唐遠(yuǎn)江 楊粵黔 周思璇 張濤 盧昱希 黃炳香

摘要：為優(yōu)化杠板歸中槲皮素的最佳提取工藝，檢驗(yàn)提取物體外抑菌活性，以槲皮素提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Plackett-BurnmanDesign（PBD）設(shè)計(jì)聯(lián)合Box-BehnkenDesign（BBD）對(duì)槲皮素的提取工藝進(jìn)行考察，并采用微量肉湯二倍稀釋法和瓊脂平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法研究提取物和槲皮素對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌和殺菌作用。結(jié)果可知，最佳提取工藝為加25倍59.92%乙醇浸泡24h，60℃下回流提取時(shí)間3.4h，提取2次。提取物對(duì)3株細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC）介于3.12～6.31g/L，最小殺菌濃度（MBC）介于12.52～25.41g/L，槲皮素對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌MIC分別為7.11、3.16g/L，MBC分別為100.18、50.56g/L，其殺菌效果不如提取物，對(duì)沙門氏菌的MIC和MBC均為3.27g/L，殺菌效果優(yōu)于提取物。優(yōu)化后的提取工藝穩(wěn)定合理，且提取物具有良好抑菌活性。

關(guān)鍵詞：杠板歸;槲皮素;PBD;BBD;MIC;MBC

中圖分類號(hào)：R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）22-0207-06

作者簡(jiǎn)介：唐遠(yuǎn)江（1987—），男，貴州遵義人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事中獸藥研發(fā)。E-mail：tangyjjay0909@126.com。

通信作者：楊粵黔，副研究員，主要從事中獸藥研發(fā)。E-mail：252184152@qq.com。

杠板歸為蓼科蓼屬植物杠板歸（PolygonumperfoliatumL.）的全草，民間習(xí)稱蛇倒退、貓爪刺、杠板歸等[1]，其主要成分有黃酮類、有機(jī)酸類、萜類等[2-6]。《中國(guó)獸藥典》2015版第二部中規(guī)定，槲皮素為杠板歸的主要成分[7]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，杠板歸具有抗菌、抗病毒、降血壓、抗腫瘤等作用[8-10]，臨床上杠板歸常用于治療慢性濕疹、乳腺炎、百日咳、瀉痢、黃疸、跌打腫痛等疾病。杠板歸的煎煮劑對(duì)金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌、炭疽桿菌等均有較強(qiáng)抑制作用，乙酸乙酯、正丁醇提取物對(duì)大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用，75%乙醇提取物對(duì)多種細(xì)菌具有廣譜抗菌性[11-12]。槲皮素具有廣譜抗菌性，并且對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌作用強(qiáng)于革蘭氏陽(yáng)性菌[13]。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌是引起畜禽細(xì)菌性疾病的常見(jiàn)致病菌[14-17]。因致病性細(xì)菌血清型眾多，難以制備出具有針對(duì)性的疫苗[18]?？股厥侵委煷祟惣膊∮行У氖侄?，但長(zhǎng)期使用抗生素導(dǎo)致致病菌的耐藥性嚴(yán)重，研究表明，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌對(duì)多種抗生素具有耐藥作用[19]?？股貧埩艨蓪?dǎo)致致病菌的耐藥性增強(qiáng)并轉(zhuǎn)移給人類，引起動(dòng)物內(nèi)源性感染和二重感染，使動(dòng)物免疫力降低，抗原質(zhì)量降低，降低疫苗的使用效果。尋找抗生素替代物和新途徑，消除或減輕禁用抗生素帶來(lái)的一系列影響，是我國(guó)畜牧業(yè)急需解決的問(wèn)題[20]。

相比抗生素，中獸藥具有無(wú)殘留、不易產(chǎn)生耐藥性、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，在畜牧養(yǎng)殖中的作用日趨重要[21]。2020年，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料，使得中獸藥的發(fā)展迎來(lái)重大契機(jī)。前期研究發(fā)現(xiàn)，杠板歸汁液對(duì)大腸桿菌具有良好的抑菌活性，但未對(duì)其提取液進(jìn)行研究。雖然杠板歸在臨床上的應(yīng)用研究較多，但其有效成分的提取優(yōu)化以及在獸醫(yī)上的開(kāi)發(fā)應(yīng)用較少。因此，為拓展中藥杠板歸的運(yùn)用，筆者運(yùn)用Plackett-BurnmanDesign（PBD）和Box-BehnkenDesign法（BBD）設(shè)計(jì)，優(yōu)化建立杠板歸中槲皮素的提取工藝，并檢驗(yàn)提取物的抗菌活性，以期為該中藥的開(kāi)發(fā)和利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

供試菌株，大腸桿菌ATCC25922標(biāo)準(zhǔn)株、沙門氏菌ATCC13076標(biāo)準(zhǔn)株、金黃色葡萄球菌ATCC6538標(biāo)準(zhǔn)株，均由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所獸用中草藥研究室保存;杠板歸分析樣品，由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所獸用中草藥研究室提供，經(jīng)貴州省畜牧獸醫(yī)研究所尚楊粵黔鑒定為PolygonumperfoliatumL.。槲皮素對(duì)照品，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110957—201808;水解酪蛋白肉湯（MHbroth）和水解酪蛋白瓊脂（MHagar），購(gòu)自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。其他試劑為色譜純或分析純。

1.2主要設(shè)備與儀器

LC-20型島津高效液相色譜儀（日本島津公司）、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（成都美普達(dá)儀器有限公司）、BSA224S型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、潔拓超聲波清洗儀（深圳市潔拓超聲清洗設(shè)備有限公司）、DHG-9240A電熱恒溫干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）、RE-5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1槲皮素的定量檢測(cè)方法[7]

（1）色譜條件，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm，流速：1.0mL/min，柱溫：30℃，進(jìn)樣量10μL。

（2）對(duì)照品溶液的制備，取槲皮素對(duì)照品適量，精確稱定，加甲醇制成每1mL含30μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

（3）供試品溶液的制備，取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.7g，精確稱定，置于具塞錐形瓶中，精確加入甲醇-鹽酸（4∶1）混合溶液50mL，稱定質(zhì)量，置90℃水浴中加熱回流1h，放冷，再稱定質(zhì)量，采用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻、濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

（4）線性關(guān)系考察，精確稱取槲皮素對(duì)照品16.05mg置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，分別吸取對(duì)照品溶液1.6、3.2、7.8、12.5、17.2mL于50mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，所得對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為10.00、20.50、50.00、80.02、110.40μg/mL，分別取各質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液10μL進(jìn)樣，記錄色譜圖峰面積。以峰面積值（y）對(duì)對(duì)照品質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

（5）精密度試驗(yàn)，精確吸取槲皮素對(duì)照品溶液（20.50μg/mL）10μL，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

（6）穩(wěn)定性試驗(yàn)，取供試品溶液，于制備后0、1、2、4、8、12h分別進(jìn)樣10μL，計(jì)算峰面積的RSD。

（7）重現(xiàn)性試驗(yàn)，取杠板歸藥材6份，制備樣品供試品溶液，取供試品溶液進(jìn)樣10μL檢測(cè)，計(jì)算槲皮素含量。

（8）加樣回收試驗(yàn)，取已知含量（0.32mg/g）的樣品0.5g，共6份，精確稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加入槲皮素對(duì)照品溶液（20.50μg/mL）5mL，制備樣品供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定，以供試品溶液中對(duì)照品絕對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算加樣回收率。

1.3.2PBD篩選主要因素

取10g杠板歸采用水浴回流提取，取濾液檢測(cè)槲皮素含量，運(yùn)用Minitab19進(jìn)行PBD試驗(yàn)?？疾旄鱾€(gè)因素對(duì)槲皮素提取量的影響，試驗(yàn)對(duì)A（浸泡時(shí)間）、B（乙醇體積分?jǐn)?shù)）、C（溶劑量）、D（溫度）、E（提取時(shí)間）、F（提取次數(shù)）等6個(gè)主要因素進(jìn)行評(píng)價(jià)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定每個(gè)因素高（代碼：1）、低（代碼：-1）2個(gè)水平共12組試驗(yàn)，篩選對(duì)槲皮素提取量的影響主要因子。PBD試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

1.3.3BBD試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

取10g杠板歸采用水浴回流進(jìn)行提取，根據(jù)PBD試驗(yàn)結(jié)果，以槲皮素含量（y）為目標(biāo)響應(yīng)值，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（x1）、溶劑量（x2）和提取時(shí)間（x3）設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，響應(yīng)因素水平見(jiàn)表2。

1.3.4中藥提取物制備

稱取杠板歸中草藥200g粉末，采用優(yōu)化后的工藝提取，合并提取液，過(guò)濾，烘干并粉碎，采用10%甲醇溶解并稀釋成不同濃度的溶液，相同方法配制槲皮素溶液，置于4℃冰箱中貯存，備用。

1.3.5菌液制備

將大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌接種于含MH液體培養(yǎng)基的試管中，置于37℃、200r/min條件下培養(yǎng)12h，并采用液體培養(yǎng)基將菌液的D600nm調(diào)整為0.8，再用培養(yǎng)基稀釋1000倍，相當(dāng)于菌液濃度為105～106CFU/mL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

采用微量肉湯二倍稀釋法，于無(wú)菌96孔板每一孔中均加入100μL肉湯，再分別向第一孔中加入100μL配備好的藥液，混勻后依次倍比稀釋，直到最后一孔混勻后棄去100μL混合液。每孔加入配備好的100μL細(xì)菌稀釋液，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組（加菌不加藥）和陰性對(duì)照組（不加菌不加藥）。在正式試驗(yàn)之前設(shè)置有機(jī)溶劑對(duì)照組，即對(duì)每株菌進(jìn)行有機(jī)溶劑的對(duì)照試驗(yàn)，將藥液換成甲醇，保證所有供試菌株存活的最大溶劑含量，以便制備藥液所用的溶劑含量遠(yuǎn)低于此值。將供試菌株37℃恒溫培養(yǎng)24h后取出，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。每組試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

采用TTC法對(duì)MIC結(jié)果進(jìn)行判定。向上述培養(yǎng)24h后的96孔板每孔分別加入20μL0.5%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC），37℃避光培養(yǎng)2h，觀察菌液的顏色變化。試驗(yàn)組眼觀溶液澄清、顏色未發(fā)生變化的最低藥物質(zhì)量濃度則作為該藥的MIC。

1.3.7最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定

將上述試驗(yàn)組澄清的各孔中液體取100μL涂布于相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)48h，以肉眼觀察無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低藥物質(zhì)量濃度為其MBC[19]。

2結(jié)果與分析

2.1槲皮素定量檢測(cè)試驗(yàn)的可靠性

線性關(guān)系試驗(yàn)得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=4×107x-35941，r2=0.9996，進(jìn)樣濃度在10.00～110.40μg/mL，表明進(jìn)樣濃度和峰面積線性關(guān)系良好。槲皮素對(duì)照樣品和檢測(cè)樣品的HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。精密度試驗(yàn)得出對(duì)照品平均峰面積為674579.33，RSD<2%，說(shuō)明儀器精密性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，槲皮素色譜峰面積RSD值為1.56%，樣品供試液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。重現(xiàn)性試驗(yàn)得出杠板歸樣品平均含量為0.31mg/g，RSD<2%，表明該樣品處理方法重現(xiàn)性好。加樣回收試驗(yàn)表明，槲皮素平均回收率為99.73%，RSD為0.98%，說(shuō)明本方法可靠、準(zhǔn)確度好，符合含量測(cè)定的要求。

2.2影響杠板歸提取工藝的主要因素

按照PBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到各處理組的槲皮素提取量（表3）。運(yùn)用Minitab19軟件對(duì)各個(gè)因素進(jìn)行顯著性分析，由表4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶劑量、提取時(shí)間對(duì)槲皮素提取量的影響顯著，浸泡時(shí)間、提取次數(shù)、溫度的影響不顯著。因此，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶劑量、提取時(shí)間進(jìn)行BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.3槲皮素提取工藝回歸模型的建立

根據(jù)BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到不同水平條件下槲皮素的提取量（表5）。運(yùn)用Designexpert10.3.2軟件，以槲皮素含量（y）為響應(yīng)值分別對(duì)各因素進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，得到y(tǒng)對(duì)x1、x2和x3的二次多項(xiàng)回歸方程：y=0.322-0.0025x1+0.0001x2+0.015x3+0.0075x1x2-0.0075x1x3+0.0125x2x3-0.0322x21-0.0022x22-0.0173x23。模型F值為3.18，P<0.05，響應(yīng)回歸模型顯著，失擬項(xiàng)P>0.05，失擬不顯著，由表6可知，根據(jù)模型擬合規(guī)律[22]，說(shuō)明該回歸模型擬合程度較好。

2.4槲皮素最佳提取工藝的建立

以x1、x2、x3中任意1個(gè)變量固定，其余2個(gè)變量對(duì)y值作響應(yīng)面圖（圖2）。根據(jù)曲面圖分析原理[23]，可以看出x1和x3對(duì)y值的交互作用不顯著，x1和x2，x2和x3對(duì)y值的交互作用明顯，根據(jù)回歸模型和曲面分析，得到槲皮素的最佳提取工藝為：加25倍59.92%體積分?jǐn)?shù)乙醇，60℃下回流提取時(shí)間3.4h，提取2次，預(yù)測(cè)值y=0.33mg/g。

[FK（W31][TPTYJ2.tif][

2.5最佳提取工藝的驗(yàn)證

取杠板歸適量，加25倍59.92%乙醇浸泡24h，60℃下回流提取3.4h，提取2次，按此工藝參數(shù)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到槲皮素平均提取量為0.34mg/g，由表7可知，槲皮素提取量與預(yù)測(cè)值相近，說(shuō)明建立的提取工藝具有良好的可信度。

2.6杠板歸提取物和槲皮素的抑菌活性

由表8可知，杠板歸提取物和槲皮素對(duì)3株細(xì)菌均有抑制作用。提取物對(duì)3株細(xì)菌的MIC分別為3.12、6.24、6.31g/L，MBC分別為12.52、24.08、25.41g/L，槲皮素對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為7.11、3.16g/L，MBC分別為100.18、50.56g/L，與杠板歸提取物的殺菌活性相比，槲皮素單體的殺菌效果不如提取物。槲皮素對(duì)沙門氏菌的MIC和MBC均為3.27g/L，說(shuō)明沙門氏菌對(duì)槲皮素敏感，槲皮素對(duì)沙門氏菌的殺菌效果明顯優(yōu)于杠板歸提取物。

3結(jié)論與討論

通過(guò)PBD和BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化杠板歸中槲皮素的提取工藝，并進(jìn)行抑菌活性檢驗(yàn)，得到最佳提取工藝為：加25倍59.92%乙醇浸泡24h，60℃下回流提取時(shí)間3.4h，提取2次。提取物和槲皮素單體對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均有良好的抑菌效果。

在中藥有效成分提取中需考慮到多個(gè)單因素試驗(yàn)以及試驗(yàn)次數(shù)較多的正交設(shè)計(jì)，工作費(fèi)時(shí)費(fèi)力且具有盲目性，因此本試驗(yàn)引用PBD設(shè)計(jì)。PBD是一種近飽和的2水平篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，通過(guò)比較各因子2水平的差異與整體的差異來(lái)確定因子的顯著性，能用最少的試驗(yàn)次數(shù)快速有效地篩選出顯著影響因子[24]。BBD具有結(jié)果直觀、預(yù)測(cè)性好的優(yōu)點(diǎn)，試驗(yàn)預(yù)測(cè)值能更好地考察參數(shù)合理性和試驗(yàn)設(shè)計(jì)的準(zhǔn)確性[25]。本研究通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，其驗(yàn)證結(jié)果大于預(yù)測(cè)值，說(shuō)明PBD聯(lián)合BBD設(shè)計(jì)在中藥提取中具有良好的可行性。

本試驗(yàn)在篩選提取因素時(shí)藥材浸泡24h后槲皮素提取率有所提高，溫度對(duì)槲皮素提取的影響不明顯，溫度越高越不利于安全生產(chǎn)，且造成資源浪費(fèi)，因此在響應(yīng)面設(shè)計(jì)中不考慮加熱溫度的影響。同時(shí)，在提取過(guò)程發(fā)現(xiàn)提取2次可使有效成分完全浸出，故每個(gè)平行試驗(yàn)均提取2次。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，本研究中供試藥材槲皮素的含量?jī)H為0.32mg/g，貴州地區(qū)杠板歸藥材槲皮素的含量0.017～0.495mg/g[26]，說(shuō)明供試藥材的有效成分含量合理。在槲皮素的提取報(bào)告中多采用甲醇-酸作為提取液，出于安全考慮，本試驗(yàn)只采用乙醇作為提取液，且結(jié)果與甲醇-酸相差不大。杠板歸槲皮素的提取優(yōu)化未有報(bào)道，沙芮以艾蒿為原料，得出槲皮素提取需加16倍甲醇[27]，與之相比，本研究只加25倍59.92%乙醇，更節(jié)約成本。

在抑菌活性研究中，槲皮素對(duì)沙門氏菌的MIC和MBC未超過(guò)3.30g/L，但高于滕楠報(bào)道的槲皮素對(duì)沙門氏菌的最低抑菌濃度2.17g/L[28]。槲皮素對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為7.11、3.16g/L，MBC分別為100.18、50.56g/L，與秦曉蓉等的報(bào)道[13]相符。杠板歸提取物對(duì)大腸桿菌的抑菌活性最好，MIC和MBC分別為3.12、12.52g/L，對(duì)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌MIC和MBC均未超過(guò)3.50、26.00g/L。黃學(xué)彬等研究得出，75%乙醇、乙酸乙酯和正丁醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌等具有良好的抑菌效果[12]，說(shuō)明杠板歸具有良好的藥用價(jià)值，值得進(jìn)一步研究。

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