF-MS分析

色譜條件：色譜柱為Acquity UPLC BEH C18（100 mmh2.1 mm，1.7 μm），進(jìn)樣量為1 μL，柱溫為45 ℃，流速為0.4 mL/min。流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-乙腈溶液；梯度洗脫程序?yàn)?%～20% B，1 min；20%～40% B，1.5 min；40%～100% B，6.5 min；100% B，3 min；100%～5% B，0.5 min；5% B，2 min。

質(zhì)譜條件：在正、負(fù)電噴霧電離模式下運(yùn)行。全信息串聯(lián)質(zhì)譜掃描模式：低能量（4 eV）和高能量（20～45 eV）兩種全信息串聯(lián)質(zhì)譜模式在運(yùn)行期間交替采集信息。碰撞誘導(dǎo)解離氣體：氬氣（99.999%），去溶劑化和錐形氣體：氮?dú)猓ǎ?9.5%）。掃描范圍為50～1 000 amu；一次掃描用時(shí)0.2 s；毛細(xì)管電壓分別為2 kV（正離子模式）、1 kV（負(fù)離子模式）；源偏置電壓60 V；錐形電壓40 V；去溶劑化氣體溫度450 ℃；源溫度115 ℃；錐形氣體流量50 L/h；去溶劑化氣體流量900 L/h。通過(guò)參比探針將乙腈-水-甲酸（體積比50∶49.9∶0.1）中的250 ng/mL亮氨酸腦啡肽標(biāo)準(zhǔn)校正溶液（5 μL/ min）連續(xù)輸注，從而進(jìn)行鎖定質(zhì)量校正，每30 s掃描一次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

UNIFI 1.8.1軟件用于血清代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集，在Progenesis QI v2.3軟件中導(dǎo)入原始數(shù)據(jù)并進(jìn)行峰采集、比對(duì)和歸一化，從而得到保留時(shí)間和質(zhì)荷比（m/z）等。將篩選編輯后的數(shù)據(jù)組織為二維矩陣，在SIMCA-P軟件中進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA），根據(jù)模型得到的變量權(quán)重值（VIP＞1）、最小變異系數(shù)（min CV＜30%）以及Student-t檢驗(yàn)的P值（P＜0.05）來(lái)尋找差異代謝物。在HMDB（the Human Metabolome Database）（http://www.hmdb.ca/）、LIPID MAPS（http://www.lipidmaps.org/tools/）數(shù)據(jù)庫(kù)以及UNIFI軟件中，將精確質(zhì)量和高能質(zhì)譜中的碎片做進(jìn)一步比對(duì)，從而鑒定化合物。運(yùn)用EZinfor V3.0.3軟件對(duì)得到的歸一化峰強(qiáng)度做進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)Metabo Analyst（http://www.metaboanalyst.ca/faces/upload/PathUploadView.xhtml）等在線數(shù)據(jù)庫(kù)檢索差異性代謝物及其所參與的代謝通路。利用GraphPad Prism 6軟件作圖，數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 20軟件作單因素方差分析，并用多重比較法兩兩比較，P＜0.05表示兩組差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清小分子代謝物檢測(cè)不同前處理方法比較

本實(shí)驗(yàn)中150、200 μL甲醇-乙腈（1∶1）處理的血清在正、負(fù)離子模式下得到的基峰離子流圖差別不明顯，圖1為200 μL甲醇-乙腈（1∶1）處理血清后得到的基峰離子流圖。為了使樣品濃度較小時(shí)不易污染離子源，從而增加儀器的耐受性，并使蛋白質(zhì)沉淀完全，在50 μL血清中加入200 μL甲醇-乙腈（1∶1）進(jìn)行前處理。

圖 1 在UPLC-Q-TOF-MS正、負(fù)離子模式下的基峰離子流圖譜Fig. 1 Base peak ion current pattern in positive and negative modes of UPLC-Q-TOF-MS

2.2 PSE干預(yù)對(duì)NAFLD大鼠血清中小分子代謝物的影響

2.2.1 多維統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

利用SIMCA-P軟件對(duì)各組大鼠血清小分子代謝物進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析（PCA）后，可得到模型概括X矩陣解釋率（R2X），當(dāng)R2X＞0.4時(shí)說(shuō)明該模型可靠。本實(shí)驗(yàn)樣品在正離子模式下R2X＝0.78，負(fù)離子模式下R2X＝0.74，因此所建立的模型可以很好地解釋各組間差異。為了對(duì)正交信號(hào)進(jìn)行校正并運(yùn)用排列試驗(yàn)和交叉驗(yàn)證對(duì)模型的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證，以更好地區(qū)分各組間的差異，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用有監(jiān)督的多維統(tǒng)計(jì)分析（PLS-DA）法對(duì)樣品做進(jìn)一步分析，可得到R2Y和Q2兩個(gè)數(shù)據(jù)，其中R2Y可反映模型的穩(wěn)定性，其越接近于1說(shuō)明模型的穩(wěn)定性越好；Q2反映的是模型的預(yù)測(cè)性，當(dāng)Q2＞0.5時(shí)表明模型可靠。在正離子模式下R2Y＝0.65、Q2＝0.56，負(fù)離子模式下R2Y＝0.80、Q2＝0.50。由圖2中的PLS-DA得分圖可看出，PSE-H組與模型組區(qū)分較明顯，而PSE-L組與模型組差異較小。

圖 2 各組大鼠血清小分子代謝物PCA和PLS-DA得分圖Fig. 2 PCA and PLS-DA score plots for serum samples of rats from different groups

2.2.2 差異代謝物的確認(rèn)

利用TOF-MS可以通過(guò)低、高能量掃描得到低能量通道和高能量通道的質(zhì)譜圖。低能量掃描中的一級(jí)質(zhì)譜圖能提供精確相對(duì)分子質(zhì)量、分子離子峰以及加合峰的信息，可結(jié)合Mass FragmentTM軟件進(jìn)一步確定化合物的可能分子式。通過(guò)高能量掃描產(chǎn)生的碎片離子信息可以明確碎片的元素組成，推斷可能的化合物結(jié)構(gòu)，并結(jié)合已建立的MOL文件數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)化合物進(jìn)行初步的定性。圖3A、B分別為本研究得到的化合物在低、高能量掃描下的圖譜，可以看出其準(zhǔn)分子離子峰為m/z482.324 5[M+H]+；溶血卵磷脂（15∶0）的精確相對(duì)分子質(zhì)量為481.316 84。該物質(zhì)在高能量通道中的部分碎片離子如圖4所示，通過(guò)與UNIFI軟件中數(shù)據(jù)庫(kù)給出的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)從而推斷其為溶血卵磷脂（15∶0）。以此方式對(duì)正、負(fù)離子模式下得到的差異代謝物進(jìn)行篩選比對(duì)。表1為篩選后得到VIP值大于1的27 種差異代謝物的質(zhì)荷比和保留時(shí)間，以及其在HMDB、LIPID MAPS中的編號(hào)。從表1中可以看出，與HF組相比，上述差異代謝物的離子強(qiáng)度在NC組與低、高劑量PSE組（尤其是PSE-H組）中的變化趨勢(shì)基本一致（除溶血卵磷脂（18∶2(9Z,12Z)）外），說(shuō)明在高脂飲食條件下，PSE干預(yù)可糾正NAFLD病理狀態(tài)下發(fā)生的代謝紊亂。

圖 3 正離子模式下溶血卵磷脂（15∶0）的低（A）、高（B）能量譜圖Fig. 3 Low- (A) and high- (B) energy spectra of Lyso PC (15∶0) in positive ion mode

圖 4 溶血卵磷脂（15∶0）高能量譜圖中部分碎片離子Fig. 4 Selected fragment ions Lyso PC (15∶0) in high energy spectra

圖5為通過(guò)單因素方差分析得到的27 種差異代謝物在各組大鼠血清中離子強(qiáng)度的比較結(jié)果。與NC組相比，HF組27 種差異代謝物的離子強(qiáng)度均有顯著性差異（P＜0.05）。與HF組相比，PSE-H組甘油二酯（15∶0/18∶3(6Z,9Z,12Z)/0∶0、14∶0/22∶2(13Z,16Z)/0∶0）、溶血卵磷脂（18∶2(9Z,12Z)、15∶0、16∶1(9Z)、20∶3(5Z,8Z,11Z)、20∶3(8Z,11Z,14Z)、18∶1(9Z)）、磷脂酰膽堿（16∶0/P-18∶0、17∶1(10Z)/0∶0)、20∶3(8Z,11Z,14Z)/18∶0、18∶1(11Z)/20∶1(11Z)、O-18∶0/0∶0）、磷脂酸（22∶4(7Z,10Z,13Z,16Z)/0∶0）、磷脂酰乙醇胺（16∶0/0∶0、20∶3(8Z,11Z,14Z)/0∶0）、磷脂酰肌醇（20∶0/22∶2(13Z,16Z)）的離子強(qiáng)度降低，鞘磷脂（d18∶1/24∶0、d16∶1/25∶0）、鞘糖脂（d18∶1/18∶1(9Z)）、神經(jīng)酰胺（d18∶2/20∶0）的離子強(qiáng)度升高；PSE-L組甘油二酯（16∶0/20∶3(8Z,11Z,14Z)/0∶0）、二十一烷二酸和磷脂酰乙醇胺（18∶4(6Z,9Z,12Z,15Z)/18∶0）離子強(qiáng)度下降，甘油二酯（18∶1(11Z)/18∶1(11Z)/0∶0）、磷脂酰膽堿（16∶0/20∶3(5Z,8Z,11Z)）、磷脂酰乙醇胺（18∶3(6Z,9Z,12Z)/22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)）離子強(qiáng)度顯著下降。

表 1 PSE干預(yù)對(duì)NAFLD大鼠血清中差異代謝物的影響Table 1 Effect of PSE intervention on differential metabolites in the serum of NAFLD rats

圖 5 各組大鼠血清中主要差異代謝物的離子強(qiáng)度比較Fig. 5 Comparison of ionic strengths of major different metabolites in serum of rats in each group

2.2.3 代謝通路分析

將表1中差異代謝物輸入Metabo Analyst（http://www.metaboanalyst.ca/faces/upload/PathUploadView.xhtml）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行代謝通路的檢索及分析評(píng)估，構(gòu)建的代謝通路如圖6所示。圖6包含了甘油磷脂代謝、醚脂質(zhì)代謝以及糖基磷脂酰肌醇-錨生物合成這3 種代謝通路，其影響值分別為0.275、0.214 29和0.043 9。選擇影響值大于0.10的代謝通路作為潛在的靶向途徑，得到由磷脂酰膽堿（16∶0/P-18∶0、18∶1(11Z)/20∶1(11Z)、20∶3(8Z,11Z,14Z)/18∶0、16∶0/20∶3(5Z,8Z,11Z)）、磷脂酰乙醇胺（18∶3(6Z,9Z,12Z)/22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)、18∶4(6Z,9Z,12Z,15Z)/18∶0）以及溶血卵磷脂（15∶0、16∶1(9Z)、18∶1(9Z)、18∶2(9Z,12Z)、20∶3(5Z,8Z,11Z)、20∶3(8Z,11Z,14Z)）參與的甘油磷脂代謝通路（圖7）和磷脂酰膽堿（O-18∶0/0∶0）參與的醚脂質(zhì)代謝通路（圖8）。表2為這14 種VIP＞1的差異代謝物在HMDB、PubChem和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的編號(hào)。由代謝通路的分析可以看出，NAFLD病理狀態(tài)下PSE干預(yù)主要調(diào)節(jié)甘油磷脂以及醚脂質(zhì)的代謝紊亂。

圖 6 通過(guò)Metabo Analyst數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建的通路分析概要圖Fig. 6 Pathway analysis profile obtained by Metabo Analyst

圖 7 通過(guò)Metabo Analyst數(shù)據(jù)庫(kù)得到的甘油磷脂代謝通路Fig. 7 Glycerophospholipid metabolism pathway obtained by Metabo Analyst

圖 8 通過(guò)Metabo Analyst數(shù)據(jù)庫(kù)得到的醚脂質(zhì)代謝通路Fig. 8 Ether lipid metabolism pathway obtained by Metabo Analyst

表 2 參與代謝通路的差異代謝物Table 2 Differential metabolites involved in metabolic pathways

3 討 論

目前，代謝組學(xué)技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于營(yíng)養(yǎng)學(xué)、毒理學(xué)、藥物開(kāi)發(fā)等方面的研究，揭示營(yíng)養(yǎng)、毒性物質(zhì)及藥物等因素對(duì)人體或動(dòng)物體代謝的分子機(jī)制。本研究利用甲醇-乙腈（1∶1）混合試劑處理血清樣本，檢測(cè)PSE對(duì)NAFLD大鼠血清中小分子代謝物的影響，篩選出甘油二酯（14∶0/22∶2(13Z,16Z)/0∶0、15∶0/18∶3(6Z,9Z,12Z)/0∶0、16∶0/20∶3(8Z,11Z,14Z)/0∶0、18∶1(11Z)/18∶1(11Z)/0∶0）、神經(jīng)酰胺（d18∶2/20∶0）、鞘糖脂（d18∶1/18∶1(9Z)）、二十一烷二酸、溶血卵磷脂（15∶0、16∶1(9Z)、20∶3(5Z,8Z,11Z)、20∶3(8Z,11Z,14Z)、18∶1(9Z)、18∶2(9Z,12Z)）、磷脂酸（22∶4(7Z,10Z,13Z,16Z)/0∶0）、磷脂酰膽堿（16∶0/20∶3(5Z,8Z,11Z)、16∶0/P-18∶0、18∶1(11Z)/20∶1(11Z)、17∶1(10Z)/0∶0、20∶3(8Z,11Z,14Z)/18∶0、O-18∶0/0∶0）、磷脂酰乙醇胺（16∶0/0∶0、18∶3(6Z,9Z,12Z)/22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)、20∶3(8Z,11Z,14Z)/0∶0、18∶4(6Z,9Z,12Z,15Z)/18∶0）、磷脂酰肌醇（20∶0/22∶2(13Z,16Z)）、鞘磷脂（d16∶1/25∶0、d18∶1/24∶0）共27 種差異代謝物。代謝途徑檢索結(jié)果表明，部分磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺以及溶血卵磷脂參與了甘油磷脂代謝通路，磷脂酰膽堿（O-18∶0/0∶0）參與了醚脂質(zhì)代謝通路。結(jié)合代謝通路中部分差異代謝物在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的生理作用，可初步闡述PSE調(diào)節(jié)NAFLD大鼠脂代謝紊亂的作用途徑。

在27 種差異代謝物中，HF組血清中甘油二酯離子強(qiáng)度較NC組顯著升高，提示甘油磷脂代謝出現(xiàn)紊亂，這與Wang Ya等[18]的研究結(jié)果相同；而PSE組中（尤其是PSE-L組）部分甘油二酯離子強(qiáng)度顯著低于HF組。研究表明，甘油二酯與NAFLD的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[19]。甘油二酯含量的增加會(huì)激活蛋白激酶C，而蛋白激酶C可抑制胰島素受體酪氨酸激酶的自身磷酸化，從而加劇胰島素抵抗[20]，而胰島素抵抗是NAFLD的致病因素之一[21]。另外，甘油二酯含量的提高會(huì)導(dǎo)致肝臟脂肪變性，增加活性氧的產(chǎn)生，加劇氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)NAFLD的發(fā)生發(fā)展[20]。

HF組中鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、鞘糖脂的離子強(qiáng)度也顯著低于NC組，而PSE-H組中這些差異代謝物的離子強(qiáng)度顯著高于HF組，提示較高劑量PSE干預(yù)可以有效糾正NAFLD病理狀態(tài)所引起的鞘脂類(lèi)代謝異常。

鞘磷脂由鞘氨醇、磷酸膽堿和脂酸構(gòu)成，在鞘磷脂酶的作用下可以生成神經(jīng)酰胺[22]，是體內(nèi)含量第二的磷脂。文獻(xiàn)[23]表明血清中的鞘磷脂（d18∶1/24∶0）含量可以間接反映肝損傷程度，與炎癥等級(jí)呈負(fù)相關(guān)。神經(jīng)酰胺是鞘脂類(lèi)的一種重要化合物，作為第二信使存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)之間，是與胰島素抵抗、氧化應(yīng)激以及炎癥等相關(guān)的重要細(xì)胞信號(hào)因子[24]，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化等過(guò)程。神經(jīng)酰胺可通過(guò)抑制由炎癥因子比如炎癥因子所導(dǎo)致的超氧化物含量升高，進(jìn)一步對(duì)炎癥反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)[25]。鞘糖脂是由神經(jīng)酰胺經(jīng)過(guò)葡糖基轉(zhuǎn)移酶的糖基化作用合成[26]，是所有動(dòng)物細(xì)胞中的重要生物小分子，通過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷水解酶等調(diào)控機(jī)制維持生物體內(nèi)的鞘脂類(lèi)動(dòng)態(tài)平衡[27]，參與信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化以及凋亡等生命活動(dòng)[28]。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)HF組中溶血卵磷脂和磷脂酰膽堿的離子強(qiáng)度顯著高于NC組，與Barr[11]的研究結(jié)果相同；而PSE干預(yù)可降低溶血卵磷脂和磷脂酰膽堿的含量，使其趨于正常。磷脂酰膽堿含量增加時(shí)可被分解，代謝后可生成甘油三酯，導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)堆積和變性[29]；磷脂酰膽堿合成異常加劇還會(huì)引起血液中低密度脂蛋白的分泌增多，造成脂代謝異常[30]。

由圖7可看出，溶血卵磷脂、磷脂酰膽堿以及磷脂酰乙醇胺參與了甘油磷脂代謝通路，圖8顯示磷脂酰膽堿（O-18∶0/0∶0）參與了醚脂質(zhì)代謝通路。甘油磷脂是細(xì)胞膜的重要組成成分，甘油磷脂代謝通路紊亂會(huì)導(dǎo)致炎癥、內(nèi)皮功能障礙、細(xì)胞膜破壞等情況的發(fā)生[31]。溶血卵磷脂是血液中的重要信號(hào)傳導(dǎo)分子，參與細(xì)胞遷移、增殖、血管的生成以及炎癥效應(yīng)等[32]。溶血卵磷脂與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合后可發(fā)揮誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的趨化、刺激巨噬細(xì)胞活化等作用，從而促進(jìn)炎癥的發(fā)生[33]；并可在組織間轉(zhuǎn)運(yùn)甘油磷脂組分，如脂肪酸、磷脂酰甘油和膽堿。以上研究結(jié)果提示PSE可通過(guò)糾正甘油磷脂和醚脂質(zhì)代謝通路，減輕NAFLD大鼠肝臟脂質(zhì)積累引發(fā)的炎癥反應(yīng)。

磷脂酸由磷脂酶D催化水解卵磷脂生成[34]。磷脂酸可通過(guò)磷脂酸磷酸水解酶轉(zhuǎn)化為甘油二酯，進(jìn)一步參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)和脂質(zhì)代謝[35]。在NAFLD病理狀態(tài)下細(xì)胞膜的通透性會(huì)增加[36]，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，可能會(huì)導(dǎo)致磷脂酶D進(jìn)入血液的量增多且活性增強(qiáng)[37]，最終引起磷脂酸含量升高。本研究結(jié)果顯示，HF組的磷脂酸離子強(qiáng)度較NC組顯著上升，而高劑量PSE干預(yù)則可顯著降低磷脂酸的離子強(qiáng)度，進(jìn)一步證明PSE能夠有效緩解肝臟脂質(zhì)積累引發(fā)的炎癥反應(yīng)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)檢測(cè)PSE干預(yù)后NAFLD大鼠血清中小分子代謝物的變化，篩選出27 種差異代謝物，包括甘油二酯、神經(jīng)酰胺、鞘糖脂、溶血卵磷脂、磷脂酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、鞘磷脂以及脂肪酸，涉及的代謝通路為甘油磷脂代謝和醚脂質(zhì)代謝通路。研究結(jié)果表明，PSE干預(yù)可降低血清中甘油二酯、溶血卵磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇、二十一烷二酸的離子強(qiáng)度，升高鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、鞘糖脂的離子強(qiáng)度，說(shuō)明PSE可以通過(guò)對(duì)甘油磷脂以及醚脂質(zhì)代謝通路進(jìn)行調(diào)節(jié)以糾正脂類(lèi)代謝紊亂，減輕高脂飲食造成的脂質(zhì)積累，影響NAFLD的發(fā)生發(fā)展。