翁歆之

(臺州市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，浙江 臺州 318000)

牙鲆(Paralichthys olivaceus)屬鰈形目、鰈亞目、鲆科、牙鲆亞科、牙鲆屬。分布于中國、日本和韓國等東北亞沿岸，是重要的經(jīng)濟魚類，也是重要的海水養(yǎng)殖對象。其肉質(zhì)細嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，還具有一定的藥用價值，深受人們的喜愛。近年來，牙鲆的自然資源衰退嚴重，進行大規(guī)模的人工養(yǎng)殖勢在必行。耐低氧性狀是高密度集約化養(yǎng)殖中最重要的經(jīng)濟性狀之一，有研究表明，耐低氧能力與魚類的生長發(fā)育、攝食繁殖、代謝行為、免疫能力等有著密切的聯(lián)系。因此，篩選和培育出耐低氧的牙鲆優(yōu)良品種是高密度、高效益養(yǎng)殖模式的迫切需要。

數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus，QTL)的檢測和定位是成功進行分子標記輔助選育(MAS)的重要前期工作。早期的QTL定位多見于植物、水稻、禽獸類等，水產(chǎn)經(jīng)濟動物的QTL研究相對滯后。而關(guān)于牙鲆的QTL定位，特別是抗病、耐高溫等相關(guān)性狀的研究更是少之又少。如Fuji等篩選到了牙鲆抗淋巴囊腫病的性狀相關(guān)的主效位點，并培育出具有抗淋巴囊腫病的后代，成功應用到商業(yè)化生產(chǎn)；盧鐘磊等利用微衛(wèi)星標記確定了兩個與牙鲆耐熱相關(guān)的位點；Ozaki等得到了牙鲆與海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)相關(guān)的QTLs；Wang等定位得到4個與牙鲆抗鰻弧菌病性狀相關(guān)的QTL區(qū)間。但是，關(guān)于牙鲆耐低氧相關(guān)的QTL定位尚未見報道。

本研究以167尾牙鲆F2KP-CBB家系作為實驗材料，采用140個微衛(wèi)星分子標記，首次對牙鲆耐低氧性狀作QTL定位，以期為牙鲆分子標記輔助選擇育種提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

一、材料與方法

1.實驗材料 以神奈川水產(chǎn)技術(shù)中心培育的牙鲆(長谷川研究員提供)為實驗材料。由親本KPC家系(耐低氧)與親本KP-B家系(不耐低氧)交配，獲得F1KP-CB，再由F1KP-CB與親本KP-B(不耐低氧)交配，獲得F2KP-CBB。

2.耐低氧實驗 將F2KP-CBB 167尾牙鲆個體放入內(nèi)有800升海水的1000升圓形缸里(保持水溫25℃，溶氧11毫克/升)培育。實驗前1天將167尾個體(平均體長16.8厘米，平均個體重51.9克)轉(zhuǎn)移到1000升的圓形缸中，并放入親本KP-C、親本KPB、F1KP-CB各10尾作為對照樣本，禁食24小時。開始實驗時，整個實驗水溫保持25℃，止水，停止供給氧氣。在F2KP-CBB大概死亡一半的時候停止實驗(此時溶氧為0.9毫克/升)，按照死亡順序編號，并立刻剪下死亡個體的尾鰭，保存在99%酒精中。存活的牙鲆抽取血液，打入體內(nèi)標記后返回缸中。整個實驗過程中對每個死亡個體都記錄下死亡時間，氧氣濃度每15分鐘記錄1次。

3.基因組DNA制備 用酚-氯仿抽提法進行基因組DNA提取，并用紫外分光光度計測量DNA濃度，將濃度稀釋至50納克/微升。

4.PCR擴增及聚丙烯酰胺凝膠電泳 利用PCR擴增方法對本實驗群體進行基因型檢測。PCR反應體系包括0.055皮摩爾特異性熒光引物(5’標記FAM熒光)0.005微升，下游引物0.05微升，10×Buffer(Mg2＋)1.1微升、2.5毫摩爾dNTPs 0.88微升、1%BSA 0.11微升、ExTaq DNA聚合酶0.055微升以及50納克的DNA模板1微升。PCR反應程序為：95℃預變性3分鐘；95℃變性30秒，62℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，共30個循環(huán)；72℃延伸5分鐘。PCR產(chǎn)物中加入等體積的loading dye(95%formaide，10毫摩爾EDTA，pH 8.0)，95℃變性5分鐘后迅速放到冰上。后經(jīng)6%變性聚丙烯酰胺凝膠上點樣5微升，電泳1.5～2小時；在掃描儀(FLA-9000，F(xiàn)UJIFILM)上，使用Bio-image Analyzer軟件成像。

5.QTL定位及表型數(shù)據(jù)處理 參考Casta?o-Sánchez等構(gòu)建的牙鲆高密度遺傳連鎖圖譜，選擇覆蓋牙鲆所有連鎖群的微衛(wèi)星標記，共140個，平均間距10～15厘摩爾。

基因分型分兩步開展：先從F2KP-CBB中取出88尾個體(44尾死亡個體、44尾存活個體)，死亡個體取最開始死亡的44尾，對篩選的微衛(wèi)星標記進行第一次檢測。然后，第一次檢測中表現(xiàn)出差異性的微衛(wèi)星標記并加上其附近的微衛(wèi)星標記對167尾個體進行第二次擴大檢測，統(tǒng)計基因分型。

采用應用軟件Map Manager QTXb20進行QTL定位，設(shè)定LOD值為3。根據(jù)實驗中牙鲆死亡時間，采用兩種不同模式進行分析，在模式一中，將死亡的44尾牙鲆定義為“0”，存活下來的44尾定義為“1”；模式二中，實驗所用167尾牙鲆按照死亡時間進行分析。

二、結(jié)果與分析

1.耐低氧實驗 耐低氧實驗進行了約9個小時，實驗結(jié)束時溶氧為0.9毫克/升。F2KP-CBB 167尾個體中75尾死亡(44.9%)、92尾存活(55.1%)，表明存活的個體比死亡的個體具有一定的耐低氧性。對照組中，KP-B全部死亡，KP-C的死亡率為30%，F(xiàn)1KP-CB死亡率為60%。

2.QTL定位 利用140對微衛(wèi)星標記對F2KPCBB 88尾個體進行解析，其中90個(64.4%)標記統(tǒng)計得到基因分型結(jié)果。結(jié)果顯示(表1)，雌性遺傳圖譜上共檢測到6個標記與耐低氧性狀存在顯著的相關(guān)性(P＜0.05)，分別分布于連鎖群LG4、LG7、LG10和LG17上，4個標記與耐低氧性狀存在極顯著的相關(guān)性(P＜0.01)，都分布于連鎖群LG24上。其中LG24上的Poli1482TUF的LOD值最大，為2.08，可解釋的表型變異為10%。雄性遺傳圖譜上，共檢測到4個與標記耐低氧性狀存在顯著的相關(guān)性(P＜0.05)，分布于LG10、LG24上。

表1 F2KP-CBB 88尾個體耐低氧性狀相關(guān)QTL定位及其基因效應

利用上述有差異性表現(xiàn)的微衛(wèi)星標記對于167尾個體進行擴大檢測，結(jié)果顯示(表2)，雌性遺傳圖譜上，共得到2個顯著性相關(guān)標記(P＜0.05)和7個極顯著性相關(guān)標記(P＜0.01)，分別分布于5個連鎖群(LG4、LG7、LG10、LG17和LG24)上。同樣LG24上Poli1482TUF的LOD值最大，為4.11，可解釋的表型變異為11%。

表2 F2KP-CBB 167尾個體耐低氧性狀相關(guān)QTL定位及其基因效應

三、討論

1.耐低氧實驗 在進行耐低氧實驗中，為了保證耐低氧實驗的準確性，因此在大約死亡一半并且溶氧達到0.9毫克/升時停止了實驗。

2.QTL 定 位 Casta?o-Sánchez 等 使 用 了1268個SSR標記、105個SNP標記和2個基因，構(gòu)建了牙鲆第二代高密度遺傳連鎖圖譜，此圖譜由24個連鎖群組成，雄性和雌性圖譜總長度分別為1147.7厘摩爾和833.8厘摩爾。本研究基于該圖譜進行分析，可以較為準確地定位耐低氧相關(guān)性狀QTL區(qū)域。

本研究中，第二次擴大檢測得到的QTLs都定位于牙鲆的雌性遺傳基因圖譜上，這與Fuji等成功將褐牙鲆抗淋巴囊腫病的性狀相關(guān)QTL定位在雌性遺傳圖譜上的結(jié)論相一致。由于牙鲆的雌性遺傳圖譜的重組率高于雄性遺傳圖譜，因此定位于雌性遺傳圖譜的QTLs更適用于今后的分子標記輔助選擇育種。同時，本研究得到的極顯著標記Poli1482TUF(LG24)的LOD值為4.11，可解釋的表型變異為11%。有研究表明，可解釋的表型變異超過10%，即可有效地進行分子標記輔助選擇育種。

此外，本研究還嘗試在Poli1482TUF和Poli1024TUF附近設(shè)立了5對引物，試圖找到更大的LOD值，但尚未成功。今后將進一步對此區(qū)間進行分析，并將篩選到的Poli1482TUF放到更多的群體中進行進一步驗證。

四、結(jié)論

耐低氧性狀或抗病性狀，不像體長、體色、生長速度等可以從外觀直接進行選育，而分子標記輔助選擇育種可以精準、快速地選育出相關(guān)性狀的優(yōu)良品種。本研究首次對牙鲆耐低氧相關(guān)性狀進行QTL定位，為今后牙鲆耐低氧性狀的分子標記輔助選擇育種奠定了基礎(chǔ)。