馬海洋 趙秋芳 陳曙 石偉琦 冼皚敏

摘 ?要：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase， PEPC）在C₄和景天酸代謝（CAM）光合途徑吸收CO₂過程中發(fā)揮重要作用，并參與各種非光合作用過程，包括果實(shí)成熟、氣孔開放、碳氮相互作用、種子形成和萌發(fā)以及調(diào)節(jié)植物對(duì)逆境脅迫的耐受性。菠蘿為典型的景天酸代謝途徑（CAM）植物，為了解磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）在菠蘿景天酸代謝途徑（CAM）中的作用，本研究鑒定到3個(gè)菠蘿PEPC基因，按照基因描述命名為AcPEPC1、AcPEPC3和AcPEPC4，進(jìn)化樹分析結(jié)果AcPEPC1和AcPEPC3為植物型PEPC（PTPCs）蛋白，序列同源性較高且基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域及保守基序均一致。AcPEPC4為細(xì)菌型PEPC（BTPCs）蛋白，與AcPEPC1/AcPEPC3間的序列同源性低。組織表達(dá)分析表明AcPEPC1菠蘿葉片表達(dá)量較高，而AcPEPC3和AcPEPC4在菠蘿花和果實(shí)表達(dá)量較高。

關(guān)鍵詞：菠蘿;磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）;基因進(jìn)化;基因表達(dá)譜中圖分類號(hào)：S668.3????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Bioinformatics Analysis of PEPC?Gene Family in Pineapple

MA Haiyang^1，2， ZHAO Qiufang^{1，2，3*}， CHEN Shu^1，3， SHI Weiqi^1，2， XIAN Aimin^1，2

1.?South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Zhanjiang， Guangdong 524091， China; 2. Hainan Key Laboratory of Tropical Crops Nutrition， Zhanjiang， Guangdong 524091， China; 3. Key Laboratory of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract： Phosphoenolpyruvate carboxylase （PEPC） plays an important role in assimilating atmospheric CO₂during C₄and Crassulacean acid metabolism （CAM） photosynthesis， and participates in various nonphotosynthetic processes， including fruit ripening， stomatal opening， supporting carbon-nitrogen interactions， seed formation and germination， and regulation of plant tolerance to stresses. Pineapple is a typical CAM plant. In order to understand the function ofPEPC gene in pineapple CAM photosynthesis pathway， threePEPCgenes were identified in pineapple and nominated asAcPEPC1/AcPEPC3/AcPEPC4according to the gene description. Phylogenetic analysis showed that AcPEPC1 and AcPEPC3 protein belonged to the plant type PEPC （PTPCs） subfamily， which had high sequence homology. Gene structure， conserved domain and conserved motif of AcPEPC1 and AcPEPC3 had high similarity. AcPEPC4 belonged to the bacterial type of PEPC （BTPCs） subfamily which had low sequence homology with AcPEPC1/AcPEPC3. Different tissues expression assay showed that the expression ofAcPEPC1 was high in leaves， andAcPEPC3 and?AcPEPC4 was highly expressed in flowers and fruits.

Keywords： pineapple （Ananas comosus （L.）?Merr）; phosphoenolpyruvate carboxylase （PEPC）; gene evolution; gene expression profiling

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.01.014

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoe nol py ruvate carboxylase，?PEPC）是一種細(xì)胞質(zhì)酶，其主要功能是在Mg²⁺或Mn²⁺的輔助下，催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和HCO₃^-生成草酰乙酸（OAA）和無機(jī)磷酸鹽（Pi）的不可逆反應(yīng)^[1]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶廣泛分布于古菌、細(xì)菌、藍(lán)藻、綠藻、原生動(dòng)物和植物中，在動(dòng)物和真菌中不存在^[2]。PEPC參與的催化反應(yīng)是C₄代謝和景天酸代謝植物光合作用中CO₂同化和固定的主要步驟^[1]，同時(shí)PEPC還參與種子形成和萌發(fā)^[2-3]、果實(shí)成熟^[2]、氣孔開放^[4]，調(diào)節(jié)植物對(duì)逆境脅迫的耐受性^[5-6]，為豆科植物根瘤共生氮固定提供碳骨架^[7]等非光合生理過程。目前，PEPC基因已在多種植物中被鑒定和研究，擬南芥和水稻中分別報(bào)道4個(gè)和6個(gè)PEPC家族成員^[8-9]，在大豆中共鑒定到10個(gè)（GmPEPC1～10）PEPC基因，其中GmPEPC6、GmPEPC8和GmPEPC9被鋁毒、寒害、鹽害等非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)^[10]?；ㄉ蚪M報(bào)道5個(gè)PEPC基因（AhPEPC1～5）^[11]，涂嘉琦等^[12]從蔓花生基因組中鑒定到9個(gè)PEPC基因。

菠蘿是一種極具營養(yǎng)和藥用價(jià)值的熱帶水果。2016年菠蘿的全球生產(chǎn)總值高達(dá)到14.9億美元（www.freshplaza.com），目前菠蘿已成為世界第三大熱帶水果，第二大國際貿(mào)易的熱帶水果。2015年菠蘿基因組測序和組裝工作已經(jīng)完成^[13]，為菠蘿重要基因家族鑒定和分析提供了數(shù)據(jù)支持，菠蘿WRKY^[14]、NRT^[15]、ABC^[16]、DOF^[17]等許多重要基因家族先后被報(bào)道。菠蘿作為典型的CAM代謝植物，PEPC基因家族尚未被挖掘，其家族成員在菠蘿光合過程中的作用尚不清楚，本文從菠蘿基因組中鑒定出3個(gè)PEPC基因，并對(duì)其結(jié)構(gòu)、序列特征及進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析菠蘿PEPC基因組織表達(dá)差異，為后期研究PEPC基因參與菠蘿CAM光合代謝過程中物質(zhì)積累和代謝調(diào)控作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1??材料與方法

1.1材料

菠蘿（Ananas comosus L.）基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來自（http：//pineapple.angiosperms.org），擬南芥數(shù)據(jù)來自（https：//www.arabidopsis.org/），水稻數(shù)據(jù)來自（http：//rice.plantbiology.msu.edu/），玉米數(shù)據(jù)來自（https：//www.maizegdb.org/）。

1.2方法

1.2.1??菠蘿AcPEPC家族基因鑒定??菠蘿AcPEPC家族基因鑒定參考涂嘉琦等^[12]的方法，從菠蘿基因組數(shù)據(jù)庫（http：//pineapple.angios pe rms.org）中檢索菠蘿的AcPEPC基因，同時(shí)獲得其基因序列、轉(zhuǎn)錄本序列、CDS和氨基酸序列及染色體位置信息，并利用?Pfam 對(duì)AcPEPC候選基因進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，凡包含PEPcase（PF00311）結(jié)構(gòu)域蛋白為?PEPC蛋白家族成員。利用GSDS2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）工具繪制AcPEPC基因結(jié)構(gòu)圖，分析其外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。

1.2.2??菠蘿AcPEPC蛋白理化性質(zhì)分析??運(yùn)用?Expasy（http：//web.expasy.org/protparam/）在線工具分析AcPEPC蛋白成員的分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)、總平均疏水性、脂溶系數(shù);運(yùn)用Plant-mPloc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-?multi/）預(yù)測AcPEPC蛋白的亞細(xì)胞定位，利用SOPMA（https：?//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）工具預(yù)測AcPEPC蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.3??菠蘿AcPEPC蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析??利用?MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）在線工具分析AcPEPC蛋白保守基序，基序長度范圍為10～50個(gè)氨基酸殘基，基序最大發(fā)現(xiàn)數(shù)目為10個(gè)，其他參數(shù)為默認(rèn)值。利用SMART（http：//?smart.embl-heidelberg.de/）和Pfam（http：//pfam.?xfam.org）在線工具分析AcPEPC蛋白的PEPcase保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.4??菠蘿AcPEPC蛋白進(jìn)化樹分析??利用Clustalx（1.83）對(duì)擬南芥和菠蘿AcPEPC蛋白序列進(jìn)行同源序列比對(duì)，并利用?MEGA6軟件構(gòu)建擬南芥、水稻、玉米、菠蘿AcPEPC蛋白家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用相鄰連接法（Neighbor-Joining，NJ），校驗(yàn)參數(shù)?BootStrap 重復(fù)為?1000次，其他參數(shù)均為默認(rèn)值。

1.2.5??菠蘿AcPEPC基因的組織表達(dá)譜分析??在菠蘿基因組網(wǎng)站（http：//pineapple.angiosperms.?org/pineapple/html/index.html）獲取菠蘿AcPEPC基因的組織表達(dá)量（fragments per kilobase of exon per million fragments mapped， FPKM）數(shù)據(jù)，包括菠蘿根、白天和晚上葉片不同部位（S1-S6）、花、5個(gè)果實(shí)發(fā)育的階段，以及葉片葉端（S5）和葉基部（S1）24 h表達(dá)量數(shù)據(jù)，采用TBtools工具繪制熱圖。

2??結(jié)果與分析

2.1菠蘿AcPEPC家族基因成員鑒定

通過對(duì)菠蘿基因組的檢索和鑒定，共鑒定出3個(gè)PEPC基因（表1），按照基因描述命名為AcPEPC1（Aco010025.1），AcPEPC3（Aco018- 093.1），AcPEPC4（Aco016429.1）。其中AcPEPC1和AcPEPC4位于10號(hào)染色體，AcPEPC3位于11號(hào)染色體，基因方向均為正向?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示3個(gè)AcPEPC序列長度，編碼序列長度存在差異，其序列長度在6246～9924 bp之間，編碼序列長度在2895～3054 bp之間。AcPEPC1，AcPEPC3均包含9內(nèi)含子和10個(gè)外顯子，而AcPEPC4包含18個(gè)內(nèi)含子和19個(gè)外顯子（圖1）。

2.2菠蘿AcPEPC蛋白分析

AcPEPC1/3/4的氨基酸數(shù)目分別為964、966和1017 aa，分子量分別為109.87、110.29、114.71?kDa。等電點(diǎn)PI均小于7，均為帶負(fù)電荷蛋白;不穩(wěn)定指數(shù)均大于4，預(yù)測為不穩(wěn)定蛋白;脂溶指數(shù)在90.05～92.09之間;對(duì)蛋白進(jìn)行親/疏水性預(yù)測，3個(gè)AcPEPC 的?GEAVY 值均為負(fù)值，均為親水性蛋白（表2）。對(duì)菠蘿AcPEPC二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果表明3個(gè)AcPEPC蛋白均以α-螺旋為主，占58.8%～62.14%，其次為無規(guī)則卷曲，占27.9%～31.76%，而擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角所占比例較?。ū?）。亞細(xì)胞定位預(yù)測3個(gè)PEPC成員均定位于細(xì)胞質(zhì)。

2.3菠蘿AcPEPC蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

3個(gè)菠蘿PEPC蛋白均存在PEPcase保守結(jié)構(gòu)域（圖2），而AcPEPC1、AcPEPC3和AcPEPC4之間存在差異，AcPEPC1、AcPEPC3存在位置和大小均相似的1個(gè)PEPcase保守結(jié)構(gòu)域，位置分別在162～966 aa和162～964 aa。AcPEPC4存在2個(gè)PEPcase保守結(jié)構(gòu)域，分別位于140～329 aa和378～1017 aa。保守基序分析（圖3）發(fā)現(xiàn)AcPEPC1、AcPEPC3存在10個(gè)保守基序，且位置和序列均較為相似;而AcPEPC4缺少基序10。

2.4菠蘿AcPEPC蛋白序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析

對(duì)擬南芥、水稻、玉米和菠蘿共計(jì)19個(gè)PEPC蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹分析（圖4）。3個(gè)AcPEPC被分為2類，其中AcPEPC1和AcPEPC3與ZmPEPC5的親緣關(guān)系最近，為植物型PEPC（PTPC）蛋白，而AcPEPC4與ZmPEPC3，AtPPC4和水稻Osppc-b聚為一類，為細(xì)菌型PEPC（BTPC）蛋白。氨基酸序列一致性結(jié)果顯示（表4），AcPEPC1和AcPEPC3的氨基酸序列相似性很高，達(dá)85.2%，且與擬南芥中PTPCs亞家族成員（AtPPC1、AtPPC2、AtPPC3）間的序列一致性均在82%以上，說明PTPCs亞家族的同源性很高，可能為同一基因進(jìn)化而來的，而BTPCs亞家族成員AcPEPC4與PTPCs（AcPEPC1和AcPEPC3）的相似性分別為43.5%和43.0%，同源性較差，AcPEPC4與AtPPC4均為BTPCs亞家族成員，氨基酸一致性為74.8%。

2.5菠蘿AcPEPC基因組織表達(dá)分析

為進(jìn)一步分析AcPEPC基因在不同組織中的表達(dá)情況，本研究分析了不同組織在不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包括根、葉（葉片從葉基部至葉尖分為6個(gè)取樣部位，依次為S1～S6，并分別在中午和晚上進(jìn)行取樣）、花和果實(shí)發(fā)育的5個(gè)階段共19個(gè)樣品數(shù)據(jù)，分析結(jié)果表明：AcPEPC1在葉片不同部位的表達(dá)量存在差異，分別在中午S4～S6，夜晚S5～S6表達(dá)量最高，在根中相對(duì)較低，其次為花，果實(shí)發(fā)育5個(gè)不同階段AcPEPC1的表達(dá)量變化不大。AcPEPC3在根和果實(shí)發(fā)育前期（S1～S3）表達(dá)量相對(duì)較高，且在葉片S1～S3中的表達(dá)量高于葉片S4～S6。而AcPEPC4在花和果實(shí)發(fā)育各階段表達(dá)量較高，在葉片和根中表達(dá)量低（圖5）。這些表達(dá)量的差異說明其在菠蘿光合作用中可能發(fā)揮不同功能。

如圖例所示，熱圖中的不同顏色指示基因轉(zhuǎn)錄組水平，圖中NO-S1至S6表示成熟葉片中午時(shí)從葉基部至葉尖的6個(gè)不同采樣部位，NI-S1至S6表示成熟葉片晚上時(shí)從葉基部至葉尖6個(gè)不同采樣部位，R表示根，F(xiàn)l表示花，F(xiàn)r-S1至S5表示果實(shí)發(fā)育的5個(gè)時(shí)期。

Different colors in heatmap refer gene transcript level as shown in the figure legend. NO-S1 to S6 represent 6 different parts?from leaf base to leaf tip?in the mature leaves at noon， NI-S1 to S6 represent 6 different parts from leaf base to leaf tip in?the mature leaves at night， R represents root， Fl represents flower. Fr-S1 to S5 represent five stages of fruit development.

PEPC酶主要參與菠蘿CAM光合過程，其在葉片光合部位和非光合部位，以及相同部位不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)可能存在差異。分析結(jié)果表明：AcPEPC1主要在綠色葉端部位表達(dá)，表達(dá)量明顯高于白色葉基部位，AcPEPC3在白色葉基部位的表達(dá)量高于綠色部位，而AcPEPC4在葉片綠色和白色部位的表達(dá)量均較低，在白色基部的表達(dá)量略高于綠色部位。3個(gè)AcPEPC基因在不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異不明顯（圖6）。

如圖例所示，熱圖中的不同顏色指示基因轉(zhuǎn)錄組水平，圖中Gr-6am至Gr-4am表示AcPEPC基因在葉端部位自早上6點(diǎn)到凌晨4點(diǎn)的表達(dá)情況，Wh-6am至Wh-4am表示AcPEPC基因在葉基部位自早上6點(diǎn)到凌晨4點(diǎn)的表達(dá)情況。

Different colors in heatmap refer gene transcript level as shown in the figure legend. Gr-6am to Gr-4am representAcPEPCgene 24 h expression profiles at leaf tip （Gr） from 6 am to 4 am， Wh-6am to Wh-4am representAcPEPCgene 24 h expression profiles at leaf base （Wh） from 6 am to 4 am.

3??討論

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）在C₄和CAM植物的光合作用過程中CO₂的吸收發(fā)揮重要作用，并參與多種非光合作用過程。菠蘿作為典型的CAM植物，其PEPC基因的研究尚未見報(bào)道。本研究從菠蘿基因組中鑒定到3個(gè)PEPC家族成員。前期研究表明植物中存在2種類型的PEPC家族基因，包括植物型PEPC（PTPC）和細(xì)菌型PEPC（BTPC），擬南芥編碼的4個(gè)PEPC基因中3個(gè)屬于PTPCs，1個(gè)屬于BTPCs^[8]，在水稻中5個(gè)PEPC（Osppc1，2a，2b，3and4）為PTPCs，Osppc-b為BTPCs^[9]。大豆中7個(gè)PEPC基因（GmPEPC3，4，6，7，8，9，1）屬于PTPCs，3個(gè)PEPC基因（GmPEPC1，2，5）屬于BTPCs^[10]?；ㄉ?個(gè)PEPC基因（AhPEPC1～4）屬于PTPCs，1個(gè)基因（AhPEPC5）屬于BTPCs^[11]。本研究中AcPEPC1和AcPEPC3屬于亞家族PTPCs，且與ZmPEPC5的進(jìn)化關(guān)系最為相近，AcPEPC4與AtPEPC4，Osppc-b和ZmPEPC3聚在一起，屬于亞家族BTPCs。研究表明PTPCs亞家族通常編碼約為110 kDa大小的蛋白，且在N端具有保守的磷酸化作用位點(diǎn)，基因結(jié)構(gòu)由10個(gè)左右的外顯子組成，而BTPCs亞家族編碼分子量約為117 kDa的氨基酸，且缺乏N端的磷酸化位點(diǎn)，基因結(jié)構(gòu)由20個(gè)左右的外顯子組成^{[2， 8]}。對(duì)菠蘿的研究有相似的結(jié)果，菠蘿PTPCs（AcPEPC1，AcPEPC3）亞家族編碼約為110 kDa的蛋白，包含10個(gè)高度同源的外顯子，BTPCs（AcPEPC4）編碼114.71?kDa的蛋白，包含19個(gè)外顯子（圖1，表2）。所有的PTPCs都是由共同的祖先基因進(jìn)化而來的，具有高度的保守性^[18]，而BTPCs與PTPCs的序列同源性較低（<40%）^[19-20]，本研究中AcPEPC1和AcPEPC3的同源性高達(dá)85.2%，且與擬南芥中PTPCs成員的同源性均在82%以上，與BTPCs成員的同源性均在40%左右。保守基序分析發(fā)現(xiàn)AcPEPC1和AcPEPC3具有10個(gè)保守基序，且位置序列相對(duì)一致，而AcPEPC4缺少保守基序10。

前期報(bào)道PEPC基因廣泛存在于植物的組織中，且表達(dá)具有組織特異性。例如Atppc4在花、根和果實(shí)表達(dá)^[8]，蔓花生AdPEPC家族多數(shù)成員在花和莖中表達(dá)量較高^[12]，花生中AhPEPC1在根、葉和種子表達(dá)量高，而在莖中表達(dá)量低，AhPEPC2在葉片表達(dá)量高，其他組織表達(dá)量低，AhPEPC3在根中表達(dá)量高，其次為種子，AhPEPC4 葉片中表達(dá)量高，其次為種子，而AhPE PC5在根和葉片中的表達(dá)量高于其他組織^[21]，GmPEPC5在莖和葉中的表達(dá)水平較高，而在花和根中的表達(dá)水平低^[10]。本研究中，AcPEPC不同成員在不同組織部位中的表達(dá)量不同，其中AcPEPC1在葉片中的表達(dá)量較高，在根和花中的表達(dá)較低，且AcPEPC1在葉片葉端（S4～S6）的表達(dá)量顯著高于葉片葉基（S1～S3），AcPEPC3與AcPEPC1相反，AcPEPC3在根和果實(shí)中的表達(dá)量較高，在葉片中的表達(dá)較低，在S1～S3的表達(dá)量高于S4～S6。而AcPEPC4在花和果實(shí)發(fā)育的表達(dá)量高于葉片和根（圖5）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)AcPEPC1在葉端（S1）24 h的表達(dá)量均高于葉基部（S5），AcPEPC3同樣呈現(xiàn)相反的趨勢（圖6）。AcPEPC4在葉端（S1）和葉基部（S5）24 h的表達(dá)量均較低這與AcPEPC4在葉片中的表達(dá)量較低結(jié)果相一致（圖5）。菠蘿不同PEPC成員表達(dá)差異其在光合過程中發(fā)揮的作用不同，AcPEPC1在葉端表達(dá)量較高，說明AcPEPC1可能是參與景天酸代謝過程中CO₂吸收的關(guān)鍵基因，而AcPEPC3和AcPEPC4可能主要參與菠蘿花和果實(shí)的發(fā)育，本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究PEPC基因在菠蘿中的功能提供依據(jù)。

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