孫康悅，藍(lán)智賢，李躍，劉思德

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化科(廣東省胃腸疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)(廣東廣州 510515)

冠狀病毒(coronaviruses, CoV)是一種有包膜的單正鏈RNA病毒，可感染大部分哺乳動(dòng)物，引起呼吸道、胃腸道等癥狀。CoV被分為4個(gè)屬，分別是α、β、γ和δ，β-CoV中的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome CoV, SARS-CoV)、中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome CoV, MERS-CoV)，和近期的新型冠狀病毒導(dǎo)致了全球范圍內(nèi)的暴發(fā)流行，可引起人類呼吸功能衰竭以至死亡。近十幾年來，人們對(duì)于CoV的生物學(xué)性狀、致病性進(jìn)行了大量研究，其中參與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的蛋白酶類受到了關(guān)注，被認(rèn)為是可以用于治療包括此次新型冠狀病毒在內(nèi)的CoV感染的潛在靶點(diǎn)?，F(xiàn)就靶向CoV酶的藥物作一綜述。

1 CoV的基因組結(jié)構(gòu)及其增殖過程

CoV呈球形，直徑為120～160 nm，其基因組為非分節(jié)段的單正鏈RNA，大小約為26～32 kb，是已知的基因組最大的RNA病毒?？拷蚪M5′端2/3位置的基因組包含2個(gè)大的重疊的開放讀碼框(open reading frame, ORF)，ORF1a和ORF1b主要負(fù)責(zé)編碼與病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶類等非結(jié)構(gòu)蛋白，包括復(fù)制酶聚蛋白1a(replicase polyprotein 1a,pp1a)和pp1ab，它們被木瓜樣半胱氨酸蛋白酶(papain like cysteine protease, PLpro)和3C樣絲氨酸蛋白酶(3C like serine protease, 3CLpro)裂解，產(chǎn)生具有復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能的非結(jié)構(gòu)蛋白(non structural proteins, NSPs)?？拷?′端1/3位置的基因負(fù)責(zé)編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，包括核衣殼蛋白(nucleocapsid protein, N)、包膜蛋白(membrane protein, M)、膜蛋白(envelope protein, E)和刺突糖蛋白(spik glycoprotein, S)，這些蛋白的功能包括介導(dǎo)病毒與細(xì)胞融合，病毒裝配等[1]。

病毒表面S蛋白的S1亞基與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合后導(dǎo)致S2亞基構(gòu)象變化，使病毒膜和宿主細(xì)胞膜融合，病毒得以進(jìn)入細(xì)胞[1]。CoV在細(xì)胞內(nèi)分解，RNA被釋放到胞質(zhì)中，利用宿主的核糖體將自身的ORF1a和ORF1b翻譯為pp1a和pp1ab，同時(shí)復(fù)制其RNA[2]。pp1a和pp1ab被PLpro和3CLpro裂解，產(chǎn)生NSPs，包括RNA依賴性RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase, RdRp)和解旋酶(helicase, Hel)。NSPs形成CoV復(fù)制-轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，該復(fù)合體的疏水域和源自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的限制性膜附著，形成典型的CoV復(fù)制結(jié)構(gòu)，包括雙膜囊泡和回旋膜[3]?；谝陨辖Y(jié)構(gòu)，CoV擴(kuò)增其RNA，翻譯結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白，形成裝配好的病毒并通過胞吐釋放至細(xì)胞外，完成其增殖過程并接著感染其他細(xì)胞。

2 基于CoV蛋白酶的治療藥物

CoV復(fù)制中涉及的所有主要酶和蛋白質(zhì)都是潛在的治療靶標(biāo)。SARS-CoV和MERS-CoV的PLpro具有蛋白水解、去泛素化(deubiquitylating)和去ISG化(deISGylating)的作用[4]。晶體學(xué)促進(jìn)了這些PLpro的表征和PLpro抑制劑的鑒定[5]。人們已發(fā)現(xiàn)許多不同類別的SARS-CoV PLpro抑制劑，包括小分子抑制劑、硫嘌呤化合物、天然物質(zhì)、鋅離子和鋅結(jié)合物抑制劑以及萘抑制劑[6]。但是，其中一些藥物僅抑制PLpro的酶活性而不抑制病毒復(fù)制；且沒有一項(xiàng)抑制劑在動(dòng)物或人體研究中得到驗(yàn)證[6-7]。此外，由于不同CoV的PLpro之間有結(jié)構(gòu)差異，大多數(shù)PLpro抑制劑都是窄譜活性的。例如，大多數(shù)SARS-CoV的PLpro抑制劑對(duì)MERS-CoV無作用[8]。

3CLpro是另一種主要的CoV蛋白酶，可在病毒復(fù)制過程中裂解較大的復(fù)制酶聚蛋白。饒子和院士團(tuán)隊(duì)已經(jīng)解析了新型冠狀病毒3CLpro的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 6LU7)，這為篩選相關(guān)抑制劑提供了重要幫助。SARS-CoV 3CLpro可以被多種蛋白酶抑制劑靶向，包括鋅或汞結(jié)合物、酸酐、苯并三唑、N-苯基-2-乙酰胺、聯(lián)苯砜、嘧啶酮和吡唑類似物等[9]。因?yàn)镃oV的3CLpro在這些抑制劑所識(shí)別的區(qū)域?yàn)檫M(jìn)化保守的，一些3CLpro抑制劑在體外實(shí)驗(yàn)中呈廣譜活性[10]。在這些抑制劑中，已上市的有洛匹那韋(lopinavir)，這是一種用于治療人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染的蛋白酶抑制劑，通常以利托那韋(ritonavir)增強(qiáng)形式銷售。洛匹那韋和(或)洛匹那韋-利托那韋在體外以及在MERS-CoV感染的非人類靈長類動(dòng)物的試驗(yàn)中均具有抗CoV活性[11-12]。近期，有一項(xiàng)關(guān)于洛匹那韋-利托那韋聯(lián)合β1b干擾素治療MERS的兩階段隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)正在展開，其療效和是否會(huì)產(chǎn)生耐藥性有待進(jìn)一步觀察[13]。

RdRp是CoV復(fù)制-轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的重要組成部分，參與基因組和亞基因組RNA的合成。利巴韋林(ribavirin)是一種具有廣譜抗病毒活性的鳥嘌呤類似物，已被用于治療嚴(yán)重的呼吸道合胞病毒感染，丙肝病毒感染和病毒性出血熱。高劑量的利巴韋林在體外實(shí)驗(yàn)，以及感染了MERS-CoV的獼猴中均表現(xiàn)出一定的抗病毒活性，但在數(shù)量有限的MERS患者中沒有明顯的生存獲益[14-15]。此外，與大劑量利巴韋林相關(guān)的嚴(yán)重不良反應(yīng)限制了其在嚴(yán)重CoV感染患者中的臨床應(yīng)用[16]。一種新型的腺苷類似物BCX4430(Immucillin-A)是非專性RNA鏈終止劑，可抑制多種RNA病毒的RNA聚合酶，包括諸如SARS-CoV和MERS-CoV在內(nèi)的CoV以及諸如埃博拉病毒和馬爾堡病毒等絲狀病毒[17]。現(xiàn)有的核苷類似物，例如阿昔洛韋(acyclovir)，可以通過加入柔韌性修飾劑進(jìn)行修飾，柔韌性修飾劑可增強(qiáng)核苷類似物的親和力，并可克服由結(jié)合位點(diǎn)突變引起的抗藥性[18]。近期《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》在線發(fā)表了美國首例確診新型冠狀病毒肺炎患者的診療過程，其中還未上市的核苷類似物前藥remdesivir顯示了一定的療效，它原計(jì)劃用于治療埃博拉病毒感染[19]；隨后，中國學(xué)者進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其在體外有抗病毒作用[20]。除核苷類似物外，針對(duì)SARS-CoV RdRp的siRNA分子已在體外實(shí)驗(yàn)顯示出對(duì)于病毒的抑制作用[21]。但其距在人類中應(yīng)用還有很長距離。

在CoV的復(fù)制周期中，Hel在三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)依賴性反應(yīng)中催化雙鏈寡核苷酸解鏈成單鏈。因不同CoV的Hel高度同源，Hel抑制劑是十分具有吸引力的藥物?；谄渥饔脵C(jī)制，Hel抑制劑可大致分為兩類。一類包括果膠苷和5-羥色酮衍生物，它們抑制SARS-CoV Hel的解旋和ATP酶活性，從而抑制病毒的體外復(fù)制[22]。但是，這些化合物對(duì)細(xì)胞ATP酶或激酶的抑制作用所產(chǎn)生的毒性限制了其在人類中的應(yīng)用。另一類是選擇性抑制CoV Hel的解旋活性但不抑制其ATP酶活性的化合物。比如SSYA10-001，它是一種三唑類藥物，可抑制多種CoV，包括SARS-CoV、MERS-CoV和小鼠肝炎病毒[23]。

3 其他

除靶向病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄相關(guān)酶外，針對(duì)病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合過程的人源或人源化單克隆抗體(monoclonal antibodies, mAb)、抑制劑等也是有潛力的抗病毒藥物。這些mAb可結(jié)合S蛋白S1亞基的受體結(jié)合域(receptor-binding domain, RBD)，或作用于S2亞基，分別阻止病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合和中斷病毒膜與細(xì)胞膜融合[24]。研究顯示新型冠狀病毒與SARS-CoV一樣，與細(xì)胞融合需借助細(xì)胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin converting enzyme 2, ACE2)，并需要跨膜絲氨酸蛋白酶TMPRSS2輔助[25]；因此ACE2和TMPRSS2的抑制劑可發(fā)揮抗病毒作用[26]。病毒的其他結(jié)構(gòu)蛋白E、N、M和輔助蛋白在病毒裝配及抑制宿主免疫反應(yīng)中也發(fā)揮了作用，針對(duì)這些蛋白研究人員也研發(fā)了一些有抑制病毒作用的干擾RNA和siRNA[27-28]。另外，體外實(shí)驗(yàn)證明抗瘧疾老藥氯喹也有抗新型冠狀病毒的作用[20]。

CoV作為單鏈RNA病毒比雙鏈病毒具有更豐富的生物多樣性，從2002年的SARS，2012年的MERS到近期出現(xiàn)的新型冠狀病毒，提示研究人員在CoV的藥物研發(fā)中，應(yīng)格外著重于抗β-CoV或抗RNA病毒的廣譜藥物，并抵御病毒的耐藥性。其實(shí)現(xiàn)方式可能是：(1)單一的藥物，如非專性核苷類似物，或針對(duì)進(jìn)化保守的蛋白酶的抑制劑等；(2)兩種及以上靶向病毒結(jié)構(gòu)蛋白不同表位的mAb或靶向病毒蛋白酶的核甘類似物(及其前藥)與mAb聯(lián)合使用。以上藥物在體外和(或)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中顯示出一定的抗病毒作用后，其應(yīng)用于人類的療效和安全性還需進(jìn)一步研究。