• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      對(duì)羥基苯甲酸對(duì)尖孢鐮刀菌生物學(xué)特性及侵染毒力的影響

      2020-03-03 21:14:23趙靜常繼東鄭麗君王志遠(yuǎn)
      江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年22期
      關(guān)鍵詞:纖維素酶

      趙靜 常繼東 鄭麗君 王志遠(yuǎn)

      摘要:明確對(duì)羥基苯甲酸對(duì)尖孢鐮刀菌侵染毒力的影響,可為克服三七連作障礙提供有效的策略。結(jié)合熒光素二乙酸酯-碘化丙啶(FDA-PI)染色及馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板萌發(fā)法,分析不同濃度下對(duì)羥基苯甲酸與尖孢鐮刀菌孢子活性的相關(guān)性;采用酶學(xué)法分析不同濃度下對(duì)羥基苯甲酸對(duì)真菌纖維素酶分泌的影響。FDA-PI染色結(jié)果表明,當(dāng)對(duì)羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時(shí),尖孢鐮刀菌產(chǎn)孢數(shù)量最多,孢子活性最強(qiáng)。PDA平板萌發(fā)測定結(jié)果顯示,對(duì)羥基苯甲酸濃度為1mmol/L時(shí),尖孢鐮刀菌孢子的平均萌發(fā)率為58.05%,孢子萌發(fā)率最高。低濃度的對(duì)羥基苯甲酸脅迫下,尖孢鐮刀菌分泌的纖維素酶活性增加,而高濃度下降低;對(duì)羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時(shí),纖維素酶活性最高,峰值出現(xiàn)在培養(yǎng)4d時(shí),達(dá)到1.57U/mL,是相同時(shí)間下對(duì)照的5.6倍。研究表明,低濃度對(duì)羥基苯甲酸(1~5mmol/L)脅迫有利于尖孢鐮刀菌孢子生長,且提高其分泌的纖維素酶活性。

      關(guān)鍵詞:對(duì)羥基苯甲酸;尖孢鐮刀菌;孢子活性;纖維素酶

      中圖分類號(hào):S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

      文章編號(hào):1002-1302(2020)22-0291-04

      作者簡介:趙靜(1983—),女,云南玉溪人,博士,副教授,主要從事作物病蟲害與防治研究。E-mail:hujun_maolv@163.com。

      通信作者:王志遠(yuǎn),博士,副教授,主要從事作物病蟲害與防治研究。E-mail:yuan33441@sina.com。

      三七根腐病是三七生產(chǎn)中的一類重要病害,不僅影響三七產(chǎn)量,更影響三七質(zhì)量,其中以鐮刀菌型根腐病最為多見[1]。在三七栽培中,隨著連作年限的延長根腐病發(fā)病率明顯增加[2]。根腐病的發(fā)生與連作條件下植物根系分泌物對(duì)病原菌的化感作用有密切關(guān)系。研究三七根系分泌物對(duì)病菌的化感致病性是解析連作條件下根腐病形成機(jī)制的有效途徑。

      在植物的生長發(fā)育過程中,根系作為植物與土壤的接觸部分,不僅從土壤中吸收水分和養(yǎng)分,還通過分泌的方式向周圍釋放一些無機(jī)離子和有機(jī)化合物,這些物質(zhì)是一類復(fù)雜的混合物,是植物連作對(duì)根際土壤微生物產(chǎn)生影響的重要媒介之一,參與植物與周圍環(huán)境的物質(zhì)交換與信號(hào)傳遞,是根際最為重要的營養(yǎng)和能量來源,也是構(gòu)成植物不同根際微生態(tài)特征的關(guān)鍵因素[3-5]。對(duì)羥基苯甲酸為酚酸類化感物質(zhì),是自然界中常見的化合物,存在于高等植物、微生物、苔蘚和土壤中。酚酸類物質(zhì)是導(dǎo)致作物產(chǎn)生連作障礙的主要因素,它可以直接或間接地促進(jìn)或抑制微生物生長,進(jìn)而影響作物生長。Ren等研究了叢枝菌根定殖是否能緩解西瓜枯萎病,改變植物對(duì)病原菌的反應(yīng),結(jié)果表明,叢枝菌根的侵染抑制了西瓜根和根際病原菌的生長,使病害指數(shù)降低了89.3%,這是因?yàn)閰仓那秩靖淖兞烁捣置谖?,抑制了西瓜枯萎病菌孢子的萌發(fā)[6]。郝文雅等以不同抗性西瓜品種以及化感水稻品種為試驗(yàn)對(duì)象,對(duì)其根系分泌物中可溶性糖和游離氨基酸的含量和組成進(jìn)行分析,并研究了氨基酸對(duì)西瓜?;图怄哏牭毒L的影響,結(jié)果表明,西瓜的根系分泌物能夠促進(jìn)鐮刀菌孢子萌發(fā)和產(chǎn)孢,而水稻根系分泌物卻具有反向作用[7]。

      本研究擬探究對(duì)羥基苯甲酸脅迫下尖孢鐮刀菌的生物學(xué)特性及致病毒力,以探明對(duì)羥基苯甲酸對(duì)尖孢鐮刀菌的化感作用,以期為連作條件下根腐病的發(fā)生及病害防治提供理論依據(jù)。

      1材料與方法

      1.1試驗(yàn)菌株及試驗(yàn)時(shí)間

      尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。試驗(yàn)于2019年在玉溪師范學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

      1.2孢子活性的檢測

      1.2.1孢子懸浮液的制備

      將尖孢鐮刀菌菌株分別在含有1、5、10、50mmol/L對(duì)羥基苯甲酸的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基中于26℃下振蕩培養(yǎng)7d,以不添加對(duì)羥基苯甲酸的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照(CK)。將培養(yǎng)好的病原菌孢子混合液依次用200目(孔徑0.075mm)和300目(孔徑0.048mm)篩網(wǎng)過濾,去除菌絲和培養(yǎng)基雜質(zhì)。然后取30mL濾液于50mL離心管中,在5000r/min下離心5min,去上清液后以無菌水進(jìn)行重懸并離心,重復(fù)2~3次。用磷酸緩沖鹽溶液(PBS,pH值為7.4)將孢子重懸。

      1.2.2FDA-PI熒光染液的配制、染色及孢子死亡率的計(jì)算

      熒光素二乙酸酯-碘化丙啶(FDA-PI)熒光染液的配制及染色參照柴阿麗等的方法[8],尖孢鐮刀菌孢子懸浮液染色后于熒光顯微鏡下觀察,采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器根據(jù)孢子著色情況計(jì)算孢子死亡率。

      1.3孢子萌發(fā)率的計(jì)算

      制備對(duì)羥基苯甲酸濃度分別為1、5、10、50mmol/L的PDA培養(yǎng)基,以不添加對(duì)羥基苯甲酸的PCA培養(yǎng)基為對(duì)照(CK)。把滅過菌的微孔濾膜平鋪在制備好的PDA平板上,使微孔濾膜平鋪于培養(yǎng)基表面,把制備的孢子懸浮液平鋪在濾膜上,用三角玻璃棒將菌懸液涂布均勻(每個(gè)平板涂布70μL菌懸液),用封口膜封口后置于28℃下培養(yǎng),5~8h后制作玻片觀察并記錄孢子的萌發(fā)情況,每個(gè)處理重復(fù)3次,每個(gè)樣本檢查100個(gè)孢子,統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率。

      1.4酶活性的測定

      纖維素酶活性的測定采用羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)法。

      2結(jié)果與分析

      2.1FDA-PI熒光染色效果觀察和孢子死亡率的計(jì)算

      尖孢鐮刀菌新鮮孢子懸浮液利用FDA染液單染后,在熒光顯微鏡下,活孢子呈亮綠色熒光(圖1-a);經(jīng)加熱致死的孢子利用PI染液單染后,死孢子發(fā)出紅色熒光(圖1-b)。取1mL新鮮孢子懸浮液與1mL[JP+1]加熱致死的孢子懸浮液混合均勻,經(jīng)FDA-PI染液染色后,在熒光顯微鏡下可明顯觀察到發(fā)出紅色熒光的死孢子和發(fā)出綠色熒光的活孢子(圖1-c)。上述結(jié)果表明,采用FDA-PI染色方法能較好地對(duì)尖孢鐮刀菌孢子的死活進(jìn)行判斷,其中活孢子呈綠色熒光,死亡孢子呈紅色熒光。

      [JP3]由表1可知,在不同濃度(0、1、5、10、50mmol/L)對(duì)羥基苯甲酸脅迫下,尖孢鐮刀菌產(chǎn)孢數(shù)量有較大區(qū)別。其中,對(duì)羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時(shí)產(chǎn)孢數(shù)量最多,經(jīng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器檢測得出,孢子數(shù)量為180萬個(gè)/mL,其次為含1mmol/L對(duì)羥基苯甲酸的培養(yǎng)基,產(chǎn)孢數(shù)量為170萬個(gè)/mL。對(duì)羥基苯甲酸濃度為50mmol/L時(shí)不產(chǎn)孢子。經(jīng)FDA-PI雙染后死孢子在熒光顯微鏡下呈紅色,活孢子呈綠色。在0、1、5、10mmol/L對(duì)羥基苯甲酸脅迫下,尖孢鐮刀菌孢子死亡率分別為79%、75%、64%、70%,懸浮液中孢子死亡個(gè)數(shù)分別為94.8萬、127.5萬、115.2萬、56.0萬個(gè)/mL。當(dāng)對(duì)羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時(shí),尖孢鐮刀菌產(chǎn)孢數(shù)量最多,經(jīng)FDA-PI染色后,孢子存活率也最高。

      2.2對(duì)羥基苯甲酸脅迫下尖孢鐮刀菌孢子的萌發(fā)率

      采用PDA平板法觀察孢子的萌發(fā)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在對(duì)羥基苯甲酸濃度為1、5mmol/L的培養(yǎng)基中,孢子萌發(fā)最早,萌發(fā)時(shí)間為5.5h。其次為對(duì)照,萌發(fā)時(shí)間為6h。對(duì)羥基苯甲酸濃度為10mmol/L時(shí),萌發(fā)時(shí)間為11h,而羥基苯甲酸濃度為50mmol/L時(shí),尖孢鐮刀菌孢子無萌發(fā)。

      由圖2可知,不同濃度對(duì)羥基苯甲酸脅迫下,尖孢鐮刀菌孢子的萌發(fā)率不同,其中CK組的平均萌發(fā)率為42.45%;對(duì)羥基苯甲酸濃度為1mmol/L時(shí),孢子萌發(fā)率最高,平均萌發(fā)率為58.05%;對(duì)羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時(shí),孢子的萌發(fā)率低于濃度為1mmol/L時(shí),平均萌發(fā)率為50.8%,對(duì)孢子的萌發(fā)仍有促進(jìn)作用,但促進(jìn)作用減緩;對(duì)羥基苯甲酸濃度為10mmol/L時(shí),孢子萌發(fā)率低于空白對(duì)照組,平均萌發(fā)率為29.5%,對(duì)孢子的萌發(fā)開始有抑制作用;當(dāng)對(duì)羥基苯甲酸濃度50mmol/L時(shí),完全抑制孢子的萌發(fā),孢子平均萌發(fā)率為0。

      2.3對(duì)羥基苯甲酸脅迫下纖維素酶活性的變化

      植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和壁蛋白等組成。其中,纖維素是構(gòu)成細(xì)胞壁的骨架物質(zhì)[9]。植物細(xì)胞壁是植物健康的保障,病原菌可以通過入侵植物細(xì)胞壁,分泌細(xì)胞壁降解酶使植物受到侵染而感病[10]。因此,細(xì)胞壁降解酶是病原菌侵染寄主組織的主要致病因子之一[11]。由圖3可知,在低濃度的對(duì)羥基苯甲酸脅迫下,尖孢鐮刀菌分泌的纖維素酶活性增加,而高濃度下降低。對(duì)羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時(shí),纖維素酶活性最高,峰值出現(xiàn)在培養(yǎng)4d時(shí),達(dá)到1.57U/mL,是相同時(shí)間下對(duì)照的5.6倍。由此可以得知,低濃度對(duì)羥基苯甲酸有利于尖孢鐮刀菌入侵植物組織。

      3討論

      研究表明,酚酸類物質(zhì)是導(dǎo)致作物產(chǎn)生連作障礙的主要因素,它可以直接或間接地促進(jìn)或抑制微生物生長,進(jìn)而影響作物生長[12]。馬燕會(huì)等通過盆栽試驗(yàn)及高效液相色譜(HPLC)技術(shù)發(fā)現(xiàn),對(duì)羥基苯甲酸可增加根系分泌物中對(duì)鐮刀菌生長具有促進(jìn)作用的氨基酸種類和含量[13]。甄文超等研究發(fā)現(xiàn),對(duì)羥基苯甲酸可提高草莓根際鐮刀菌的數(shù)量,致使根際微生物組成由“細(xì)菌型”向“真菌型”轉(zhuǎn)變[14]。在前期研究中,筆者已明確從三七重茬土壤中提取到的29種化感物質(zhì)對(duì)尖孢鐮刀菌具有明顯的化感作用[15]。本研究中,對(duì)羥基苯甲酸在低濃度下可增加孢子產(chǎn)孢活性,促進(jìn)孢子的萌發(fā),最適宜的濃度為5mmol/L,該濃度下,尖孢鐮刀菌產(chǎn)孢數(shù)量最高,且通過FDA和PI雙熒光復(fù)染法檢測得出,孢子存活率最高,死亡率最低,另外在該濃度下尖孢鐮刀菌分泌的纖維素酶活性也最高。

      熒光素二乙酸酯(fluoresceindiacetate,F(xiàn)DA)可以自由通過細(xì)胞膜,被非特異性酯酶分解產(chǎn)生熒光素,并積蓄在活細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生熒光[16]。碘化丙啶(propidiumiodide,PI)不能透過完整的細(xì)胞膜,但能夠透過死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核被染紅[16]。本研究中,在對(duì)羥基苯甲酸脅迫下,利用FDA-PI染色及PDA平板萌發(fā)法檢測孢子活性,發(fā)現(xiàn)在相同濃度對(duì)羥基苯甲酸脅迫下,PDA平板萌發(fā)法測定的孢子活性更強(qiáng)。如當(dāng)對(duì)羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時(shí),PDA平板萌發(fā)法測得的孢子平均萌發(fā)率為50.8%;而通過FDA-PI染色法得出,活孢子比例為37%,遠(yuǎn)低于平板萌發(fā)法。這說明FDA-PI染色劑對(duì)孢子活性具有一定的抑制作用,但相較于PDA平板萌發(fā)法方便、快捷。

      參考文獻(xiàn):

      [1]MiaoCP,MiQL,QiaoXG,etal.RhizosphericfungiofPanaxnotoginseng:diversityandantagonismtohostphytopathogens[J].JournalGinsengResearch,2016,40(2):127-134

      [2]毛中順,龍?jiān)戮?,朱書生,?三七根腐病研究進(jìn)展[J].中藥材,2013,36(12):2051-2054.

      [3]BerendsenRL,PieterseCMJ,BakkerPAHM.Therhizospheremicrobiomeandplanthealth[J].TrendsinPlantScience,2012,17(8):478-486.

      [4]李吉.懷牛膝連作對(duì)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性的影響[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué),2013.

      [5]李春宏,殷劍美,王立,等.連作對(duì)芋頭根際土壤理化性狀和微生物特性的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2019,35(4):825-833.

      [6]RenLX,ZhangN,WuP,etal.ArbuscularmycorrhizalcolonizationalleviatesFusariumwiltinwatermelonandmodulatesthecompositionofrootexudates[J].PlantGrowthRegulation,2015,77(1):77-85.

      [7]郝文雅,沈其榮,冉煒,等.西瓜和水稻根系分泌物中糖和氨基酸對(duì)西瓜枯萎病病原菌生長的影響[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,34(3):77-82.

      [8]柴阿麗,韓云,武軍,等.基于FDA-PI雙熒光復(fù)染法的茄病鐮刀菌孢子活性檢測[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,48(14):2757-2766.

      [9]陳玉.天然纖維素超微結(jié)構(gòu)層次及不同內(nèi)切纖維素酶降解特異性的研究[D].濟(jì)南:山東大學(xué),2017.

      [10]楊鄭州,黃柳芳,謝曉娜,等.葉疫病菌侵染芒果后葉片細(xì)胞壁降解酶活性測定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2019,47(10):138-141.

      [11]PatilR,PathakV.Effectoffruitripenessinrelationtosynthesisandactivityofcellwalldegradingenzymesofmangorotpathogens[J].IndianJMycolPlantPathol,1994,24(2),156-157.

      [12]謝越,肖新,周毅,等.5種酚酸物質(zhì)對(duì)滁菊扦插幼苗生長及酶活性的影響[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,35(6):19-24.

      [13]馬燕會(huì),齊永志,趙緒生,等.自毒物質(zhì)脅迫下不同草莓品種枯萎病抗性變化的研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,35(2):93-97.

      [14]甄文超,曹克強(qiáng),代麗,等.連作草莓根系分泌物自毒作用的模擬研究[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào),2004,28(6):828-832.

      [15]趙靜,張曉東,王連春,等.三七重茬根際土壤中化感物質(zhì)的測定及其對(duì)三七根腐菌的生長作用[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2018,30(2):146-154.

      [16]SchumacherTE,EynardA,ChintalaR.Rapidcost-effectiveanalysisofmicrobialactivityinsoilsusingmodifiedfluoresceindiacetatemethod[J].EnvironmentalScienceandPollutionResearch,2015,22(6):4759-4762.

      猜你喜歡
      纖維素酶
      菌糠中產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選、鑒定及增殖條件響應(yīng)面法優(yōu)化
      添加纖維素酶對(duì)綠肥還田設(shè)施土壤酶活性及微生物種群數(shù)量的影響
      酶法提取夏秋季次品綠茶茶多酚工藝優(yōu)化
      纖維素酶系基因的克隆與序列分析
      響應(yīng)面優(yōu)化微波協(xié)同酶法提取川芎阿魏酸的工藝
      熱處理對(duì)棗果肉中纖維素酶、多聚半乳糖醛酸酶活性及底物含量的影響
      響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)纖維素酶菌株深層液體發(fā)酵的條件
      一株纖維素降解菌的篩選與酶活力測定
      響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲波提取白蒿總黃酮研究
      植物土傳疾病拮抗菌的篩選及其生防潛力評(píng)價(jià)
      上林县| 奇台县| 吴江市| 鲁山县| 鄂尔多斯市| 河津市| 崇义县| 台东县| 长丰县| 武夷山市| 宜宾县| 泊头市| 木里| 晋江市| 绵竹市| 揭西县| 古蔺县| 余姚市| 建昌县| 昌吉市| 金昌市| 汶川县| 义马市| 衡东县| 当涂县| 分宜县| 长葛市| 拉萨市| 湘潭市| 广灵县| 德阳市| 兴仁县| 阳城县| 平江县| 福海县| 东海县| 鹿邑县| 清涧县| 乌鲁木齐市| 江华| 同仁县|