孫銘艷 吳倩倩 陶元勇

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院感染的重要病原菌，可引起身體各部位感染[1]。臨床醫(yī)生曾將碳青霉烯類藥物作為治療耐藥肺炎克雷伯菌感染的最后一道防線，但由于抗菌藥物的不規(guī)范使用，碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant klebsiella pneumoniae，CR-KP)不斷增多[2]。2008年，印度攜帶新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1(New Delhi metallo-βlactamase-1，NDM-1)耐藥基因的“超級(jí)細(xì)菌”的報(bào)道引發(fā)全球廣泛關(guān)注[3]。我國(guó)耐藥形勢(shì)同樣不容樂(lè)觀，2017年中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類藥物亞胺培南和美羅培南的耐藥率均已超20%[4]。耐藥菌的出現(xiàn)增加了患者負(fù)擔(dān)，給臨床治療帶來(lái)極大困難。

CR-KP的耐藥機(jī)制包括產(chǎn)碳青霉烯酶、高產(chǎn)AmpCβ-內(nèi)酰胺酶(AmpC酶)、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)合并膜孔蛋白缺失及外排泵的過(guò)度表達(dá)，產(chǎn)碳青霉烯酶是其最主要的耐藥機(jī)制[5]。碳青霉烯酶包括A類酶、B類酶和D類酶，不同種類的碳青霉烯治療方案不同，準(zhǔn)確和快速地檢測(cè)碳青霉烯酶并加以正確的臨床治療可減緩細(xì)菌耐藥的產(chǎn)生。為此，系統(tǒng)綜述碳青霉烯酶實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，為碳青霉烯酶的檢測(cè)提供依據(jù)。

1 碳青霉烯酶表型檢測(cè)方法

實(shí)驗(yàn)室常規(guī)工作中，可通過(guò)紙片擴(kuò)散法(K-B法)或稀釋法(MIC法)檢測(cè)細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類藥物的敏感性初步篩查碳青霉烯酶[6]。但該方法容易造成漏檢，需借助其他檢測(cè)方法進(jìn)行確認(rèn)。表型檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、易于觀察，包括培養(yǎng)基篩查、改良霍奇試驗(yàn)(modified Hodge test，MHT)、Carba NP試驗(yàn)、碳青霉烯滅活試驗(yàn)(carbapenem inactivation method，CIM)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)。

1.1 培養(yǎng)基篩查

顯色培養(yǎng)基利用細(xì)菌產(chǎn)生的碳青霉烯酶使培養(yǎng)基的顯色劑發(fā)生顏色變化來(lái)進(jìn)行判斷。ChromID ESBLs培養(yǎng)基最早用于ESBLs的檢測(cè)，隨后用于檢測(cè)碳青霉烯酶，可有效檢測(cè)碳青霉烯酶的A類酶和B類酶，對(duì)D類酶的篩查作用較小[7]。科馬嘉KPC顯色培養(yǎng)基能快速篩查出產(chǎn)碳青霉烯酶菌株，但無(wú)法通過(guò)顯色反應(yīng)區(qū)分碳青霉烯酶的A類酶和B類酶。Hornsey等[8]在進(jìn)行顯色培養(yǎng)基比對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)菌落數(shù)＞106CFU/ml時(shí)，該培養(yǎng)基也能有效篩查產(chǎn)D類酶的肺炎克雷伯菌。SUPERCARBA培養(yǎng)基是2012年Nordmann等[9]研發(fā)的一種非顯色培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基對(duì)常見(jiàn)碳青霉烯酶的檢測(cè)能力明顯改善，能檢測(cè)A類、B類和D類碳青霉烯酶。

除SUPERCARBA培養(yǎng)基外，其他培養(yǎng)基不能有效檢測(cè)D類碳青霉烯酶。此外篩查的陽(yáng)性菌株還需通過(guò)分子技術(shù)進(jìn)行確認(rèn)，增加了時(shí)間與經(jīng)濟(jì)成本，使用上受到一定限制[10]。

1.2 改良霍奇試驗(yàn)(MHT)

MHT可用于檢測(cè)A類、B類和D類碳青霉烯酶[11]。操作簡(jiǎn)單，結(jié)果易于觀察，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室即可開(kāi)展，見(jiàn)圖1。

圖1 改良霍奇試驗(yàn)(MHT)

圖1顯示，受試菌產(chǎn)生碳青霉烯酶，使擴(kuò)散到培養(yǎng)基中的厄他培南失活。因此C處無(wú)足夠量厄他培南抑制大腸埃希菌ATCC25922生長(zhǎng)，出現(xiàn)抑菌圈凹進(jìn)現(xiàn)象。但MHT在檢測(cè)產(chǎn)ESBLs或AmpC酶合并膜孔蛋白缺失的菌株時(shí)易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，檢測(cè)產(chǎn)NDM型金屬酶時(shí)可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。2018年，美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)已將MHT從抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(CLSI M100)中刪除。

1.3 Carba NP試驗(yàn)

Carba NP試驗(yàn)方法于2012年由Patrice Nordmann研究團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道[12]。2015年CLSI新增Carba NP試驗(yàn)用于檢測(cè)碳青霉烯酶。該方法利用酚紅作為指示劑，采用比色法，檢測(cè)常見(jiàn)碳青霉烯酶耐藥表型的特異性及靈敏度均大于90%[13]。Carba NP陽(yáng)性菌株無(wú)需修改碳青霉烯類藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，主要用于院感監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查。目前沒(méi)有推薦此試驗(yàn)作為常規(guī)試驗(yàn)。其不足之處在于：①需要特殊試劑；②某些檢測(cè)結(jié)果無(wú)效；③無(wú)法區(qū)分碳青霉烯酶型別等。

1.4 碳青霉烯滅活試驗(yàn)(CIM)

CIM于2015年由荷蘭van der Zwaluw研究團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道，可在較短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)碳青霉烯酶，且對(duì)常見(jiàn)碳青霉烯酶的耐藥表型與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)結(jié)果具有高度一致性，特異度為95.5%，靈敏度為95.7%[14]。2017年CLSI引入改良CIM(modified carbapenem inactivation method，mCIM)用于檢測(cè)腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶的表型確認(rèn)，其與CIM的不同之處在于菌懸液所用的實(shí)驗(yàn)室用水由胰蛋白酶大豆肉湯取代，加入美羅培南藥敏紙片后，孵育時(shí)間也從2 h延長(zhǎng)至4 h。操作方法見(jiàn)圖2。

圖2 改良碳青霉烯(mCIM)的滅活方法及操作方法

mCIM減少了ESBL或AmpC所致的假陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)非產(chǎn)碳青霉烯酶的耐碳青霉烯類抗菌藥物腸桿菌科細(xì)菌識(shí)別能力更強(qiáng)，對(duì)D類酶敏感性較高。但不足之處在于其不能區(qū)分碳青霉烯酶的耐藥型別。為彌補(bǔ)這一不足，2018年CLSI引入EDTA改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)(EDTA-carbapenem inactivation method，eCIM)，通過(guò)加入乙二胺四乙酸(EDTA)抑制金屬酶活性，與mCIM試驗(yàn)聯(lián)合，用以判斷產(chǎn)酶情況及區(qū)分金屬酶和絲氨酸酶[16]。CIM試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、成本低且結(jié)果易于判斷，對(duì)A類酶、B類酶和D類酶的敏感性高。但試驗(yàn)孵育耗時(shí)長(zhǎng)，不能實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)的目的，因此尚未在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開(kāi)展[17]。

1.5 MALDI-TOF MS檢測(cè)

MALDI-TOF MS是一種新型軟電離生物質(zhì)譜，其原理是離子在電場(chǎng)作用下加速通過(guò)飛行通道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同，即測(cè)定離子的質(zhì)荷比(m/z)與離子的飛行時(shí)間成正比來(lái)對(duì)離子進(jìn)行檢測(cè)，具有檢測(cè)速度快、靈敏度高和易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。MALDI-TOF MS的快速檢測(cè)對(duì)于急性病例和特殊病原體的及時(shí)、準(zhǔn)確鑒定及細(xì)菌耐藥檢測(cè)方面的應(yīng)用具有較好發(fā)展前景[18]。目前，MALDI-TOF MS已被用于產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的檢測(cè)，具體方法為：將含有碳青霉烯類藥物的緩沖液與過(guò)夜培養(yǎng)的檢測(cè)菌共同孵育4 h后，離心取上清進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)對(duì)比碳青霉烯類藥物與其降解產(chǎn)物質(zhì)譜峰值的變化來(lái)判斷有無(wú)碳青霉烯酶產(chǎn)生，但無(wú)法區(qū)分碳青霉烯酶型別。MALDI-TOF MS對(duì)細(xì)菌耐藥的檢測(cè)有助于臨床抗感染治療，缺點(diǎn)為儀器昂貴，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室難開(kāi)展[19]。

2 分子技術(shù)

已有的表型檢測(cè)方法不能完全區(qū)分碳青霉烯酶型別，且檢測(cè)結(jié)果需用分子技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。傳統(tǒng)PCR通量低、耗時(shí)長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)操作繁瑣及產(chǎn)物易污染等缺點(diǎn)制約了其在實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。近年來(lái)，開(kāi)發(fā)一系列新型分子技術(shù)用以檢測(cè)碳青霉烯酶，包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR、多重PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法、基因芯片和二代測(cè)序(next-generation sequencing，NGS)。

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR將熒光染料或熒光探針加入到PCR反應(yīng)體系中，通過(guò)將實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)與校準(zhǔn)品進(jìn)行比較，得出相應(yīng)檢測(cè)結(jié)果。Higuchi等于1993年最早提出該方法，美國(guó)Perkin Elmer公司于1995年成功研發(fā)該新技術(shù)[20]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR克服傳統(tǒng)PCR的諸多不足，且檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)PCR具有較高一致性。此外，該方法的檢測(cè)下限較低，可直接用于臨床標(biāo)本的產(chǎn)碳青霉烯酶菌株耐藥基因的定性及定量檢測(cè)[21]。

2.2 多重PCR

多重PCR是將多對(duì)特異性引物同時(shí)加入到一個(gè)反應(yīng)體系中，循環(huán)條件滿足所有引物，目的基因擴(kuò)增后存在易分辨和識(shí)別的差異，可實(shí)現(xiàn)在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目的基因。Monteiro等[22]首次報(bào)道使用實(shí)時(shí)多重PCR的方法，通過(guò)一個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)進(jìn)行熔化曲線分析，在3 h內(nèi)快速并準(zhǔn)確的完成碳青霉烯酶耐藥基因，即NDM、KPC、GES、IMP、VIM和OXA-48的分析，方法的另敏度與特異度均為100%。其還可用于臨床標(biāo)本耐藥基因的直接篩查。多重PCR具有高通量、高效率的優(yōu)勢(shì)，但需配備專業(yè)的技術(shù)人員與設(shè)備。

2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法是由Notomi等[23]研發(fā)的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)。針對(duì)目的基因的6個(gè)特異性序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物，在鏈置換DNA聚合酶的作用下，1 h可將目的基因擴(kuò)增109～1010倍，整個(gè)反應(yīng)在等溫條件60～65 ℃下進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)了特異和高效擴(kuò)增，并可通過(guò)肉眼觀察反應(yīng)副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀判斷結(jié)果。與多重PCR不同的是，該方法可改變其條件及引物檢測(cè)新的基因，在某些反應(yīng)中對(duì)新基因及靶位的檢測(cè)敏感性高，還可用于檢測(cè)臨床標(biāo)本的碳青霉烯酶耐藥基因[24-25]。

2.4 基因芯片

基因芯片是一種通過(guò)與已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測(cè)定的分子技術(shù)。此技術(shù)易于商品化，在微生物鑒定及耐藥檢測(cè)領(lǐng)域得到良好應(yīng)用。Braun等[26]用基因芯片對(duì)117株包括腸桿菌科細(xì)菌在內(nèi)的臨床分離菌進(jìn)行菌株鑒定及碳青霉烯酶等耐藥基因的檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度為98.2%，特異度為97.4%。

2.5 二代測(cè)序(NGS)

NGS是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要變革，目前已被廣泛用于疾病篩查及診斷、微生物鑒定、耐藥基因檢測(cè)及藥物研發(fā)等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[27-28]。其原理是在每一個(gè)測(cè)序周期中，利用計(jì)算機(jī)檢測(cè)DNA聚合酶催化熒光標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸結(jié)合到DNA模板時(shí)產(chǎn)生的熒光信號(hào)來(lái)確定DNA序列，實(shí)現(xiàn)了邊合成邊測(cè)序。在碳青霉烯酶耐藥基因檢測(cè)方面，既可對(duì)常規(guī)培養(yǎng)菌株進(jìn)行檢測(cè)，也可直接對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，有效縮短檢測(cè)時(shí)間[29]。此外，NGS不僅能檢測(cè)已知的碳青霉烯酶耐藥基因，還能明確由非產(chǎn)酶原因即膜孔蛋白的缺失和外排泵的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致的碳青霉烯類藥物耐藥[30]。

3 展望

抗菌藥物的不合理使用使細(xì)菌的耐藥形勢(shì)尤其是碳青霉烯類藥物的耐藥形勢(shì)日趨嚴(yán)峻。針對(duì)耐藥菌，在有效的新型抗菌藥物上市前及時(shí)并準(zhǔn)確地檢測(cè)，對(duì)感染的有效治療及耐藥菌的傳播尤為重要。

在肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶表型檢測(cè)方法中，各項(xiàng)試驗(yàn)原理一致，均利用碳青霉烯酶水解碳青霉烯類藥物的活性進(jìn)行設(shè)計(jì)，其特異性高，但對(duì)于低表達(dá)或水解活性低的碳青霉烯酶檢測(cè)的敏感性差。目前，CLSI推薦Carba NP試驗(yàn)和CIM試驗(yàn)用于碳青霉烯酶表型檢測(cè)。利用分子技術(shù)檢測(cè)碳青霉烯酶均為耐藥基因的直接檢測(cè)，不僅能檢測(cè)碳青霉烯酶，還能進(jìn)行酶的分型。而NGS在此基礎(chǔ)上所獲信息更全面，還能檢測(cè)未知的耐藥基因。隨著技術(shù)發(fā)展及成本的下降，NGS將有廣闊的發(fā)展前景。