紫杉醇誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡中miR-224的表達(dá)

龍春頻 歐陽(yáng)堅(jiān)

【摘 要】 目的：分析紫杉醇誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡中miR-224的表達(dá)。方法：選取我科學(xué)院肝癌細(xì)胞，即HepG2，對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)以及藥物處理，然后采用Annexin V-FITC/PI雙染法流式檢測(cè)對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，最終測(cè)定miR-224的表達(dá)。結(jié)果：通過(guò)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)紫杉醇濃度為2、1、1.5mg/L時(shí)，24h可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與空白對(duì)照組相比較差異明顯（P<0.05），48h更劇烈誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞的比率表現(xiàn)更高;在miR-224的表達(dá)方面，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定，紫杉醇濃度為2mg/L時(shí)，處理24h HepG2miR-224的表達(dá)倍數(shù)明顯升高，但是當(dāng)紫杉醇濃度為1mg/L或者1.5mg/L時(shí)，處理24h HepG2miR-224的表達(dá)倍數(shù)明顯下降。而當(dāng)紫杉醇濃度為1、1.5、2mg/L時(shí)，處理48 h HepG2miR-224的表達(dá)倍數(shù)均明顯升高。結(jié)論：紫杉醇誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡時(shí)，miR-224表達(dá)上調(diào)，上調(diào)的miR-224可作用于其靶基因，進(jìn)而對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡途徑造成影響。

【關(guān)鍵詞】 紫杉醇;誘導(dǎo);肝癌HepG2;細(xì)胞凋亡;miR-224;表達(dá)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R285. 5

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】B

【文章編號(hào)】1005-0019（2020）02-239-01

肝癌在臨床上比較常見(jiàn)，尤其是原發(fā)性肝癌，有數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)原發(fā)性肝癌的發(fā)病率占全球發(fā)病率的55%左右，而死亡率占全球死亡率的45%[1]。紫杉醇是臨床上應(yīng)用比較廣泛的一種高效廣譜癌癥化療藥物，其能夠作用于微管蛋白β亞基N端第31位氨基酸， 在促進(jìn)微管聚合并穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)的同時(shí)，還阻止了其向亞單位的解聚，進(jìn)而對(duì)微管聚合以及解聚的動(dòng)態(tài)平衡造成了極大的影響，進(jìn)而引發(fā)了癌癥細(xì)胞的凋亡或者死亡，另外，其還能夠?qū)?xì)胞膜超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行改變，最后發(fā)揮出其抗腫瘤的作用。微小RNA則能夠?qū)捂溞》肿覴NA進(jìn)行調(diào)控。本次研究就對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡中miR-224的表達(dá)進(jìn)行了詳細(xì)的分析。具體如下：

1 資料與方法

1.1 對(duì)肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)和藥物處理

選取我科學(xué)院肝癌細(xì)胞，即HepG2，取含有10%小牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行接種，再將其放置在濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱中，將培養(yǎng)箱的溫度調(diào)整為37℃，培養(yǎng)24h后，再將培養(yǎng)基換成濃度為2、1、1.5mg/L的紫杉醇，繼續(xù)培養(yǎng)24h和48h。

1.2 凋亡細(xì)胞的檢測(cè)

采用Annexin V-FITC/PI雙染法流式檢測(cè)法對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，取Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。先取不含EDTA的胰蛋白酶對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行消化，將血液離心儀的轉(zhuǎn)速調(diào)整為2000r/min，離心5min后，對(duì)鐵壁細(xì)胞1～5×105進(jìn)行收集，然后用PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌，洗滌2次后在其中加入500μL的Binding buffer，再在其中依次加入5μL的Annexin V-FITC、5μL的Propidium Iodide后混勻，放在避光的環(huán)境下讓其反應(yīng)5～15min。再用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，將細(xì)胞儀的激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)分別調(diào)整為488nm和530nm，通過(guò)FITC通道對(duì)Annexin V-FITC綠色熒光進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)PI通道對(duì)PI紅色熒光進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 miR-224表達(dá)的測(cè)定

定量PCR引物的設(shè)計(jì)與合成均通過(guò)Primer BLAST進(jìn)行，對(duì)肝癌細(xì)胞中總RNA進(jìn)行提取時(shí)，嚴(yán)格按照試劑盒中的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。采用TRIpure Reagent總RNA對(duì)RNA進(jìn)行抽取和分離，將提取到的RNA用濃度為1.2%的瓊脂糖進(jìn)行電泳，并用K5500超微量分光光度儀對(duì)其濃度和純度進(jìn)行測(cè)定。將miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增和檢測(cè)。

1.4 觀察指標(biāo)

觀察肝癌HepG2細(xì)胞凋亡情況以及細(xì)胞中miR-224的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，分別用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差和%表示計(jì)量資料和計(jì)數(shù)資料，用t和χ2檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05表示差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義為標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 肝癌細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)紫杉醇濃度為2、1、1.5mg/L時(shí)，24h可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與空白對(duì)照組相比較差異明顯（P<0.05），48h更劇烈誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞的比率表現(xiàn)更高。詳見(jiàn)表1：

2.2 miR-224的表達(dá)

在miR-224的表達(dá)方面，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定，紫杉醇濃度為2mg/L時(shí)，處理24h HepG2miR-224的表達(dá)倍數(shù)明顯升高，但是當(dāng)紫杉醇濃度為1mg/L或者1.5mg/L時(shí)，處理24h HepG2miR-224的表達(dá)倍數(shù)明顯下降。而當(dāng)紫杉醇濃度為1、1.5、2mg/L時(shí)，處理48 h HepG2miR-224的表達(dá)倍數(shù)均明顯升高。

3 討論

有研究人員經(jīng)過(guò)大量的研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs基因與肝癌的發(fā)生、治療以及患

作者簡(jiǎn)介 ：龍春頻 ，男 ，漢族， 1970年 12月生， 江西萍鄉(xiāng)， 本科學(xué)歷 ， 高級(jí)講師，主要從事中藥與腫瘤的研究。

通訊作者： 歐陽(yáng)堅(jiān)，萍鄉(xiāng)衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院腫瘤研究實(shí)驗(yàn)室，郵箱： jouyang168@163.com。

者預(yù)后評(píng)估等密切相關(guān)。其經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)在一些與腫瘤相關(guān)的易變基因環(huán)境中，但是又有一大部分存在于與癌癥相關(guān)基因區(qū)域，或者一些比較脆弱性的位點(diǎn)上。如果某類(lèi)miRNA的靶基因是抑制癌癥的基因，當(dāng)此類(lèi)miRNA出現(xiàn)明顯的增加，靶基因表達(dá)減少時(shí)，就提示有可能出現(xiàn)了腫瘤。但是如果靶基因是致癌基因，當(dāng)相應(yīng)的miRNA表達(dá)減少，或者作用于靶點(diǎn)的突變導(dǎo)致癌基因表達(dá)異常增高時(shí)，則極有可能會(huì)導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，此時(shí)，除了抑制癌癥的基因外，另外一部分則被認(rèn)定為是致癌基因。有研究人員經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，miR-224是肝癌癌變相關(guān)的miRNA，這也進(jìn)一步提示miRNA在體外和體內(nèi)肝細(xì)胞中的表達(dá)是一致的，尤其可能在維持肝癌細(xì)胞惡性表型的過(guò)程中起著極其關(guān)鍵的作用[2]。

有研究人員認(rèn)為，miR-224對(duì)細(xì)胞增殖的作用，遷移、侵襲以及肝癌細(xì)胞抗凋亡等均與靶基因密切相關(guān)，因此，可發(fā)現(xiàn)，在癌癥的發(fā)生發(fā)展中都涉及到了該DNA[2]。也有文獻(xiàn)報(bào)道顯示，在被檢肝癌組織中，均發(fā)現(xiàn)了肝癌組織中的miR-224其定量檢測(cè)結(jié)果顯示，該miRNA的表達(dá)也出現(xiàn)了明顯的增加。因此，也可認(rèn)為肝癌組織中存在著明顯的miRNA表達(dá)水平的變化，而此種定時(shí)熒光定量RT-PCR法也為早期、準(zhǔn)確的檢測(cè)肝組織是否發(fā)生了癌變提供了新的思路[3]。

本次研究結(jié)果顯示，當(dāng)紫杉醇濃度為2、1、1.5mg/L時(shí)，24h可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，48h更劇烈誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞的比率表現(xiàn)更高。而在miR-224的表達(dá)方面，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定，當(dāng)紫杉醇濃度為1mg/L或者1.5mg/L時(shí)，處理24h HepG2miR-224的表達(dá)倍數(shù)明顯下降，而當(dāng)紫杉醇濃度為2mg/L時(shí)，處理24h HepG2miR-224的表達(dá)倍數(shù)明顯升高。但是當(dāng)紫杉醇濃度為1、1.5、2mg/L時(shí)，處理48 h HepG2miR-224的表達(dá)倍數(shù)均明顯升高。這可能是因?yàn)閯傞_(kāi)始使用低濃度的紫杉醇，會(huì)有一個(gè)適應(yīng)期，細(xì)胞凋亡下過(guò)并不明顯，但是將紫杉醇濃度增高時(shí)，HepG2miR-224的表達(dá)會(huì)升高，進(jìn)而引發(fā)了細(xì)胞凋亡[4]。

綜上所述，紫杉醇誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡時(shí)，miR-224表達(dá)上調(diào)，上調(diào)的miR-224可作用于其靶基因，進(jìn)而對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡途徑造成影響。

參考文獻(xiàn)

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[4] 單長(zhǎng)民，李京敏，李娟，等.試驗(yàn)用和臨床用紫杉醇誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的比較[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（06）：1711-1713+1738.